蛋白多肽的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911222768.2 (22)申请日 2019.12.03 (71)申请人 襄阳蒙肽生物有限公司 地址 441000 湖北省襄阳市高新区珠海大 道37号襄阳科技城8号楼301室 (72)发明人 刘锦胜 (74)专利代理机构 武汉蓝宝石专利代理事务所 (特殊普通合伙) 42242 代理人 谢洋 (51)Int.Cl. C12P 21/06(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C0。

2、7K 1/20(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (54)发明名称 一种蛋白多肽的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种蛋白多肽的制备方法， 涉及 多肽技术领域。 包含以下步骤： (1)活体螺旋藻过 滤清洗、 萃取处理； (2)碱性蛋白酶酶解； (3)风味 蛋白酶酶解； (4)红曲霉酶解； (5)过滤； (6)洗脱、 冷冻干燥。 本发明的有益效果是： 通过采用三步 酶解法， 即采用碱性蛋白酶、 风味蛋白酶和红曲 酶共同水解螺旋藻蛋白， 能极大效率的提取螺旋 藻蛋白多肽， 且水解率达到75以上。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 CN 110904178 A 2020。

3、.03.24 CN 110904178 A 1.一种蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 包含以下步骤： (1)活体螺旋藻过滤清洗、 萃取处理： 将活体螺旋藻过滤清洗， 通过破壁技术对螺旋藻 进行破壁分离， 分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽， 将藻泥进行沥水处理， 使藻泥的含水量处 于75-85； (2)第一步酶解： 将处理好的藻泥装入反应罐内， 加入碱性蛋白酶， 完成第一步酶解反 应； (3)第二步酶解： 在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶， 完成第二步酶解反应； (4)第三步酶解： 在第二步酶解完成后加入红曲霉， 完成第三步酶解反应； (5)过滤： 采用截留分子量为300020000道尔顿的滤膜过。

4、滤或采用凝胶过滤色谱法过 滤， 收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液； (6)将螺旋藻蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱， 收集洗脱液， 冷冻干 燥。 2.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中在藻泥沥 水之前调节PH为8-9。 3.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 所述酶解温度为50-60， 所述酶解时间为5-12小时。 4.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 所述碱性蛋白酶活力为20 万-80万U/g， 其用量为藻泥质量的2.5-5； 所述风味蛋白酶活力为20-60万U/g， 其用量为 藻泥质量的1-3； 所述红。

5、曲霉活力为4-8万U/g， 其用量为藻泥质量的0.20-0.3。 5.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(5)中， 过滤时保 持温度为4560。 6.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(5)中， 过滤时所 截留的分子量为5000道尔顿。 7.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(6)中亲和色谱 柱是以整合素作为配基的。 8.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法， 其特征在于， 得到的蛋白多肽的序列如 序列表SEQ ID NO： 1所示。 9.如根据权利要求1所述的蛋白多肽在制备功能食品、 药品和化妆品中的。

6、应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110904178 A 2 一种蛋白多肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种蛋白多肽的制备方法， 具体的说， 涉及一种螺旋藻蛋白多肽的制 备方法。 背景技术 0002 螺旋藻(Spirulina)是一类单细胞生物， 属于蓝藻门颤藻科。 大量研究表明， 螺旋 藻含有非常丰富的营养成分， 蛋白质含量高达50-70， 氨基酸组成比例非常理想， 是一 种极好的蛋白质来源。 但蛋白质属于大分子物质， 遇水膨胀后粘度较大， 不利于加工， 且也 不利于人体对其消化和吸收。 对螺旋藻蛋白质进行水解有利于提高蛋白质的溶解性， 提高 利用率。 螺旋藻蛋白水解后形。

7、成多肽及小分子肽， 能被人体快速吸收。 0003 现有技术中， 提取螺旋藻蛋白多肽的方法， 主要有以下两种： 一是采用反复冻融与 超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白多肽， 该方法提取率较低， 且提取时间长； 二是采用 单一的生物酶提取法进行单独提取， 同样存在提取率低的现象。 发明内容 0004 本发明针对现有技术中存在的技术问题， 提供一种蛋白多肽的制备方法旨在解决 上述背景技术中存在的问题。 0005 本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 一种蛋白多肽的制备方法， 包含以下 步骤： 0006 (1)活体螺旋藻过滤清洗、 萃取处理： 将活体螺旋藻过滤清洗， 通过破壁技术对螺 旋藻进行破壁分。

8、离， 分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽， 将藻泥进行沥水处理， 使藻泥的含水 量处于75-85； ； 0007 (2)第一步酶解： 将处理好的藻泥装入反应罐内， 加入碱性蛋白酶， 完成第一步酶 解反应； 0008 (3)第二步酶解： 在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶， 完成第二步酶解反应； 0009 (4)第三步酶解： 在第二步酶解完成后加入红曲霉， 完成第三步酶解反应； 0010 (5)过滤： 采用截留分子量为300020000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱 法过滤， 收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液； 0011 (6)将螺旋藻蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱， 收集洗脱液， 冷冻 。

9、干燥。 0012 本发明的有益效果是： 通过采用三步酶解法， 即采用碱性蛋白酶、 风味蛋白酶和红 曲酶共同水解螺旋藻蛋白， 能极大效率的提取螺旋藻蛋白多肽， 且水解率达到75以上。 0013 在上述技术方案的基础上， 本发明还可以做如下改进。 0014 进一步的， 所述步骤(1)中在藻泥沥水之前调节PH为8-9。 0015 优选的， 所述酶解温度为50-60， 所述酶解时间为5-12小时。 0016 优选的， 所述碱性蛋白酶活力为20万-80万U/g， 其用量为藻泥质量的2.5-5； 所 说明书 1/4 页 3 CN 110904178 A 3 述风味蛋白酶活力为20-60万U/g， 其用量为。

10、藻泥质量的1-3； 所述红曲霉活力为4-8万U/ g， 其用量为藻泥质量的0.20-0.3； 0017 本发明中， 所述步骤(5)中， 过滤时保持温度为4560。 0018 进一步的， 所述步骤(5)中， 过滤时所截留的分子量为5000道尔顿。 0019 其中， 所述步骤(6)中亲和色谱柱是以整合素作为配基的。 0020 一种通过上述制备方法所制得得到的蛋白多肽的序列如序列表SEQ ID NO： 1所 示。 0021 本发明的一种根据上述方法所制备得到的蛋白多肽在制备功能食品、 药品和化妆 品中的应用。 0022 采用上述进一步方案的有益效果是： 本发明通过三步酶解法处理螺旋藻蛋白原 料、 过。

11、滤后采用以整合素为配基的亲和色谱法和反向色谱柱， 能特异性分离螺旋藻蛋白多 肽， 制备过程简单易控， 适宜于大规模制备和生产。 具体实施方式 0023 以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发 明， 并非用于限定本发明的范围。 0024 实施例1： 蛋白多肽的制备方法一 0025 (1)活体螺旋藻过滤清洗、 萃取处理： 将活体螺旋藻过滤清洗， 通过破壁技术对螺 旋藻进行破壁分离， 分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽， PH达到8时将藻泥进行沥水处理， 使 藻泥的含水量处于75-85； 0026 (2)第一步酶解： 将处理好的藻泥装入反应罐内， 加入活力为20万U/g、。

12、 重量为藻泥 质量2.5的碱性蛋白酶， 在50条件下完成第一步酶解反应， 酶解时间为2.4小时； 0027 (3)第二步酶解： 在第一步酶解完成后加入活力为20万U/g、 重量为藻泥质量1的 风味蛋白酶， 在50条件下完成第二步酶解反应， 酶解时间为1.3小时； 0028 (4)第三步酶解： 在第二步酶解完成后加入活力为4万U/g、 重量为藻泥质量0.2 的红曲酶， 在50条件下完成第三步酶解反应， 酶解时间为1.3小时； 0029 (5)过滤： 在45条件下， 采用截留分子量为5000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过 滤色谱法过滤， 收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液； 0030 (6)将螺旋藻蛋白。

13、多肽溶液循环上扬指以整合素为配基的亲和色谱柱， 直至上样 溶液与透过溶液中藻蓝蛋白含量一致， 其中， 柱填料体积为100ml， 填料粒径为100 m； 0031 (7)将步骤(6)中上样后的产品用25的乙醇在室温条件下进行洗脱， 所得到的溶 液即为与整合素配基特异性结合的多肽溶液； 0032 (8)将步骤(7)中的多肽溶液于50条件下进行减压蒸馏， 即得到螺旋藻蛋白溶 液； 0033 (9)将步骤(8)中的螺旋藻蛋白溶液上样至反相色谱柱(Xbrige： C18,5 m， 4.6* 250mm)， 然后以乙腈： 水75:25为流动相进行等度洗脱， 得到序列为HSHACTSYYCAKFCGTAS 。

14、CTHYCHPLHHYCCVNCSK的活性多肽溶液； 0034 (10)将步骤(9)中的活性多肽溶液进行冷冻干燥， 得到藻蓝蛋白活性多肽粉末。 0035 实施例2： 蛋白多肽的制备方法二 说明书 2/4 页 4 CN 110904178 A 4 0036 (1)活体螺旋藻过滤清洗、 萃取处理： 将活体螺旋藻过滤清洗， 通过破壁技术对螺 旋藻进行破壁分离， 分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽， PH达到8。 5时将藻泥进行沥水处理， 使藻泥的含水量处于75-85； ； 0037 (2)第一步酶解： 将处理好的藻泥装入反应罐内， 加入活力为50万U/g、 重量为藻泥 质量4的碱性蛋白酶， 在55条件下完。

15、成第一步酶解反应， 酶解时间为4小时； 0038 (3)第二步酶解： 在第一步酶解完成后加入活力为40万U/g、 重量为藻泥质量2的 风味蛋白酶， 在55条件下完成第二步酶解反应， 酶解时间为3小时； 0039 (4)第三步酶解： 在第二步酶解完成后加入活力为6万U/g、 重量为藻泥质量0.25 的红曲酶， 在55条件下完成第三步酶解反应， 酶解时间为3小时； 0040 (5)过滤： 在50条件下， 采用截留分子量为5000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过 滤色谱法过滤， 收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液； 0041 (6)将螺旋藻蛋白多肽溶液循环上扬指以整合素为配基的亲和色谱柱， 直至上样 溶液与。

16、透过溶液中藻蓝蛋白含量一致， 其中， 柱填料体积为100ml， 填料粒径为100 m； 0042 (7)将步骤(6)中上样后的产品用25的乙醇在室温条件下进行洗脱， 所得到的溶 液即为与整合素配基特异性结合的多肽溶液； 0043 (8)将步骤(7)中的多肽溶液于50条件下进行减压蒸馏， 即得到螺旋藻蛋白溶 液； 0044 (9)将步骤(8)中的螺旋藻蛋白溶液上样至反相色谱柱(Xbrige： C18,5 m， 4.6* 250mm)， 然后以乙腈： 水75:25为流动相进行等度洗脱， 得到序列为HSHACTSYYCAKFCGTAS CTHYCHPLHHYCCVNCSK的活性多肽溶液； 0045 。

17、(10)将步骤(9)中的活性多肽溶液进行冷冻干燥， 得到藻蓝蛋白活性多肽粉末。 0046 实施例3： 蛋白多肽的制备方法三 0047 (1)活体螺旋藻过滤清洗、 萃取处理： 将活体螺旋藻过滤清洗， 通过破壁技术对螺 旋藻进行破壁分离， 分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽， PH达到9时将藻泥进行沥水处理， 使 藻泥的含水量处于75-85； 0048 (2)第一步酶解： 将处理好的藻泥装入反应罐内， 加入活力为80万U/g、 重量为藻泥 质量5的碱性蛋白酶， 在60条件下完成第一步酶解反应， 酶解时间为5小时； 0049 (3)第二步酶解： 在第一步酶解完成后加入活力为60万U/g、 重量为藻泥质量3。

18、的 风味蛋白酶， 在60条件下完成第二步酶解反应， 酶解时间为3.5小时； 0050 (4)第三步酶解： 在第二步酶解完成后加入活力为8万U/g、 重量为藻泥质量0.3 的红曲酶， 在60条件下完成第三步酶解反应， 酶解时间为3.5小时； 0051 (5)过滤： 在60条件下， 采用截留分子量为5000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过 滤色谱法过滤， 收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液； 0052 (6)将螺旋藻蛋白多肽溶液循环上扬指以整合素为配基的亲和色谱柱， 直至上样 溶液与透过溶液中藻蓝蛋白含量一致， 其中， 柱填料体积为100ml， 填料粒径为100 m； 0053 (7)将步骤(6)中上样后。

19、的产品用25的乙醇在室温条件下进行洗脱， 所得到的溶 液即为与整合素配基特异性结合的多肽溶液； 0054 (8)将步骤(7)中的多肽溶液于50条件下进行减压蒸馏， 即得到螺旋藻蛋白溶 液； 说明书 3/4 页 5 CN 110904178 A 5 0055 (9)将步骤(8)中的螺旋藻蛋白溶液上样至反相色谱柱(Xbrige： C18,5 m， 4.6* 250mm)， 然后以乙腈： 水75:25为流动相进行等度洗脱， 得到序列为HSHACTSYYCAKFCGTAS CTHYCHPLHHYCCVNCSK的活性多肽溶液； 0056 (10)将步骤(9)中的活性多肽溶液进行冷冻干燥， 得到藻蓝蛋白活。

20、性多肽粉末。 0057 试验例1： 三步酶解与单一酶解之间的水解率对比(每种酶解方法都酶解10小时)。 如表1所示。 0058 酶解方法水解率() 碱性蛋白酶67 风味蛋白酶53 红曲酶56 三步酶解78 0059 从表1可以看出， 单一酶中， 碱性蛋白酶的提取效果最好， 而当三者结合水解时， 则 水解率高达78。 0060 其中， 蛋白质水解度的测定采用pH-stat法(Adler-Nissen， 1986)， 0061 螺旋藻蛋白水解度(DH)以水解断裂的肽键数目(h)占总键数目(htot)的百分数来 确定， 即： DHh/htot100 0062 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用。

21、以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 110904178 A 6 序列表 襄阳蒙肽生物有限公司 一种蛋白多肽的制备方法 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 36 PRT 螺旋藻(spirulina) 1 His Ser His Ala Cys Thr Ser Thr Thr Cys Ala Leu Pro Cys Gly Thr 1 5 10 15 Ala Ser Cys Thr His Thr Cys His Pro Leu His His Thr Cys Cys Val 20 25 30 Ala Cys Ser Leu 35 序列表 1/1 页 7 CN 110904178 A 7 。