circ_2157及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断试剂.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910066559.7 (22)申请日 2019.01.24 (71)申请人 中南大学 地址 410083 湖南省长沙市岳麓区麓山南 路932号 (72)发明人 熊炜曾朝阳郭灿王忆安 李桂源李小玲王裕民莫勇真 周艳宏李征龚朝建张姗姗 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所(普 通合伙) 43114 代理人 袁靖 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 circ_2157及其在制备鼻咽癌。

2、诊断制剂中的 应用和诊断试剂 (57)摘要 本发明属于肿瘤分子生物学技术领域， 具体 涉及一种环状RNAcirc_2157及其在制备鼻咽癌 诊断制剂中的应用和相应的制剂。 本发明收集多 例鼻咽癌组织和正常炎性鼻咽上皮组织， 利用 qRT-PCR技术检测了circ_2157的表达情况。 结果 显示， 与12例正常炎性鼻咽上皮组织相比， circ_ 2157在29例鼻咽癌组织中明显高表达， 在鼻咽癌 组中circ_2157表达水平大约是正常炎性鼻咽上 皮的5倍， 两组数据的差异具有统计学意义(P 0.0279)。 因此， circRNAcirc_2157在鼻咽癌组 织中高表达， circ_2157。

3、对鼻咽癌的发生发展可 能具有重要的生物学功能， 可以作为鼻咽癌诊断 分子标记物。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 附图9页 CN 109762818 A 2019.05.17 CN 109762818 A 1.一种环状RNA circ_2157， 序列如SEQ ID NO.1所示。 2.检测权利要求1所述的环状RNA circ_2157的试剂在制备诊断鼻咽癌工具上的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的检测权利要求1所述的环状RNA circ_2157的试剂为PCR试剂。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的检测权利要求1所述的环状RNA cir。

4、c_2157的试剂为PCR实时定量检测试剂。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的PCR试剂中的引物为： 上游引物： 5 -GTCGGAGCTTTATTGGGCC-3 ； 下游引物： 5 -ATAGCCTTTCCACCGAACCA-3 。 6.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的PCR试剂中的 -actin内参引物为： 上游引物： 5 -TCACCAACTGGGACGACATG-3 下游引物： 5 -GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3 。 7.一种诊断鼻咽癌的制剂， 其特征在于， 包含检测权利要求1所述的环状RNA circ_ 2157的试剂。 8.根据。

5、权利要求7所述的制剂， 其特征在于， 所述的检测权利要求1所述的环状RNA circ_2157的试剂为PCR检测试剂。 9.根据权利要求7所述的制剂， 其特征在于， 所述的PCR检测试剂中的引物为： 上游引物： 5 -GTCGGAGCTTTATTGGGCC-3 ； 下游引物： 5 -ATAGCCTTTCCACCGAACCA-3 。 10.根据权利要求7所述的制剂， 其特征在于， 所述的PCR检测试剂中的 -actin内参引 物为： 上游引物： 5 -TCACCAACTGGGACGACATG-3 下游引物： 5 -GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3 。 权利要求书 1/1 页 2 C。

6、N 109762818 A 2 circ_2157及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断试剂 技术领域 0001 本发明属于肿瘤分子生物学技术领域， 具体涉及一种环状RNA circ_2157及其在 制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和相应的制剂。 背景技术 0002 目前环状RNA(Circular RNA)是个研究热点， circRNA主要来源于蛋白质编码基因 的外显子区， 也可以由内含子区、 UTR区、 基因间区、 非编码RNA位点及已知转录物的反义位 点形成。 CircRNA是由前体mRNA(precursor messenger RNA,pre-mRNA)反向拼接而形成的 一类不具有5 末端。

7、帽子和3 末端poly(A)尾巴并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。 0003 CircRNA形成过程可以分为两大类， 即外显子环化(exon circularization)和内 含子环化(intron circularization)两大机制。 Jeck等提出外显子来源的circRNA(exonic circRNA,ecircRNA)可以分为套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子 配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种形成方式， 套索驱动环化 是外显子3 端作为剪接供体(splice 。

8、donor)攻击5 端剪接受体(splice receptor),Alu区 共价结合而形成套索结构， 套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circRNA； 内含子配对 驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后， 剪除内含子形成circRNA。 其实内含 子本身也可以环化， 可以形成内含子来源circRNA(circular intronic RNA,ciRNA)。 CircRNA是由前体mRNA反向拼接而形成的一类不具有5 末端帽子和3 末端poly(A)尾巴并 以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码RNA分子。 有着高度的稳定性、 保守性、 特异性， 并且含量高的特点。 0004 Ci。

9、rcRNA最早在1976年于RNA病毒中首次发现， 随后Hsu MT等人使用电子显微镜技 术在猴的肾细胞质中发现了circRNA的存在。 在1996年， circRNA在人类细胞中被发现， 随着 RNA-seq新一代测序技术的发展， 近年来越来越多的circRNA被发现， 目前为止已知的 circRNA数目已经达到三万多个。 CircRNA也不再被认为是错误的RNA转录本， 而是作为非编 码RNA研究中的耀眼之星冉冉升起。 筛选和验证更多的新型circRNA作为肿瘤诊断和预后的 生物标志物及其应用， 并能尽早在专利领域得到好的保护， 能显著提升我国在该技术领域 的国际竞争力。 0005 鼻咽癌。

10、(nasopharyngeal carcinoma， NPC)属于头颈部肿瘤， 起源于鼻咽部上皮组 织。 一般在鼻咽部的后外侧隐窝(罗森缪勒窝， Fossa of Rosenmller)处发病， 此处的鼻咽 癌细胞易侵袭邻近的组织和器官。 由于鼻咽癌的发生发展是由积累的家族遗传和体细胞遗 传突变及表观遗传学突变导致的多阶段复杂基因调控过程， 涉及到原癌基因和抑癌基因的 激活和沉默、 及ncRNA参与的表观遗传学调控等等。 所以鼻咽癌发生发展的具体分子机制尚 不明确， 而且由于肿瘤异质性和个体差异性， 传统的放疗联合化疗的疗效不显著。 因此通过 circRNA探究其与鼻咽癌发生发展机制， 进一步。

11、为鼻咽癌的诊断， 以及控制鼻咽癌增殖、 侵 袭和转移将是研究的热点。 0006 我们在5-8F细胞的RNA-seq中检测到长度667bp的circ_2157， 通过试验发现该环 说明书 1/10 页 3 CN 109762818 A 3 状RNA与鼻咽癌的发生发展存在关联， 有可能作为鼻咽癌诊断标记物， 以及治疗的靶点。 发明内容 0007 本发明从5-8F细胞的RNA-seq中发现了大小667bp的circ_2157， 并发现了它与鼻 咽癌之间存在的关系， 有可能作为鼻咽癌诊断标记物和治疗的靶点。 0008 本发明的第一个目的是提供一种新的环状RNA circ_2157， 序列如SEQ ID。

12、 NO.1所 示。 0009 本发明的第二个目的是提供一种检测所述的环状RNA circ_2157的试剂在制备诊 断或预后鼻咽癌工具上的应用。 0010 进一步的， 所述的检测环状RNA circ_2157的试剂为PCR试剂。 0011 进一步的， 所述的检测环状RNA circ_2157的试剂为PCR实时定量检测试剂。 0012 进一步的， 所述的PCR试剂中的引物为： 0013 上游引物： 5 -GTCGGAGCTTTATTGGGCC-3 ； 0014 下游引物： 5 -ATAGCCTTTCCACCGAACCA-3 。 0015 进一步的， 所述的PCR试剂中的 -actin内参引物为： 。

13、0016 上游引物： 5 -TCACCAACTGGGACGACATG-3 ； 0017 下游引物： 5 -GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3 。 0018 本发明的第三个目的是提供一种诊断鼻咽癌的制剂， 包含检测所述的环状RNA circ_2157的试剂。 0019 进一步的， 所述的检测环状RNA circ_2157的试剂为PCR检测试剂。 0020 进一步的， 所述的PCR检测试剂中的引物为： 0021 上游引物： 5 -GTCGGAGCTTTATTGGGCC-3 ； 0022 下游引物： 5 -ATAGCCTTTCCACCGAACCA-3 。 0023 进一步的， 所述的PC。

14、R检测试剂中的 -actin内参引物为： 0024 上游引物： 5 -TCACCAACTGGGACGACATG-3 0025 下游引物： 5 -GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3 。 0026 本发明收集多例鼻咽癌组织和正常炎性鼻咽上皮组织， 利用qRT-PCR技术检测了 circ_2157的表达情况。 结果显示， 与12例正常炎性鼻咽上皮组织相比， circ_2157在29例鼻 咽癌组织中明显高表达， 在鼻咽癌组中circ_2157表达水平大约是正常炎性鼻咽上皮的5 倍， 两组数据的差异具有统计学意义(P0.0279)。 因此， circRNA circ_2157在鼻咽癌组织 中。

15、高表达， circ_2157对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能， 可以作为鼻咽癌诊 断分子标记物。 附图说明 0027 图1为qRT-RCR检测鼻咽癌组织和非肿瘤鼻炎上皮组织中circ_2157的表达水平； 0028 circ_2157的表达水平分析以 -actin作为参照将非肿瘤鼻咽上皮组织标准化为 1， N为非肿瘤鼻咽上皮组织， 样本数为12； T为鼻咽癌组织， 样本数为29， n为样本数量， 均采 用t检验， P0.05具有统计学意义。 0029 图2为过表达载体图谱。 说明书 2/10 页 4 CN 109762818 A 4 0030 图3为qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系中。

16、circ_2157过表达效果； 0031 qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2中circ_2157过表达效果以 - actin作为参照将pcDNA3.1(+)组标准化为1， *P0.05,*P0.01,*P0.001。 0032 图4为qRT-PCR技术检测鼻咽癌细胞系中circ_2157siRNA的沉默效率； 0033 qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2中circ_2157siRNA的沉默效率； circ_2157表达水平分析以 -actin作为参照， 将NCsiRNA组标准化为1， ns代表没有意义， *P 0.05,*P0.01,。

17、*P0.001。 0034 图5为体外过表达circ_2157对鼻咽癌细胞增殖的影响； 0035 a-c.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2中circ_2157过表达效率； d- f.对上述细胞进行MTT实验检测细胞增殖能力， circ_2157表达水平分析以 -actin作为参 照， 将pcDNA3.1(+)组标准化为1， ns代表没有意义， *P0.05,*P0.01,*P0.001。 0036 图6为体外沉默circ_2157对鼻咽癌细胞增殖的影响； 0037 a-c.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2中circ_2157过表达。

18、效率； d- f.对上述细胞进行MTT实验检测细胞增殖能力， circ_2157表达水平分析以 -actin作为参 照， 将pcDNA3.1(+)组标准化为1， ns代表没有意义， *P0.05,*P0.01,*P0.001。 0038 图7为qRT-PCR检测划痕实验细胞中circ_2157过表达效率； 0039 a-c.划痕实验所用鼻咽癌细胞株HONE1、 HNE2和CNE2转染效率用qRT-PCR实验检 测， circ_2157表达水平分析以 -actin作为参照， 将pcDNA3.1(+)组标准化为1， *P0.05,* P0.01,*P0.001。 0040 图8为过表达circ_2。

19、157对鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2划痕愈合实验的影响； 0041 a-c.鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2转染pcDNA3.1(+)空载、 pcDNA3.1(+)/circ_ 2157， 待细胞密度达到100后划痕， 于第0,12,24小时观察拍照。 0042 图9为过表达circ_2157的鼻咽癌HONE1、 HNE2和CNE2细胞划痕实验统计图； 0043 a-c.每组随机选取6个视野测量划痕宽度,将0小时的划痕宽度标准化为1， 作统计 图； 每个实验重复三次,采用Students t-test方法统计。 *P0.05,*P0.01,*P0.001。 0044 。

20、图10为qRT-PCR检测划痕实验细胞中circ_2157干扰效率； ； 0045 a-c.划痕实验所用鼻咽癌细胞株HONE1、 HNE2和CNE2转染效率用qRT-PCR实验检 测， circ_2157表达水平分析以 -actin作为参照， 将NC siRNA组标准化为1， *P0.05,*P 0.01,*P0.001。 0046 图11为干扰circ_2157对鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2划痕愈合实验的影响； 0047 a-c.鼻咽癌HONE1、 HNE2和CNE2细胞转染NC siRNA/circ_2157siRNA， 待细胞密度 达到100后划痕， 于第0,12,24小时。

21、观察拍照。 0048 图12为干扰circ_2157的鼻咽癌HONE1、 HNE2和CNE2细胞划痕实验统计图 0049 a-c.每组随机选取6个视野测量划痕宽度,将0小时的划痕宽度标准化为1， 作统计 图； 每个实验重复三次,采用Students t-test方法统计。 *P0.05,*P0.01,*P0.001。 0050 图13为qRT-PCR检测Transwell小室基质胶侵袭实验中circ_2157的过表达效率； 0051 a-c.Transwell小室基质胶侵袭实验所用鼻咽癌细胞株HONE1、 HNE2和CNE2转染效 率用qRT-PCR实验检测， circ_2157表达水平分析以。

22、 -actin作为参照， 将pcDNA3.1(+)组标 准化为1， *P0.05,*P0.01,*P0.001。 说明书 3/10 页 5 CN 109762818 A 5 0052 图14为过表达circ_2157对鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2侵袭能力的影响； 0053 分别过表达circ_2157的HONE1、 HNE2和CNE2以及各自的对照组细胞进行 Transwell小室基质胶侵袭实验。 0054 图15为过表达circ_2157的Transwell小室基质胶侵袭实验统计图； 0055 每组随机选取3个细胞视野进行细胞计数， 作统计图； 每个实验重复三次， 采用 St。

23、udents t-test方法统计； 以 -actin作为参照， 将pcDNA3.1(+)组标准化为1， *P 0.05,*P0.01,*P0.001。 0056 图16为qRT-PCR检测Transwell小室基质胶侵袭实验中circ_2157的干扰效率； 0057 a-c.Transwell小室基质胶侵袭实验所用鼻咽癌细胞株HONE1、 HNE2和CNE2转染效 率用qRT-PCR实验检测， circ_2157表达水平分析以 -actin作为参照， 将NC组标准化为1， *P 0.05,*P0.01,*P0.001。 0058 图17为干扰circ_2157对鼻咽癌细胞系HONE1、 HN。

24、E2和CNE2侵袭能力的影响； 0059 分别干扰circ_2157的HONE1、 HNE2和CNE2以及各自的对照组细胞进行Transwell 小室基质胶侵袭实验。 0060 图18为干扰circ_2157的Transwell小室基质胶侵袭实验统计图； 0061 每组随机选取3个细胞视野进行细胞计数， 作统计图； 每个实验重复三次， 采用 Students t-test方法统计； 以 -actin作为参照， 将NC组标准化为1， *P0.05,*P 0.01,*P0.001。 具体实施方式 0062 以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明， 而非限制本发明。 0063 本发明所用的正常炎性。

25、鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织标本均来自中南大学附属肿 瘤医院治疗的初诊患者， 未经放化疗和手术治疗。 新鲜鼻咽癌组织采集好后， 立即放入液氮 罐中保存,随后搜集所有病人的相关临床资料所有实验用组织样本采集均获得中南大学伦 理委员会授权和病人同意。 0064 本发明所用HONE1、 HNE2和CNE2三株鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子 遗传实验室所保存。 细胞培养条件为： 含10胎牛血清(FBS)和1双抗(青霉素、 链霉素)的 RPMI1640液体培养基， 37、 95湿度、 5CO2浓度的恒温培养箱内贴壁生长。 0065 本发明环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同， 其是根据拼接位点。

26、两侧设计， 在Primer3.0网站上在线设计， 最终的引物合成工作， 通过发送电子邮件订货， 委托擎科生 物公司长沙合成部合成。 0066 (1) -actin 0067 上游引物： 5 -TCACCAACTGGGACGACATG-3 ， 序列如SEQ ID NO.2所示； 0068 下游引物： 5 -GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3 ， 序列如SEQ ID NO.3所示。 0069 (2)环状RNA circ_2157实时定量PCR引物 0070 上游引物： 5 -GTCGGAGCTTTATTGGGCC-3 ， 序列如SEQ ID NO.4所示； 0071 下游引物： 5 -。

27、ATAGCCTTTCCACCGAACCA-3 ， 序列如SEQ ID NO.5所示； 0072 (3)扩增circ_2157全长引物 0073 上游引物： 5 -CCATCGATGGGTTGAAAGGATTGTTGACAA-3 ， 序列如SEQ ID NO.6所示； 说明书 4/10 页 6 CN 109762818 A 6 0074 下游引物： 5 -TCCCCGCGGGGACTTTCCCGTTAACAGCTAAG-3 ， 序列如SEQ ID NO.7所 示。 0075 本发明为了特定的敲低环状RNA而不影响它的线性基因表达， 根据拼接位点设计 siRNA， 靶向沉默circ_2157。 0。

28、076 circ_2157siRNA序列： 0077 正义链(5-3)CGGGAAAGGUUGAAAGGAUUU， 序列如SEQ ID NO.8所示； 0078 反义链(5-3)AUCCUUUCAACCUUUCCCGUU， 序列如SEQ ID NO.9所示。 0079 阴性对照： 0080 正义链(5-3)UUCUCCGAACGUGUCACGUUU， 序列如SEQ ID NO.10所示； 0081 反义链(5-3)ACGUGACACGUUCGGAGAAUU， 序列如SEQ ID NO.11所示。 0082 本发明试验结果均采用统计学分析： t检验用来评价两组之间的差异。 卡方检验用 来评估基因。

29、表达或不表达在性别、 年龄、 肿瘤阶段、 临床分期和转移情况等临床参数方面的 差异。 生存分析采用KaplanMeier方面检验。 p1h)； 0100 (6)4， 12000rpm/30min， 弃上清； 0101 (7)加入75乙醇(预冷)1ml， 混匀； 0102 (8)4， 7600rpm/5min； 弃上清， 重复步骤8,9； 0103 (9)闪离10s， 尽量吸尽上清， 倒置干燥10分钟； 0104 (10)加入20-30 l DEPC， 测RNA浓度和OD值。 0105 4、 基因circRNA逆转录PCR反应 0106 (依据abm公司5All-In-OneRTMasterMi。

30、x(withAccuRTGenomicDNARemovalKit) (#G492)的实验说明手册操作， ) 0107 配置如下反应体系： 0108 说明书 6/10 页 8 CN 109762818 A 8 0109 逆转录PCR上机反应程序如下： 0110 25 10min， 0111 42 15min， 0112 85 5min。 0113 待反应结束后， -20保存产物备用。 0114 5、 实时荧光定量PCR 0115 先将逆转录反应产物稀释5倍， 然后依据abm公司EvaGreen qPCR MasterMix (MasterMix-R)的实验说明手册操作， 配置如下反应体系： 01。

31、16 0117 实时荧光定量PCR机上反应程序如下： (Cycle39) 0118 0119 Bio-RadIQ5实时荧光定量PCR仪进行上述反应完成后， 与内参基因 -actin标化, 以2- CT值显示目标基因的相对表达量， 判定基因的表达差异。 采用unpaired t-test检验 计算P值。 0120 结果： 收集多例鼻咽癌组织和正常炎性鼻咽上皮组织， 利用qRT-PCR技术检测了 circ_2157的表达情况。 结果显示， 与12例正常炎性鼻咽上皮组织相比， circ_2157在29例鼻 咽癌组织中明显高表达， 在鼻咽癌组中circ_2157表达水平大约是正常炎性鼻咽上皮的5 倍，。

32、 两组数据的差异具有统计学意义(P0.0279)， 结果见图1。 因此， circRNA circ_2157在 鼻咽癌组织中高表达， circ_2157对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能。 0121 实施例2： 在鼻咽癌细胞系中circ_2157过表达效果检测 0122 首先我们选择酶切位点， 将circ_2157全长序列放入NEB cutter 2.0在线网站分 析， 显示ClaI和SacII酶切位点为circ_2157全长序列中不存在的位点， 同时在pcDNA3.1质 说明书 7/10 页 9 CN 109762818 A 9 粒载体(购于Invitrogene公司)中单一存在的D。

33、NA限制性内切酶。 据此构建过表达载体； 图2 为绘制的过表达载体图谱。 0123 为了检测circ_2157的成环效率， 首先我们将构建的pcDNA3.1/circ_2157真核过 表达载体在鼻咽癌细胞中进行表达。 把生长状况良好的第三、 四代鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2 和CNE2种到12孔板中， 待细胞融合度达到60-80时， 用脂质体法lipofectamine 3000把 无内毒素质粒pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1/circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞 HONE1、 HNE2和CNE2， 继续培养到48小时后。 收集细胞， 利用实时荧光定量PCR技术检测cir。

34、c_ 2157的表达水平及成环效率。 qPCR结果显示， 与pcDNA3.1空质粒组细胞相比， 转pcDNA3.1/ circ_2157过表达质粒组的细胞中circ_2157的表达水平显著升高， 且在HONE1、 HNE2和CNE2 细胞系中其表达倍数均在20倍以上， 见图3， 结果具有统计学意义。 0124 实施例3： 在鼻咽癌细胞系中沉默circ_2157表达的效果检测 0125 根据拼接位点设计了circ_2157的SI序列， siRNA即一类长度为21-25个核苷酸， 能 与同源RNA互补结合， 特异性降解目的RNA， 从而抑制其表达的双链RNA分子。 目前， siRNA已 发展成为基。

35、因功能研究的重要工具。 为了探究circ_2157在肿瘤发生发展中的作用， 我们根 据circ_2157的拼接位点设计了siRNA， 利用Hiperfect试剂将siRNA和siNC(空白对照)瞬时 转染到HONE1、 HNE2和CNE2细胞系中沉默circ_2157的表达。 转染后继续培养48小时收集细 胞， 利用实时荧光定量PCR技术检测circ_2157的表达水平以检测siRNA的转染效率， 确认此 次转染效率降低到50以下， 结果见图4。 0126 实施例4： 体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞增殖 0127 我们首先用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒。

36、pcDNA3.1和pcDNA3.1/ circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2， 继续培养48小时后， 利用 qRT-PCR确保circ_2157在鼻咽癌细胞系中表达水平升高后， 进行MTT实验， 验证其对细胞增 殖的影响。 基于第一至第五天的检测结果， 我们并发现pcDNA3.1空质粒组和pcDNA3.1/ circ_2157过表达质粒组之间的细胞增殖存在明显差异， 过表达circ_2157对体外培养条件 下的鼻咽癌细胞增殖有促进作用。 (结果见图5) 0128 实施例5： 体外沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的增殖 0129 利用Hiperfect。

37、试剂将siRNA和siNC(空白对照)瞬时转染到HONE1、 HNE2和CNE2细 胞系中沉默circ_2157的表达。 转染后继续培养48小时收集细胞， 利用实时荧光定量PCR技 术检测circ_2157的表达水平以检测siRNA的转染效率。 结果显示， siRNA具有良好的沉默效 果。 在确保circ_2157被干扰掉后， 我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和 CNE2中进行MTT实验， 验证其对细胞增殖的影响。 基于第一至第五天的检测结果， 相对于NC 组， siRNA组细胞的增殖速度明显减慢， 即沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的增殖。 通过正反 两。

38、个方向的验证， 我们可以说circ_2157对体外培养条件下的鼻咽癌细胞增殖有促进作用。 (结果见图6) 0130 实施例6： 细胞划痕愈合迁移实验： 0131 (1)照细胞台： 1000 l/10 l Tip头、 高温高压灭菌的D-Hank s， 直尺、 1000 l/10 l 移液枪、 marker笔等， 用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟； 0132 (2)待细胞长至5070左右分别转染siRNA和NC组或者转染质粒； 0133 (3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕： 将10 l枪头比着直尺垂直于6孔板底 说明书 8/10 页 10 CN 109762818 A 10 部干。

39、脆快速进行十字或井字划痕， 不要倾斜， 力度大小一致， 以确保划痕宽带尽可能一样； 0134 (4)吸弃掉培养液， 用D-hanks轻轻洗涤3次， 尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细 胞； 0135 (5)加入1双抗2胎牛血清的1640培养基； 0136 (6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度， 记为0h； 0137 (7)将6孔板放回培养箱培养， 间隔12小时取出， 拍摄0h时所拍图片的位置， 记为 12h； 0138 (8)间隔24h时再拍相同位置， 直到划痕愈合， 整理所有的图片， 并进行统计分析。 0139 体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞的迁移 0140 在确定环状RNAcirc。

40、_2157对鼻咽癌细胞的增殖能力有促进作用后， 我们又在鼻咽 癌细胞系中进行了划痕实验， 以验证circ_2157对鼻咽癌细胞系的迁移有没有影响。 利用脂 质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/has_circ_2157过表达 载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2， 继续培养到48小时后。 收集细胞， 利用实时荧 光定量PCR技术检测circ_2157的表达水平及成环效率。 在确定了circ_2157过表达质粒的 过表达良好效果后， 我们在鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2进行了细胞划痕愈合实验。 划 痕愈合实验。

41、在这些细胞中的多个时间点(HONE1为0h、 12h、 24h； HNE2为0h、 12h、 24h； CNE2为 0h、 12h、 24h)均证实： 相对于空载pcDNA3.1(+)质粒组， pcDNA3.1/circ_2157过表达质粒组 细胞的迁移能力明显增强。 划痕宽度差异较大,且具有统计学意义。 以上结果显示,过表达 鼻咽癌细胞系中circ_2157的表达,能够促进鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2在体外的迁移 能力。 (结果见图7， 8,9) 0141 体外沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的迁移 0142 利用Hiperfect试剂将siRNA和NC瞬时转染到HONE1。

42、、 HNE2和CNE2细胞系中沉默 circ_2157的表达。 转染后继续培养48小时收集细胞， 利用实时荧光定量PCR技术检测circ_ 2157的表达水平以检测siRNA的转染效率。 结果显示， siRNA具有良好的沉默效果。 在确保 circ_2157被干扰掉后， 我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2中进行 划痕实验， 验证其对细胞迁移的影响。 划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点(HONE1为 0h、 12h、 24h； HNE2为0h、 12h、 24h； CNE2为0h、 12h、 24h)均证实： 相对于NC组， siRNA组细胞的 迁移能。

43、力明显减弱。 划痕宽度差异明显,且具有统计学意义。 以上结果显示,沉默鼻咽癌细 胞系中circ_2157的表达,能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2在体外的迁移能力。 通过 正反两个方向验证证明， circ_2157可以促进鼻咽癌细胞的迁移。 (结果见图10,11,12) 0143 实施例7： 细胞transwell侵袭实验： 0144 (1)基质胶准备： 提前一天把冻存于-20的BDMatrigel胶置于4冰箱融化成液 态， 把释胶用的tip头、 EP管置于-20过夜， 这样第二天操作时Matrigel胶在铺胶时不会过 快凝固； 0145 (2)基质胶稀释： BDMatrige。

44、l胶： 无血清培基1:8， 即20 l基质胶加160 l 1640培 基轻吹混匀； 0146 (3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100 l， 再沿边吸出80 l， 依次铺好放入 37培养箱里孵育2-3小时， 当看到铺胶层为白色时， 表明液体Matrigel胶已呈固态； 0147 (4)消化转染后的实验细胞， 用无血清培基洗2遍， 然后使用无血清的培基重悬细 说明书 9/10 页 11 CN 109762818 A 11 胞， 进行细胞计数， 调整细胞浓度为每200 l中2,0000个细胞； 0148 (5)向下层小室添加800 l含有20FBS的1640培养基， 放入小室时将24。

45、孔板倾斜 45 角， 以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡； 0149 (6)每室加200 l统一计数好的细胞悬液到transwell上室内， 将24孔板放回37 培养箱中， 根据细胞状态和细胞侵袭速度， 孵育约2448小时。 0150 (7)取出24孔板， 用PBS或者D-hanks洗两遍， 4多聚甲醛浸洗10分钟， 用清水洗3 遍。 0151 (8)染色： 用0.1的结晶紫滴加到transwell小室的底部， 室温安静放置5-10min， 用PBS清洗2-3遍， 用棉签小心擦掉小室上面的基质胶； 0152 (9)在24孔板中加入蒸馏水800 l， transwell上室中加入蒸馏水。

46、约200 l， 然后在 倒置显微镜下， 进行观测， 不同视野拍照， 用image J软件进行计数和统计学分析差异的显 著性。 0153 体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞的侵袭 0154 我们在鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2进行了Transwell小室基质胶侵袭实验， 以观察过表达circ_2157对细胞侵袭能力的影响。 我们同样利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞 HONE1、 HNE2和CNE2， 继续培养到48小时后。 收集细胞， 利用实时荧光定量PCR技术检。

47、测circ_ 2157的表达水平及成环效率。 在确定了circ_2157过表达质粒的过表达良好效果后， 我们将 细胞接种到铺基质胶的Transwell小室中， 发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的 数目明显比空载组多， 且两株细胞系结果的趋势一致。 随机拍摄3张照片并记录细胞数目， 每一细胞系中两组别数据间均有明显差异， 且具有统计学意义。 以上结果表明， 过表达鼻咽 癌细胞系中circ_2157的表达,能够促进鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2在体外的侵袭能力。 (结果见图13,14,15) 0155 体外沉默circ_2157的表达影响鼻咽癌的侵袭 0156 为了探究沉默cir。

48、c_2157后是否能够逆转过表达circ_2157所带来的表型改变,我 们又在三株细胞系中进行了Transwell小室基质胶侵袭实验， 利用Hiperfect试剂将circ_ 2157siRNA和NC瞬时转染到HONE1、 HNE2和CNE2细胞系中沉默circ_2157的表达。 转染后继续 培养48小时收集细胞， 利用实时荧光定量PCR技术检测circ_2157的表达水平以检测siRNA 的转染效率。 结果显示， circ_2157siRNA具有良好的沉默效果。 在确保circ_2157被干扰掉 后， 我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系HONE1、 HNE2和CNE2中进行Tran。

49、swell小室基质 胶侵袭实验， 结果显示， siRNA组可在Transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少 于NC组， 且两株细胞系结果的趋势一致。 随机拍摄6张照片并记录细胞数目， 每一细胞系中 两组别数据间均有明显差异， 且具有统计学意义。 以上结果表明， 沉默鼻咽癌细胞系中 circ_2157的表达,能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、 HNE2和CNE2在体外的侵袭能力。 通过正反两 个方向证明， 环状RNAcirc_2157能够促进鼻咽癌细胞的侵袭。 (结果见图16,17,18) 说明书 10/10 页 12 CN 109762818 A 12 序列表 中南大学 circ_215。

50、7及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断试剂 11 SIPOSequenceListing 1.0 1 667 RNA 智人(Homo sapiens) 1 cugccagcca gaaguucagg aagaacacag cuccaucucu cuccagccgg aagaacaugg 60 accuagcgaa gucagguauc aagauccucg ugccuaaaag ccccguuaag agcaggaccg 120 caguggacgg cuuucagagc gagagcccug agaaacugga ccccgucgag cagggucagg 180 aggacacagu g。