与油菜角果数关联的分子标记引物及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910214821.8 (22)申请日 2019.03.20 (71)申请人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430000 湖北省武汉市武昌区徐东二 路2号 (72)发明人 王汉中师家勤李书宇王新发 刘贵华詹杰鹏 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 龚莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与油菜角果数关联的分子标记引物及 应用 (57)摘要 本发明公。

2、开了一种与油菜角果数关联的分 子标记及应用。 本发明获得了一个与油菜角果数 显著关联的SNP （单核苷酸多态性） 标记， 位于油 菜A03染色体上第19,267,907个碱基位置， 可解 释7.6的表型变异， 根据该分子标记设计的引 物为snpA03-1F： ATTTTCATTGATAAACATACCGAATT， snpA03-1R： TCAATTCATGCTGAAAATTAATGACTAT。 利 用该标记进行辅助选择可提高油菜高产育种效 率。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 CN 109762926 A 2019.05.17 CN 109762926 A 1.检测甘蓝型油菜A03染色。

3、体第19,267,907个核苷酸的试剂在甘蓝型油菜角果数筛选 育种上的应用。 2.根据权利要求1所述应用， 所述的试剂为针对甘蓝型油菜A03染色体第19,267,907个 核苷酸设计的引物。 3.根 据 权 利 要 求 2 所 述 的 应 用 ，所 述 的 引 物 为 ：s n p A 0 3 - 1 F ： ATTTTCATTGATAAACATACCGAATT， 反向引物为snpA03-1R： TCAATTCATGCTGAAAATTAATGACTAT。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109762926 A 2 一种与油菜角果数关联的分子标记引物及应用 技术领域 0001 本发明属于分子生。

4、物学及遗传育种技术领域， 具体涉及一种与油菜角果数关联的 分子标记引物及应用。 背景技术 0002 近年来， 我国国产植物油自给率仅为35左右， 严重威胁着我国食用油供给安全 (华玮等， 2016)。 油菜是我国第一大油料作物(Hu等， 2016)， 菜籽油是国产食用植物油的第 一大来源。 然而， 与加拿大等菜籽出口国相比， 我国油菜产业存在着产油量不高的问题， 制 约了其国际竞争力。 在城镇化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形势下， 持续提高单位 面积产油量是主要出路。 目前我国油菜品种含油量的提升相对较快(傅廷栋， 2014)而单产 仍然低于世界平均水平(http:/apps.fas.us。

5、da.gov/psdonline/)且增加十分缓慢， 这严 重影响了农民种植油菜的经济效益和油菜产业的国际竞争力。 因此， 如何提高油菜单产是 保证我国食用油安全的关键。 0003 同一种植密度条件下， 单位面积的油菜产量取决于单株产量， 而单株产量由角果 数、 每角粒数和粒重三个产量构成因子决定。 其中， 角果数性状与产量相关性最高(Shi等， 2015)。 虽然油菜产量三个构成因子之间表现不同程度的负相关， 但其相关系数往往不大 (Shi等， 2009)， 这表明可以通过提高单个产量构成因子及聚合不同产量性状的优异位点来 提高产量。 0004 油菜角果数性状是典型的数量遗传性状， 呈连续分。

6、布且易受环境影响。 基于表型 选择的常规育种方法对角果数的效果不好， 育种效率较低。 利用与角果数性状紧密连锁的 分子标记可以弥补常规育种手段的不足， 而且， 可以聚合多个优异位点， 大大提高育种效 率。 目前， 油菜角果数性状的QTL定位有一些报道， 但大部分位点不能重复， 较难直接应用于 油菜育种。 Lu等利用关联群体在A01， A02， A03， A08， A09， A10， C04和C06染色体上检测到角果 数关联位点， 但均不能重复(Lu et al.,2018)； Ye等利用73290和中双11号构建的RIL群体， 在A01， A02， A03， A04， A05， A06， A0。

7、9， C02， C04和C06染色体上检测到15个角果数QTL， 仅有4个 可以重复检测到。 0005 本发明利用331份材料构成的关联群体， 对角果数进行多年多点考察， 获得了在多 个环境中均能检测到的角果数性状位点， 并开发相应分子标记， 用于油菜角果数性状的辅 助选择。 目前在A03染色体上第19,267,907个碱基位置附近未发现有与角果数相关的研究 报道， 这是一个新的控制油菜角果数性状的位点。 发明内容 0006 本发明的目的是在于提供了检测油菜A03染色体上第19,267,907个核苷酸的试剂 在油菜角果数筛选育种上的应用， 所述的试剂包括引物。 0007 为了达到上述目的， 本。

8、发明采取以下技术措施： 0008 与油菜角果数关联的分子标记的获得： 说明书 1/5 页 3 CN 109762926 A 3 0009 (1)收集331份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜核心关联群体， 采 集关联群体各株系的单株叶片， 用CTAB法提取总DNA， 利用油菜60K SNP芯片对每个样本进 行基因型分析。 0010 (2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http:/ 群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、 缺失率(missing rate)、 最小等 位基因频率(minor allele frequency)。 以。

9、缺失率0.2、 杂合率0.2、 最小等位基因频率 0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤， 最终 获得24508个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。 将获得的关联分析群体的基因型数据 导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析， 利用SPAGeDi软件计算亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。 0011 (3)将关联群体的331份材料在田间种植， 每份材料种3行， 重复3次， 田间管理按一 般田间试验标准执行。 在成熟期取样， 考察角果数。 每份材料取10株， 计算平均值。 0012 (4)结合关联群体的角果数表型。

10、数据、 基因型数据和群体结构， 利用TASSEL 4.0软 件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析。 最终在A03染色体上第19,267,907个碱基处检 测到与角果数显著关联的1个SNP标记Bn-A03-p20398340， 可以在N14、 W16、 BLUP三个环境中 重复检测， 显著水平P3.18E-05， 可解释7.6的表型变异， 所述A03染色体上第19,267, 907位碱基为G/C或A/T。 0013 检测油菜A03染色体上第19,267,907个核苷酸的试剂在油菜角果数筛选育种上的 应用， 所述的试剂包括但不限于引物。 0014 以上所述的引物， 优选的， 。

11、正向引物为snpA03-1F： ATTTTCATTGATAAACATACCGAATT， 反向引物为snpA03-1R： TCAATTCATGCTGAAAATTAATGACTAT， 扩增大小为152bp。 0015 (6)对该标记采用高分辨率溶解曲线(HRM)技术在油菜关联群体中进行基因型分 型， 再次利用Tassel 4.0软件进行关联分析， 确定该标记是与油菜角果数显著关联的标记 位点。 0016 (7)挑选出331份材料中角果数多和角果数少的材料， 分析分子标记的基因型及这 些材料角果数表型数据。 0017 以上所述的应用， 可利用现有技术， 对甘蓝型油菜A03染色体上19,267,907。

12、bp位置 的变异进行检测， 实现对油菜角果数性状的早期选择。 0018 利用本领域的常规技术， 设计的检测油菜A03染色体第19,267,907个碱基的引物， 其用于甘蓝型油菜角果数筛选育种， 也属于本发明的保护范围。 0019 检测包含有油菜A03染色体上第19,267,907个碱基的油菜序列的试剂在甘蓝型油 菜角果数筛选育种上的应用也属于本发明的保护范围。 0020 与现有技术相比， 本发明具有以下优点： 0021 (1)本发明获得了与油菜角果数显著关联的分子标记， 可解释7.6的表型变异， 且在多个环境中均可重复检测， 可有效应用于油菜角果数性状的遗传改良。 0022 (2)研究发现了与。

13、油菜角果数显著关联的分子标记snpA03-1， 为油菜角果数的预 先选择提供了可靠的分子标记来源。 0023 (3)利用分子标记snpA03-1可在油菜幼苗生长期快捷地对油菜品种或品系中与角 果数显著关联的基因组单倍型区域进行选择， 能够极大减轻育种筛选的工作量， 缩短育种 说明书 2/5 页 4 CN 109762926 A 4 周期， 加快油菜角果数改良的育种进程。 具体实施方式 0024 本发明所述技术方案， 如未特别说明， 均为本领域的常规技术； 所述试剂或材料， 如未特别说明， 均来源于商业渠道。 0025 实施例1： 0026 与油菜角果数显著关联的SNP标记的获得： 0027 (。

14、1)收集331份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜核心关联群体， 采 集关联群体各株系的单株叶片， 用CTAB法提取总DNA， 利用油菜60K SNP芯片对每个样本进 行基因型分析。 0028 (2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http:/ 群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、 缺失率(missing rate)、 最小等 位基因频率(minor allele frequency)。 以缺失率0.2、 杂合率0.2、 最小等位基因频率 0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤， 最终 。

15、获得24,508个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。 将获得的关联分析群体的基因型数 据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析， 利用SPAGeDi软件计算亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。 0029 (3)将关联群体的331个株系分别于2014年(W14)、 2014年(N14)和2016年(W16)共 三个环境分别种植在中国农业科学院油料作物研究所武昌试验田和江西红壤研究所试验 田， 成熟期挑选关联群体的各个株系中长势均匀的10个单株取样， 进行角果数的考察， 计算 各株系平均值。 0030 (4)结合关联群体的角果数表型数据、 基因型数据和群。

16、体结构， 利用TASSEL 4.0软 件(Bradbury et al.2007)进行关联分析。 最终在A03染色体上第19,267,907个碱基处检测 到与角果数显著关联的1个SNP标记Bn-A03-p20398340， 可以在N14、 W14、 W16三个环境中重 复检测， 显著水平P3.18E-05， 可解释7.6的表型变异。 所述A03染色体上第19,267,907 位碱基为A/T或G/C。 0031 实施例2： 0032 一种与油菜角果数显著关联的分子标记引物的获得： 0033 (1)提取油菜A03染色体上第19,267,907个碱基上下游各100bp的序列， 按照引物 设 计 原 。

17、则 ， 开 发 S N P 标 记 引 物 s n p A 0 3 - 1 ， 正 向 引 物 为 s n p A 0 3 - 1 F ： ATTTTCATTGATAAACATACCGAATT， 反向引物为snpA03-1R： :TCAATTCATGCTGAAAATTAATGACTAT， 扩增大小为152bp。 0034 在甘蓝型油菜材料73290中扩增的序列为GG基因型， 序列如下所示： 0035 TAAACATACCGAATTCCTTTTTTTGTTTTGTTGAAACATATTGATTATGTTGAAACATATTGATTACCT TACAACGATTCGAAATGGTTTTTTCACC。

18、TCTACGTCGGGAATCCAAACGTTATAAATAGTCATTAATTTTCAGCATG AATTGA 0036 在甘蓝型油菜51070中扩增的序列为AA基因型， 序列如下所示： 0037 TAAACATACCGAATTCCTTTTTTTGTTTTGTTGAAACATATTGATTATGTTGAAACATATTGATTACCT TACAACGATTCGAAATGGTTTTTTCACCTCTACATCGGGAATCCAAACGTTATAAATAGTCATTAATTTTCAGCATG 说明书 3/5 页 5 CN 109762926 A 5 AATTGA 0038 上述两个序列中的斜体碱。

19、基即为扩增产物中的差异碱基。 0039 (2)对该标记采用高分辨率溶解曲线(HRM)技术在油菜关联群体中进行基因型分 型， 再次利用Tassel 4.0软件进行关联分析， 确定该标记是与油菜角果数显著关联的标记 位点。 0040 实施例3： 0041 基于油菜A03染色体上第19,267,907位碱基设计的引物在油菜角果数筛选育种中 的应用， 其步骤如下： 0042 (1)在331份关联群体中挑选多角果数材料(主花序角果数70以上)20份和少角果 数材料(主花序角果数45以下)20份。 0043 (2)检查了与角果数显著关联分子标记snpA03-1的两种基因型在角果数极端材料 中的分布情况。 。

20、结果表明， 分子标记snpA03-1的基因型在20份多角果数材料中全部为GG基 因型， 而在20份角果数少的材料中仅有11份为GG(表1)。 另外， T测验结果表明分子标记 snpA03-1检测出的GG和AA两类基因型在油菜角果数性状上存在极其显著的差异(P 0.00066)。 0044 以上的结果足以说明分子标记snpA03-1与油菜的角果数是高度关联的， 因而可用 于油菜角果数的分子标记辅助选择。 0045 表1分子标记snpA03-1在角果数极端材料中的基因型 说明书 4/5 页 6 CN 109762926 A 6 0046 说明书 5/5 页 7 CN 109762926 A 7 序。

21、列表 中国农业科学院油料作物研究所 一种与油菜角果数关联的分子标记引物及应用 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 26 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 attttcattg ataaacatac cgaatt 26 2 28 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 tcaattcatg ctgaaaatta atgactat 28 3 152 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 taaacatacc gaattccttt ttttgttttg ttgaaacata ttgattatgt tg。

22、aaacatat 60 tgattacctt acaacgattc gaaatggttt tttcacctct acgtcgggaa tccaaacgtt 120 ataaatagtc attaattttc agcatgaatt ga 152 4 152 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 taaacatacc gaattccttt ttttgttttg ttgaaacata ttgattatgt tgaaacatat 60 tgattacctt acaacgattc gaaatggttt tttcacctct acatcgggaa tccaaacgtt 120 ataaatagtc attaattttc agcatgaatt ga 152 序列表 1/1 页 8 CN 109762926 A 8 。