检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910668942.X (22)申请日 2019.07.24 (71)申请人 艾普拜生物科技 （苏州） 有限公司 地址 215000 江苏省苏州市高新区锦峰路8 号2号楼216室 (72)发明人 龚建于祥春高敏黄慧 冯晓燕林挺 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 一种检测微小残留白血病相关融合基因的 引物、 探针及其试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种检测微小残留白血病相关 融合基因的引物和探针及其试剂盒。 本方法利用 数字P。

2、CR检测平台， 在一个PCR扩增体系中加入试 剂盒中核苷酸序列如SEQIDNo： 17所示的引 物和探针， 并将BCR-ABL1融合基因与自对照同时 扩增， 即以待检基因自身作为对照， 显著减少多 引物多扩增所带来的信号干扰， 无需标准品即可 实现转录本拷贝数检测， 在检测灵敏度达到 0.001的同时， 检测的精密度提高了3倍以上。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 110724741 A 2020.01.24 CN 110724741 A 1.一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针， 其特征在于， 所述引物和探 针的核苷酸序列如SEQ ID No： 17所示。 。

3、2.根据权利要求1所述的检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针， 其特征在 于， 所述引物和探针的核苷酸序列为： (1)用于检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 1所示 的正向引物BCR-F1， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 6所示的探针P2， 其中SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5端有FAM标记， 3端有BHQ-MGB标记； (2)用于检测BCR-ABL1(e1a2)融合基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 2所示的正向引 物BCR-F2， 由SEQ ID No：。

4、 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 6所示的探针P2， 其中SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5端有FAM标记， 3端有BHQ-MGB标记； (3)用于检测BCR-ABL1(e19a2)融合基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 3所示的正向 引物BCR-F3， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 6所示的探针P2， 其中 SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5端有FAM标记， 3端有BHQ-MGB标记； (4)用于检测ABL1自对照基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 4所示的正向引物ABL1- F。

5、， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 7所示的探针P1， 其中SEQ ID No： 7 所示的核苷酸序列的5端有HEX标记， 3端有BHQ-MGB标记。 3.一种含有权利要求1或2任一权利要求所述检测微小残留白血病相关融合基因的引 物和探针的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒包括核酸扩增试剂， 所述的核酸扩增试剂包 括： (1)检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2)融合基因和BCR-ABL1 (e19a2)融合基因的数字PCR反应液， 组份中的主要成份为正向引物BCR-F1、 BCR-F2、 BCR-。

6、 F3、 ABL1-F， 反向引物ABL1-R， 探针P1、 P2以及ddH2O。 (2)数字PCR预混液， 组份中的主要成份为qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR Tough Mix， 荧光素钠盐， 以及ddH2O。 4.根据权利要求3所述的检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的内参为自对照ABL1基因为： 由SEQ ID No： 4所示的正向引物 ABL1-F， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 7所示的探针P1， 其中SEQ ID No： 7所示的核苷酸序列的5端有HEX标记， 。

7、3端有BHQ-MGB标记。 5.根据权利要求3所述的检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒还包括质控品， 所述质控品有阴性质控品和阳性质控品组成， 所 述的阴性质控品为ddH2O， 所述的阳性质控品为质粒DNA混合液。 6.根据权利要求3所述的检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒， 其特征在于， 检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2)融合基因和BCR- ABL1(e19a2)融合基因的数字PCR反应液中含有： 10 mol/L的SEQ ID No： 15各1 L； 10 mol/L的SEQ I。

8、D No： 67各0.5 L。 7.根据权利要求3所述的检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒， 其特征在于， 权利要求书 1/2 页 2 CN 110724741 A 2 8.根据权利要求7所述的检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒， 其特征在于， 所述的微小残留白血病阳性质控中含有5种质粒的混合液， 所述质粒DNA如下： BCR-ABL1-e13a2质粒DNA、 BCR-ABL1-e14a2质粒DNA、 BCR-ABL1-e1a2质粒DNA、 BCR-ABL1- e19a2质粒DNA、 ABL1自对照质粒DNA。 权利要求书 2/2 页 3 CN 11072474。

9、1 A 3 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、 探针及其试 剂盒 技术领域 0001 本发明属于医学核酸检测技术领域， 具体涉及一种检测微小残留白血病相关融合 基因的引物、 探针及其试剂盒。 背景技术 0002 微小残留(Minimal Residual Disease， MRD)白血病是指白血病患者按目前的疗 效标准经过治疗取得完全缓解(Complete Remission， CR)后体内残存微量白血病细胞的状 态。 随着医学水平的发展以及各种新药的出现， 白血病的完全缓解率得到了很大改善， 但仍 有相当一部分病人在CR后出现复发， 生存期缩短， 最终导致死亡。 其中最主要的原因是骨。

10、髓 中MRD的持续存在。 据研究表明， 若MRD的数量在治疗后第12周还在10-4以上时， 急性白血病 复发的可能性就非常大， 就必须进行缓解后的巩固及强化治疗来降低临床复发风险及复发 率。 因此， MRD可作为预后评价的敏感指标， MRD如果小于10-4， 复发可能性小， 大于10-4则提 示疾病复发可能性极大， 且MRD值越小无复发生存期则越长。 目前， 临床判断白血病患者是 否复发的主要指标可分为两类： 一是临床症状， 如患者年龄、 性别、 白细胞数、 中枢神经系统 白血病的发生、 首次完全缓解所需时间， 但是骨髓细胞形态学检查敏感度低， 难以准确反映 CR时患者体内残留的白血病细胞数；。

11、 二是白血病细胞的生物学特性， 如细胞的遗传学、 免疫 学等， 这两类指标虽对预后复发判断有很大的帮助， 但均属间接分析。 MRD的诊断必须依赖 敏感度更高、 特异性更强的特殊检测手段。 经典的MRD检测手段包括流式细胞术(FCM)、 染色 体核型分析、 FISH检测和实时荧光定量PCR 检测。 同时， 由于每个患者白血病细胞的特异标 志不完全相同， 并且白血病细胞上还带有很多正常细胞的标志， 从而容易逃脱机体的免疫 监视。 因此， 怎样确定白血病细胞特有的免疫特征， 检出混杂在正常造血细胞中的微量白血 病细胞， 并建立一种检测灵敏度高、 并可实时监控微小残留含量变化的试剂盒对早期预测 白血病。

12、复发及延长白血病患者的无病生存期并依据检测结果为患者提出治疗方案具有重 大的社会意义。 0003 白血病与相关基因变异的关系， 以其中常见的慢性粒细胞白血病(CML)检测为例， 95CML 的病例皆因BCR-ABL基因产生融合后翻译出新的蛋白质而导致细胞的恶性转化， 同时也因为BCR-ABL 基因水平检测简单准确、 意义明确而被采用作为MRD的检测指标， 此外 该检测仅需进行血液检测， 无需骨髓活检。 国际临床试验结论以及CML治疗指南的制定也均 来自于BCR-ABL IS数据， BCR-ABL融合基因检测对于前期CML疾病辅助诊断及后续靶向用药 指导及残留病监测方面亦具有重要的临床意义。 目。

13、前临床上检查BCR-ABL融合基因的金标 准是荧光定量PCR技术， 按照目前的实践指南， 患者每三个月要进行一次检测， 结果以IS 单位报告， 但一是由于qPCR技术的定量检测依赖标准的参考物质； 二是由于 qPCR技术的局 限性导致检测灵敏度不够高， 使RT-PCR在LoD和LoQ方面具有局限性， 使其检测灵敏度一般 为0.01IS(MR4.0)， 即在10000个正常细胞中可以检出1个白血病细胞， 而MRD有效的监测 和治疗检测灵敏度需要达到0.002IS(MR4.7)以下。 因此， RT-PCR所具备的0.01IS 说明书 1/9 页 4 CN 110724741 A 4 (MR4.0)。

14、的检测灵敏度就会影响对CML患者临床治疗方案的制定， 如果可以更早在正常细胞 中检测出白血病细胞， 即找到比 qPCR灵敏度更高的检测方法， 即达到0.001IS(MR5.0)甚 至更低的MRD检测技术， 那么就会更早发现白血病复发的状况， 为患者更早提供治疗方案， 大大延长患者的生存期， 但是目前针对这种0.001IS (MR5.0)以及更低检测灵敏度并且 检测重复性好的MRD检测技术在国内还处于空白状态。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有RT-PCR， 寻求设计一种微小残留病的检测试剂盒， 建 立一种新的超灵敏、 检测重复性好的微小残留病检测试剂盒。 本方法无需建立标准曲线以 。

15、及内参即可实现靶基因结构变异丰度检测， 在简单准确判定微残病的同时， 还可以检测相 关变异基因的拷贝数以及发生频率并且可以将检测灵敏度达到0.001IS。 0005 为了完成本发明的目的， 采用的技术方案为： 0006 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针， 其核苷酸序列如SEQ ID No： 17所示。 0007 其中： 0008 (1)用于检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 1 所示的正向引物BCR-F1， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 6所示的探 针P2， 其中 SEQ。

16、 ID No： 6所示的核苷酸序列的5端有FAM标记， 3端有BHQ-MGB标记； 0009 (2)用于检测BCR-ABL1(e1a2)融合基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 2所示的正 向引物 BCR-F2， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 6所示的探针P2， 其 中SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5端有FAM标记， 3端有BHQ-MGB标记； 0010 (3)用于检测BCR-ABL1(e19a2)融合基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 3所示的 正向引物BCR-F3， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物AB。

17、L1-R， 由SEQ ID No： 6所示的探针P2， 其 中SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5端有FAM标记， 3端有BHQ-MGB标记； 0011 (4)用于检测ABL1自对照基因的引物和探针为： 由SEQ ID No： 4所示的正向引物 ABL1-F， 由SEQ ID No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 7所示的探针P1， 其中SEQ ID No： 7所示的核苷酸序列的5端有HEX标记， 3端有BHQ-MGB标记； 0012 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒， 包括核酸扩增试 剂， 所述的核酸扩增试剂包括： 0013 (1)检测。

18、BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2)融合基因和BCR- ABL1 (e19a2)融合基因的数字PCR反应液， 组份中的主要成份为正向引物BCR-F1、 BCR-F2、 BCR-F3、 ABL1-F， 反向引物ABL1-R， 探针P1、 P2以及ddH2O。 0014 (2)数字PCR预混液， 组份中的主要成份为qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR Tough Mix， 荧光素钠盐， 以及ddH2O。 0015 其中， 试剂盒的内参为自对照ABL1基因为： 由SEQ ID No： 4所示的正向引物ABL1- F， 由SEQ ID 。

19、No： 5所示的反向引物ABL1-R， 由SEQ ID No： 7所示的探针P1， 其中SEQ ID No： 7 所示的核苷酸序列的5端有HEX标记， 3端有BHQ-MGB标记。 0016 进一步优选的， 试剂盒还包括质控品， 所述质控品有阴性质控品和阳性质控品组 成， 所述的阴性质控品为ddH2O， 所述的阳性质控品为质粒DNA混合液。 说明书 2/9 页 5 CN 110724741 A 5 0017 进一步优选的， 试剂盒中用于检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1 (e1a2) 融合基因和BCR-ABL1(e19a2)融合基因的数字PCR反应液中含有：。

20、 10 mol/L的SEQ ID No： 15各1 L； 10 mol/L的SEQ ID No： 67各0.5 L。 0018 进一步优选的， 试剂盒的具体组成参见表1。 0019 表1试剂盒的组成 0020 0021 进一步优选的， 微小残留白血病阳性质控品中含有5种质粒的混合液， 所述质粒 DNA为： BCR-ABL1-e13a2质粒DNA、 BCR-ABL1-e14a2质粒DNA、 BCR-ABL1-e1a2质粒DNA、 BCR- ABL1-e19a2 质粒DNA、 ABL1自对照质粒DNA。 0022 下面对本发明的内容做进一步的解释和说明： 0023 本发明首先对试剂盒进行了原理正确。

21、性、 可行性、 准确度以及精确度的验证。 通过 验证确定了最优的PCR扩增体系， 在简单和复杂样本中均可最大程度地对微小残留白血病 地转录本进行检测。 0024 本发明的试剂盒主要可以对慢髓白血病进行复发监测： 大部分白血病患者按目前 的疗效标准经过治疗可以缓解， 但是仍有相当一部分病人由于MRD的存在， 面临复发的危险 最终导致死亡。 目前， RT-PCR 的检测灵敏度为0.01IS(MR4.0)， 本发明试剂盒是比qPCR检 测灵敏度更高的试剂盒， 可以更早在正常细胞中检测出白血病细胞， 即0.001IS(MR5.0) MRD检测技术， 会更早发现白血病复发的状况， 为患者更早提供治疗方案。

22、， 大大延长患者的 生存期。 0025 本发明的试剂盒中包括BCR-ABL1-e13a2、 BCR-ABL1-e14a2、 BCR-ABL1-e1a2、 BCR- ABL1-e19a2、 共4种阳性质粒的准确性质控品样本， 其阳性符合率为100。 0026 本发明的试剂盒中还包括ABL1自对照质粒， 无需建立标准曲线以及内参即可实现 靶基因结构变异丰度检测， 在简单准确判定微残病的同时， 还可以检测相关变异基因的拷 贝数以及发生频率。 0027 具体的： 本发明的试剂盒中： 0028 1、 检测BCR-ABL1-e13a2(P210)和BCR-ABL1-e14a2(P210)融合基因的引物和探。

23、针 序列参见表2。 0029 表2检测BCR-ABL1-e13a2(P210)和BCR-ABL1-e14a2(P210)融合基因的引物和探针 序列 0030 0031 2、 检测BCR-ABL1-e1a2(P190)融合基因的引物和探针序列参见表3。 说明书 3/9 页 6 CN 110724741 A 6 0032 表3检测BCR-ABL1-e1a2(P190)融合基因的引物和探针序列 0033 0034 3、 检测BCR-ABL1-e19a2(P230)融合基因的引物和探针序列参见表4。 0035 表4检测BCR-ABL1-e19a2(P230)融合基因的引物和探针序列 0036 0037。

24、 4、 检测自对照ABL1的引物和探针序列参见表5。 0038 表5检测自对照ABL1的引物和探针序列 0039 0040 本发明的试剂盒能从抗凝血液种提取的RNA转录cDNA中检测相关融合基因， 最低 检出量达到0.14拷贝/ L。 0041 本发明的试剂盒对各精密度质控品在相应的反应液中重复做3次均能检出， 且CV 值均大大低于使用非自对照作为内参的试剂盒检测结果。 0042 本发明的试剂盒中BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2)融合基 因和 BCR-ABL1(e19a2)融合基因与ABL1自对照共用一条反向引物， 本质上是一个使用双重 探针对BC。

25、R-ABL1 融合基因进行检验的过程， 因此大大提高了检测的特异性、 精密度和准确 度。 本发明首先只需一条共用反向引物ABL1-R与BCR-ABL1融合基因的正向引物F1至F3组合 就可以实现对多种BCR-ABL1融合基因和ABL1自对照基因同时扩增， 并以ABL1自对照为参考 进行数据分析， 替代了现有技术中需要使用不同的引物对正常基因组进行另外扩增来作为 参考， 从而避免了多引物存在下的相互干扰或者由此引起的不可避免的非特异性扩增所导 致的重复性差、 背景信号强等问题； 其检测过程简单方便、 精密度、 准确度和特异性高， 得以 保证检测结果的正确性， 并可直接得到结构变异基因组拷贝数、 。

26、正常基因组拷贝数以及基 因组结构变异发生频率等结果。 附图说明 0043 图1为本发明涉及的试剂盒的基本原理示意图。 以ABL1基因的四种融合类型为例， 当ABL1基因分别与BCR基因的某些外显子发生融合， 则针对多种BCR-ABL1融合基因类型分 别设计正向引物F1、 F2、 F3， 并共用反向引物ABL1-R进行扩增， 并使用分子探针P2(如使用 说明书 4/9 页 7 CN 110724741 A 7 FAM蓝色信号标记)产生荧光信号； 自对照ABL1基因使用正向引物ABL1-F、 共用反向引物 ABL1-R和分子探针P1(如使用HEX绿色荧光信号标记)产生荧光信号。 0044 图2为本。

27、发明涉及的实施例1中使用本发明试剂盒对样本进行BCR-ABL1融合基因 检测的荧光信号图(Blue+Green)。 0045 图3为本发明涉及的实施例2中BCR-ABL1(e13a2-P210和e14a2-P210)梯度稀释后 数字PCR 检测结果。 图3A为检测NTC以及e13a2和e14a2的混合液分别为10， 1， 0.1， 0.032， 0.01， 0.0032， 0.002， 0.001八个梯度(FAM通道)； 图3B为总ABL1表达量 (HEX通道)； 0046 图4为本发明涉及的实施例2中的检测结果与预期结果的相关性分析。 具体实施方式 0047 为了便于更加清晰地解释本发明， 。

28、下面将通过具体实施方式结合附图对本发明所 述的技术方案进行更具体的全面描述。 本发明可以应用于多种不同基因检测而不限于本文 所描述的实施例， 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件所述进行。 0048 实施例1： 0049 1、 试剂盒的组成参见表6。 0050 表6试剂盒的组成 0051 0052 其中， 数字PCR反应液中含有： 1 L 10 mol/L BCR-F1， 1 L 10 mol/L BCR-F2， 1 L 10 mol/L BCR-F3， 1 L 10 mol/L ABL1-F， 1 L 10 mol/L ABL1-R， 0.5 L 10 mol/L BCR。

29、- ABL1-P2， 0.5 L 10 mol/L ABL1-P1； 0053 数字PCR预混液中含有： 2qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR Tough Mix 12.5 L， 10 M荧光素钠盐2.5 L。 0054 阳性质控品中含有表7中5种质粒混合液。 0055 表7阳性质控品中的5种质粒混合液 0056 质粒名称 质粒浓度 体积( L) BCR-ABL1-e13a2-P210质粒DNA 1ng/ L 50 BCR-ABL1-e14a2-P210质粒DNA 1ng/ L 50 BCR-ABL1-e1a2-P190质粒DNA 1ng/ L 50 BCR-ABL1-。

30、e19a2-P230质粒DNA 1ng/ L 50 ABL1自对照质粒DNA 1ng/ L 50 0057 2、 使用方法： 0058 2.1.仪器： 适用于NaicaTM Stilla数字PCR仪。 0059 2.2.样本： 0060 本发明的试剂盒适用于抗凝血液及抗凝骨髓样本。 说明书 5/9 页 8 CN 110724741 A 8 0061 样本保存： 所取样本保存于适用于保存RNA的采血管中备用。 0062 RNA提取要求： 采用Biomiga Blood RNA miniprep kit(Cat#R6411)试剂盒提取样 本中的mRNA, 具体的操作参见试剂盒产品说明书， 提取后的。

31、RNA建议立即进行检测， 否则 于-80保存备用。 0063 样本要求： 样本所提取的RNA需经过使用内参的质量检测后方可使用。 0064 2.3检验方法 0065 2.3.1样本处理 0066 采用Biomiga Blood RNA miniprep kit(Cat#R6411)试剂盒提取样本中的mRNA, 具体的操作参见试剂盒产品说明书。 0067 2.3.2样本浓度确定： 将上述提取好RNA的样本， 使用Qubit4.0进行浓度测定。 0068 2.3.3扩增试剂准备： 0069 从试剂盒中取出各种数字PCR反应液及数字PCR预混液， 室温融化并振荡均匀后， 短暂离心数秒， 各数字PCR。

32、反应体系每个反应按照表8进行配制。 0070 表8数字PCR反应体系 0071 试剂组分 加入体积( L) qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR Tough Mix(2) 12.5 荧光素钠盐 2.5 数字PCR反应液 7 RNA模板(同时做阴性质控品和阳性质控品各1个) 3 总计 25 0072 2.3.4加样及扩增： 0073 取出芯片， 轻轻旋转白盖1/4圈并丢弃白盖， 移取上述步骤(1)中的25 L反应液加 入到芯片孔井中并盖上白色长盖。 0074 将加入25 L数字PCR反应液的芯片放入NaicaTM Geode微滴生成扩增系统中， 按表9 设置数字 PCR反应。

33、程序进行数字PCR反应。 0075 表9、 数字PCR反应程序 0076 0077 3、 检测： 0078 3.1信息采集： 数字PCR扩增结束后， 将芯片放置于NaicaTM prism3微滴阅读分析系 统中， 进行荧光信号的检测和判读。 0079 3.2结果判定： 0080 如图2中显示， 使用Crystal Miner进行结果判定， 通过检测FAM(Blue)和HEX (Green)的荧光信号得出样本中BCR-ABL1融合基因拷贝数、 ABL1总拷贝数以及融合基因所 占的比率。 位于第I象限的FAM+HEX(Blue+Green)双荧光信号代表BCR-ABL1融合基因的荧光 信号； 位于。

34、第II象限的HEX(Green) 单荧光信号代表正常基因的荧光信号， 即ABL1自对照基 说明书 6/9 页 9 CN 110724741 A 9 因的荧光信号值(Green单荧光信号值的总和) 减去BCR-ABL1融合基因的荧光信号值(Blue +Green双荧光信号值)； 位于第III象限无任何荧光信号代表无扩增状态的荧光信号本底 值； 位于第IV象限的FAM(Blue)单荧光信号代表非特异性扩增或试剂污染所产生的荧光信 号， 在正常无非特异性扩增及无污染的情况下， 该区域应该是没有荧光信号的。 综上所述， 我们可清晰直接地确定4种BCR-ABL1融合基因、 正常基因的含量及4种BCR-A。

35、BL1融合基因所 占的比例。 0081 实施例2： 0082 本发明所述试剂盒对BCR-ABL1融合基因检测的灵敏度分析 0083 (1)以BCR-ABL1(e13a2， e14a2)融合基因为例， 将含有BCR-ABL1融合基因的两种最 初浓度约为100ng/ L的e13a2， e14a2两种质粒进行混合， 将e13a2/e14a2混合质粒与含有 ABL1的质粒分别按照10-110-10进行梯度稀释； 0084 (2)将上述e13a2/e14a2与ABL1质粒进行混合， 得到e13a2/e14a2占总ABL1比例分 别为10， 1， 0.1， 0.032， 0.01， 0.0032， 0.0。

36、02， 0.001的8种质粒混合液， 并 分别对应为国际统一名称 MR1， MR2， MR3， MR3.5， MR4， MR4.5， MR4.7， MR5(表10)。 0085 表10BCR-ABL1融合基因质粒混合液种类及名称 0086 e13a2/e14a2与总ABL1比例 10 1 0.1 0.032 0.01 0.0032 0.002 0.001 名称 MR1 MR2 MR3 MR3.5 MR4 MR4.5 MR4.7 MR5 0087 (3)将MR1， MR2， MR3， MR3.5， MR4， MR4.5， MR4.7， MR5采用实施例1中的试剂盒和检测 方法进行数字PCR检测并。

37、根据检测结果(图3)计算融合基因的比率， 统计预期值和实际测量 值并进行相关性函数的计算(表11)。 检测结果显示， 检测比例的最低值为0.001， 即MR5， 并且在0.001至 10检测范围内， 决定系数R2为0.99(图4)。 0088 表11MR1， MR2， MR3， MR3.5， MR4， MR4.5， MR4.7， MR5样本的数字PCR检测结果 0089 0090 为了进一步确定本试剂盒对低浓度融合基因检测的稳定性， 再次选取接近检测最 低限的MR4， MR4.7， MR5三个低浓度(分别是BCR-ABL1-e13a2/e14a2占到ABL1的比例为 0.01， 0.002， 。

38、0.001) 进行了三次重复检测并计算了变异系数(CV， Coefficient of Variation)。 检测结果表明， MR4的CV为11.59， MR4.7的CV为13.15， MR5的CV为3.53 (表12)。 0091 表12BCR-ABL1融合基因的MR4， MR4.7， MR5三梯度检测结果汇总 说明书 7/9 页 10 CN 110724741 A 10 0092 0093 实施例3： 0094 取8个慢性髓系白血病样本， 采用实施例1中的试剂盒和检测方法进行检测， 检测 结果如表13 所示； 0095 表13 8个慢性髓系白血病样本采用实施例1中的试剂盒和检测方法的检测。

39、结果 0096 0097 本发明的检测结果与确诊结果一致。 之后随机抽取上述8个慢性髓系白血病样本 中的5个样本， 并分别采用本试剂盒(表14)和非自对照方法试剂盒(表15)对BCR-ABL1融合 基因进行三次重复检测。 0098 表14 5个样本采用本试剂盒对BCR-ABL1融合基因进行三次重复检测结果 0099 0100 表15 5个样本采用非自对照方法试剂盒对BCR-ABL1融合基因进行三次重复检测 说明书 8/9 页 11 CN 110724741 A 11 结果 0101 0102 表14和表15的结果显示， 在同样样本的重复性检测中， 本申请所述的试剂盒(表 14)对于 BCR-A。

40、BL1融合基因检测方法的重复性(CV值低)显著优于目前常用的试剂盒(表 15)检测方法的重复性(CV值高)， 说明本申请所述的试剂盒对BCR-ABL1基因融合检测方法 的重复性好， 并且精密度提高3 倍以上(平均CV值相比较)。 0103 综上所述， 本申请所述试剂盒对BCR-ABL1融合基因检测灵敏度达到0.001的同 时， 检测的精密度提高了3倍以上。 说明书 9/9 页 12 CN 110724741 A 12 序列表 艾普拜生物科技 （苏州） 有限公司 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、 探针及其试剂盒 7 SIPOSequenceListing 1.0 1 19 DNA 人工。

41、序列(Artificial Sequence) 1 cagcattccg ctgaccatc 19 2 19 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 cagatctggc ccaacgatg 19 3 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 gtgtggccac ggacatcc 18 4 19 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 gtctgagtga agccgctcg 19 5 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 cccggagctt ttcaccttta g 21 6 25 DNA 序列表 1/2 页 13 CN 110724741 A 13 人工序列(Artificial Sequence) 6 ggtcattttc actgggtcca gcgag 25 7 25 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 7 ggtcattttc actgggtcca gcgag 25 序列表 2/2 页 14 CN 110724741 A 14 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 15 CN 110724741 A 15 图4 说明书附图 2/2 页 16 CN 110724741 A 16 。