分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911224498.9 (22)申请日 2019.12.04 (83)生物保藏信息 CGMCC No.18845 2019.11.04 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 吴建祥何宛芹吴佳瑜钱亚娟 周雪平 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 傅朝栋张法高 (51)Int.Cl. C12N 5/20(2006.01) C07K 16/10(2006.01) G01N 33/57。

2、7(2006.01) G01N 33/569(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (54)发明名称 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及 其单抗应用 (57)摘要 本发明公开了一种分泌抗凤果花叶病毒 (Pepinomosaicvirus， PepMV)单抗杂交瘤细胞 株及其单抗应用。 以提纯的PepMV病毒粒子为抗 原免疫BALB/c小鼠， 经杂交瘤技术获得1株能分 泌抗PepMV单抗的杂交瘤细胞株23D11， 其保藏号 为CGMCCNo.18845。 该细胞株分泌单抗腹水间接 ELISA效价达10-8， 抗体类型及亚类为IgG1、 轻 链， 该单抗与PepMV有特异性免疫。

3、反应， 而不与同 属的马铃薯X病毒反应， 也不与番茄斑驳花叶病 毒、 番茄花叶病毒、 番茄斑萎病毒、 番茄黄化曲叶 病毒、 番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反 应。 利用23D11单抗建立多种检测方法， 其中ACP- ELISA和dot-ELISA方法检测病叶的灵敏度分别 达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/mL)。 该 细胞株的创制及该病毒血清学检测方法的建立 为PepMV的检测诊断、 流行病学调查及科学防控 提供物质和技术支撑。 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 CN 110904053 A 2020.03.24 CN 110904053 A 1.一种分泌抗凤果。

4、花叶病毒单抗杂交瘤细胞株23D11， 其特征在于能分泌抗凤果花叶 病毒单抗， 所述的杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.18845。 2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株23D11分泌的抗凤果花叶病毒单抗， 其特征在 于该单抗腹水间接ELISA效价达10-8， 抗体类型及亚类为IgG1、 轻链， 该单克隆抗体与凤果 花叶病毒27kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应， 利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方 法检测感染PepMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480。

5、倍稀释， 单 位为重量/体积， g/mL。 3.如权利要求2所述的抗凤果花叶病毒单抗， 其特征在于所述的单抗能与凤果花叶病 毒有特异性免疫反应， 而不与同属的马铃薯X病毒反应， 也不与番茄斑驳花叶病毒、 番茄花 叶病毒、 番茄斑萎病毒、 番茄黄化曲叶病毒、 番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。 4.一种如权利要求2所述的抗凤果花叶病毒单抗在该病毒检测上的应用， 其特征在于 以抗凤果花叶病毒单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110904053 A 2 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术。

6、领域， 尤其涉及一种分泌抗凤果花叶病毒单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其单抗的应用。 背景技术 0002 凤果花叶病毒(Pepino mosaic virus， PepMV)属于弯曲病毒科 (Flexiviridae) 马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员， 基因组为正义单链RNA。 PepMV的基因组包含五个开放阅 读框， 分别表达5个蛋白， 第一个阅读框编码1个164kDa的RNA聚合酶， 中间3个阅读框分别编 码26、 14和9kDa蛋白组成三基因盒， 参与病毒的胞间移动， 最后一个阅读框编码一个27kDa 的外壳蛋白。 2000年该病毒首次在荷兰番茄上发现， 如今已经是全球温室番茄作。

7、物的主要 病毒病害。 0003 PepMV可侵染多种茄科植物， 尤其在番茄上引起严重危害， 症状包括果实变色开 裂， 叶片花叶斑驳和坏死。 PepMV症状的严重程度取决于环境条件， 以及病毒分离物的特性。 研究表明来自同一基因型的分离株之间的微小核苷酸序列差异就可增强病毒的侵袭能力 和加重症状。 该病毒一旦传入极易扩散流行， 目前我国防止该病毒病的入侵主要策略是加 强该病毒的口岸检验检疫。 0004 为了强化我国PepMV的检验检疫技术， 急需建立检测PepMV 简单快速、 经济有效、 高通量的实用检测技术。 与常规的指示植物接种、 电镜观察、 分子检测等方法相比， 血清学 方法具有简单、 经。

8、济、 易操作、 可大规模检测等优点， 是植物病毒检测和调查最实用的方法。 但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。 本发明以纯化的PepMV病毒粒子 作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌 PepMV特异性单抗的杂交瘤细胞株， 以分泌的单 抗为核心建立检测 PepMV的高通量的血清学方法及试剂盒， 从而为我国PepMV的口岸检验 检疫、 流行病学的调查、 病毒基因组功能分析、 抗性育种、 科学防控建立等提供物质和技术 支持。 发明内容 0005 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种分泌抗凤果花叶病毒单抗的杂交 瘤细胞株及其单抗应用。 0006 分泌抗凤果花叶病毒单抗的杂交瘤细胞。

9、株23D11， 它能分泌抗凤果花叶病毒的特 异性单抗， 杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.18845。 0007 一种所述的杂交瘤细胞分泌的抗凤果花叶病毒单克隆抗体， 抗凤果花叶病毒单克 隆抗体腹水间接ELISA效价达10-8， 抗体类型及亚类为IgG1、 轻链， 与凤果花叶病毒27kDa的 外壳蛋白有特异性免疫反应， 利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染 PepMV 番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480 倍稀释(w/v,g/mL)。 000。

10、8 抗凤果花叶病毒单克隆抗体能与凤果花叶病毒有特异性免疫反应， 而不与同属的 说明书 1/9 页 3 CN 110904053 A 3 马铃薯X病毒反应， 也不与番茄斑驳花叶病毒、 番茄花叶病毒、 番茄斑萎病毒、 番茄黄化曲叶 病毒、 番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。 0009 抗凤果花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种 免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。 0010 本发明与现有技术相比具有的有益效果： 1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗 PepMV特异性单克隆抗体， 以该单抗为核心建立的 ACP-ELISA、 dot-ELISA和Tissue print- E。

11、LISA血清学检测方法及其检测试剂盒能快递、 特异、 灵敏、 准确地检测PepMV； 2)利用本发 明所制备的单克隆抗体检测PepMV病毒， 对操作人员的技术要求低， 不需要昂贵的电子显微 镜、 PCR仪等设备； 3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间PepMV的检测诊断 及口岸检验检疫， 也可用于该病毒病的流行病学调查、 病毒基因组功能分析、 抗性育种、 科 学防控等方面。 附图说明 0011 图1dot-ELISA方法检测PepMV的灵敏度分析； 0012 图2ACP-ELISA(A)、 dot-ELISA(B)和Tissue print-ELISA(C) 和RT-PCR(D)检。

12、测口 岸番茄样品中PepMV结果。 2D图中的M代表1kb的DNA Marker。 0013 生物保藏 0014 分泌凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4 日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编： 100101， 保藏号为CGMCC No.18845。 具体实施方式 0015 分泌凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4 日保藏于中国科学院 微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.18845， 它能分泌抗凤果花叶病毒的单抗。 0016 一种所述的杂。

13、交瘤细胞分泌抗凤果花叶病毒单克隆抗体， 抗凤果花叶病毒单克隆 抗体腹水间接ELISA效价达10-8， 抗体类型及亚类为 IgG1、 轻链， 与凤果花叶病毒27kDa的 外壳蛋白有特异性免疫反应， 利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PepMV 番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释 (w/v,g/mL)。 0017 抗凤果花叶病毒单克隆抗体能与凤果花叶病毒有特异性免疫反应， 而不与同属的 马铃薯X病毒反应， 也不与番茄斑驳花叶病毒、 番茄花叶病毒、 番茄斑萎病毒、 番茄黄化曲叶 病毒、 番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。 0。

14、018 抗凤果花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种 免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。 0019 本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗凤果花叶病毒单抗， 且其分泌的单抗特 异性强、 灵敏度高、 效价高、 稳定性好。 以该单抗为核心建立检测PepMV的高通量的血清学方 法可应用于口岸检验检疫及田间植物样品中PepMV的检测诊断， 从而为我国PepMV的口岸检 验检疫及田间样品检测诊断和该病毒病害的科学防控提供物质和技术支持。 0020 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。 说明书 2/9 页 4 CN 110904053 A 4 0021 一、 杂交瘤细胞创制及其。

15、单克隆抗体的制备 0022 1.免疫原及检测抗原的制备 0023 用以下操作步骤提纯病毒粒子： 0024 1)将组织匀浆器在冰上预冷； 0025 2)称取感染PepMV的番茄病叶组织200g， 加入400mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲 液(含0.01M Na-EDTA和0.1巯基乙醇， pH 7.5)， 在组织匀浆器中匀浆5-10min使番茄植物 组织充分匀浆， 用双层棉纱布过滤匀浆液， 滤液6000rpm离心20min去除植物残渣； 0026 3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5Triton X-100、 4PEG (分子量为 6000)和0.1M NaCl， 然后4搅拌4h以上。

16、； 0027 4)11000rpm离心15min后去上清； 0028 5)用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮， 6 000rpm离心 15min后将上清收集于烧杯中于4放置， 沉淀再悬浮、 离心， 重复3次； 0029 6)将上述离心上清液合并， 33000rpm超速离心100min； 0030 7)所得沉淀用PB悬浮后8000rpm离心15min， 收集上清液， 沉淀再悬浮、 离心， 重复3 次； 0031 8)将合并上清液加到超离管中， 用注射器针头吸取30蔗糖加到超离管的底部形 成蔗糖垫， 33000rpm超速离心100min； 0032。

17、 9)所得沉淀用适量的0.01M PB(含0.01M MgCl2， pH 7.5)悬浮， 33 000rpm超速离 心100min， 去除蔗糖垫； 0033 10)所得沉淀用0.01M PB悬浮， 所得悬浮液即为病毒提纯液； 0034 11)病毒提纯液经3磷钨酸(pH 6.7)负染后， 置于JEOL JEM-1200EX 电镜下观察 发现大量高纯度的PepMV粒子。 0035 2.免疫动物 0036 用提纯的PepMV病毒粒子免疫8周龄BALB/c雌性小鼠： PepMV病毒粒子100 L/只与 等体积弗氏完全佐剂混合， 充分乳化后经腹腔加皮下注射200 L每只， 间隔3周， 取与一免等 量抗原。

18、和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后， 第二次腹腔注射200 L每只， 过3周后用加 倍剂量的抗原进行腹腔注射， 3天后取脾细胞进行融合。 0037 3.细胞融合 0038 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按9:1的比例在无血清的RPMI- 1640(Gibco)培养基中混匀， 1500rpm离心5min 后去除培养基， 含有细胞的离心管在37水 浴中加入1mL 50PEG (分子量1500)融合剂， 融合2min， 用无血清的RPMI-1640培养基终止 融合后1500rpm离心5min， 吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮， 分装到96孔细胞板中， 于37 5CO2的细胞培养。

19、箱中培养。 0039 4.杂交瘤细胞、 阳性孔的筛选及细胞克隆 0040 细胞培养箱中培养5天后， 用HAT培养基换液一次， 第10天用HT培养基换液， 等到融 合细胞覆盖孔底15以上时， 以感染PepMV 的番茄病叶粗提液为包被抗原用间接ELISA方 法筛选阳性孔， 共获 580个阳性孔。 对580孔进行特异性分析， 筛选出30个特异性好的细胞 孔并进行有限稀释法克隆， 最终获得1株能分泌PepMV高度特异和灵敏单抗的杂交瘤细胞株 23D11， 即前述保藏号为CGMCC No. 18845的杂交瘤细胞。 经3个月以上体外传代和多次冻存 说明书 3/9 页 5 CN 110904053 A 5。

20、 复苏后， 细胞株均能良好生长， 并稳定分泌抗体。 经扩大培养后， 用于腹水制备和液氮保存。 0041 5.单克隆抗体腹水制备及纯化 0042 取14周龄左右BALB/c雄性小鼠， 腹腔注射0.3-0.5mL降植烷， 7-10天后腹腔注入 约7105个杂交瘤细胞， 注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大， 用针头采取腹水， 8000rpm 离心3min， 收集上清液即为单抗腹水。 0043 取1倍体积腹水加2倍体积0.85生理盐水稀释， 室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵 溶液(pH 7.0)， 4过夜， 12,000rpm离心10min， 2mL 0.85生理盐水悬浮沉淀， 在4 0.85生理盐水中。

21、透析24h 后即获纯化的单抗， -80保存。 0044 6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定 0045 将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM 抗体作双向琼脂扩散试验， 结果分析23D11 单抗亚类为IgG1、 轻链。 以提纯的病毒粒子为 抗原， 用间接ELISA 方法检测单抗腹水效价， 分析结果表明单抗腹水效价达10-8。 0046 7.单克隆抗体的特异性检测 0047 用感染马铃薯X病毒(PVX)、 番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)、 番茄花叶病毒(ToMV)、 番 茄斑萎病毒(TSWV)、 番茄黄化曲叶病毒 (T。

22、YLCV)、 番茄黑环病毒(TBRV)的病叶粗提液包被 ELISA板， 以番茄健康叶片粗提液为阴性对照， 感染PepMV的番茄病叶粗提液为阳性对照， 用 ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。 ACP-ELISA方法的步骤： 上述病毒感染的病叶和健康叶 片分别在研钵中研磨， 按 1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆， 5000rpm离心3min 后上清100 L/孔包被ELISA板， 4过夜或372h； PBST洗涤3 次后用3的脱脂奶粉封闭 30-60min； 加入1:5000倍稀释的单抗 100 L/孔， 37孵育1-2h； PBST洗涤3次后加:1:8000 倍稀释。

23、的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100 L/孔， 37孵育1-2h； PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30-60min， 2mol/L 氢氧化钠终止反应后， 用酶标仪读取 OD405的值， 与阴性OD值比值大于3.0的样品为阳性。 结果发现， 23D11单抗对PepMV有强阳性 免疫反应， 而与感染PVX、 ToMMV、 ToMV、 TSWV、 TYLCV、 TBRV 的病叶和健康番茄植物组织粗提 液均无任何免疫反应。 0048 二、 检测PepMV血清学方法的建立 0049 1检测PepMV的ACP-ELISA检测方法 0050 1.1ACP-ELISA方法的。

24、步骤： 0051 1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液继续匀浆3min， 5000rpm离心3min后上清100 L/孔包被ELISA 板， 以感染PepMV的番茄叶片组织作为阳性对 照， 以健康番茄叶片组织作阴性对照， 4包被过夜或37包被2h； 0052 2)用PBST洗ELISA板3次， 每次3min， 之后每孔加入250 L封闭液(含3脱脂奶的 PBS)， 37封闭0.5-1h； 0053 3)弃ELISA板中封闭液， PBST洗涤3次后， 用封闭液适当稀释的单抗腹水100 L/孔， 37孵育1-2h； 0054 4)弃ELISA板中单抗稀释液，。

25、 PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP 标记羊抗鼠IgG二 抗(Sigma)100 L/孔， 37反应1-2h； 0055 5)PBST洗涤4次， 每次3min。 加PNPP底物于室温显色30-60min， 肉眼观察底物颜色 变成黄绿色的孔为阳性， 或2M氢氧化钠终止反应后用Bio-Rad 680酶标仪测OD405， 以P/N 说明书 4/9 页 6 CN 110904053 A 6 3.0作为阳性判断标准。 1.2检测PepMV ACP-ELISA方法的建立 0056 采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度， 即用 1:20倍稀释的 (w/v,g/mL)PepMV病叶粗提。

26、液作为抗原包被ELISA 板； ELISA版横向每列分别加入1:1000- 1:512000倍比稀释的PepMV 单抗并反应1h， PBST洗涤后ELISA板纵向每行分别加入 1: 1000-1:512000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗， 健康番茄植物稀释粗提液作为阴性对 照， 每个处理设3次重复， 确定ACP-ELISA 中抗体的最适工作浓度。 结果显示23D11单抗以1: 8000倍稀释和AP 标记的羊抗鼠IgG二抗以1:9000倍稀释为最适工作浓度， 根据最适工作浓 度建立检测PepMV的ACP-ELISA方法。 0057 1.3ACP-ELISA方法及PepMV单抗的特异性和灵。

27、敏度 0058 以感染PepMV的番茄病叶和健康番茄叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对 照， 取感染PVX烟草病叶、 感染ToMMV、 ToMV、 TSWV、 TYLCV或TBRV番茄病叶和健康番茄叶片粗 提液作为检测样品， 加到ELISA板中， 重复实验三次， 分析PepMV单抗及建立的 ACP-ELISA方 法的特异性。 在最适抗体工作浓度下， 该方法检测感染PepMV的番茄病叶均呈强阳性反应， 而检测感染PVX、 ToMMV、 ToMV、 TSWV、 TYLCV或TBRV番茄病叶和健康番茄叶片粗提液呈阴性 反应， 且与阳性样品的OD值差异极显著， 说明该方法和单抗的特异性好。 0059。

28、 将感染PepMV的番茄病叶和健康番茄叶片分别用PBS缓冲液从 1:10倍至1:81,920 倍(w/v,g/mL)倍比稀释， 倍比稀释的粗提液依次加到ELISA板， 分析ACP-ELISA方法检测感 染PepMV病叶的灵敏度， 实验重复三次。 结果表明， ACP-ELISA检测病叶的灵敏度达到 1:40, 960倍稀释(w/v,g/mL)， 说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。 0060 2dot-ELISA检测方法的建立及口岸样品检测 0061 2.1dot-ELISA方法的检测步骤 0062 1)在研钵中研磨番茄植物组织， 按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.01M PBS。

29、缓冲液匀 浆， 5000rpm离心3min， 上清即为植物组织粗提液； 0063 2)点样： 取2-3 L粗提液点到硝酸纤维素(NC)膜上， 同时设置健康和感染PepMV的 番茄叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照， 37恒温箱烘干10min； 0064 3)NC膜浸入到含5脱脂奶粉的PBST(含0.05Tween-20的0.01 M PBS)封闭液中 室温封闭30min； 然后， NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育1h； 0065 5)洗膜： 用PBST洗膜3次， 每次3min； 0066 6)NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h 后洗膜4-5次， 每 次3min； 00。

30、67 7)显色： 66 L NBT和33 L BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、 0.1M NaCl、 0.025M MgCl、 pH9.5)混匀， 用吸水纸把膜吸干， 膜放入底物液中反应， 室温 避光显色15-20min。 肉眼观察结果， 当阳性对照显现紫色斑点， 而阴性对照无变化时膜在自 来水中漂洗终止反应， 拍照并记录结果。 0068 2.2检测PepMV dot-ELISA方法的建立 0069 从1:1000倍开始分别进行倍比稀释PepMV单克隆抗体和AP标记的羊抗鼠IgG二抗， 用方阵实验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适。

31、工作浓度。 实验结果表明， 单抗和 酶标二抗的最适工作浓度分别为1:8000和1:8000倍稀释， 以上述抗体的最适工作浓度建立 检测植物中PepMV的dot-ELISA方法。 说明书 5/9 页 7 CN 110904053 A 7 0070 2.3dot-ELISA方法检测PepMV的特异性和灵敏度 0071 以感染PepMV的番茄病叶和健康番茄叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对 照， 以感染TSWV、 TYLCV、 TBRV、 PVX、 ToMMV 或ToMV番茄病叶以及健康番茄叶片作为检测样 品， 进行dot-ELISA 方法的特异性分析。 该方法检测感染PepMV的番茄病叶粗提液呈。

32、强阳性 反应， 而检测感染TSWV、 TYLCV、 TBRV、 PVX、 ToMMV、 ToMV植物病叶以及健康番茄叶片粗提液 均呈阴性反应， 说明该方法和单抗的特异性非常的好。 0072 取感染PepMV的番茄病叶在研钵中研磨匀浆， 用0.01M PBS从 1:10至1:40960倍倍 比稀释(w/v,g/mL)， 同样对健康番茄叶片粗提液作相同处理。 用dot-ELISA方法检测感染 PepMV番茄病叶的灵敏度。 灵敏度分析表明， 当PepMV病叶粗提液稀释到1:20480倍(w/v, g/ mL)时， 用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点， 即其检测病叶的灵敏度达到1: 2。

33、0480倍稀释(图1)。 0073 3.检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 0074 3.1Tissue print-ELISA操作步骤: 0075 1)样品准备： 取番茄茎秆， 用刀片切一个横断面； 0076 2)点样： 将横断面在NC膜上按压3sec， 同时将健康和感染PepMV植物组织分别作为 阴性和阳性对照， 37烘箱干燥5min； 0077 3)封闭： NC膜浸入到含5脱脂奶粉的PBST(含0.05 Tween-20的0.01M PBS)封 闭液中室温封闭1h； 0078 4)一抗孵育： NC膜放入适当稀释的PepMV单抗中室温孵育1h； 0079 5)二。

34、抗孵育： 用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵 育1h； 0080 6)PBST洗膜4-5次， 每次3min； 0081 7)加底物显色： 10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、 0.1M NaCl、 0.025M MgCl、 pH 9.5)中加入66 l NBT和33 l BCIP底物(Promega)混匀， 将膜浸入显色液中进行显色反应， 直至阳性显色明显、 阴性对照未显色时将膜在去离子水中漂洗终止反应， 记录显色结果。 0082 3.2Tissue print-ELISA最适抗体工作浓度的确定 0083 通过常规方阵实验确定Tissue prin。

35、t-ELISA中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。 选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、 酶标二抗稀释度组合为Tissue print-ELISA的最适 工作浓度。 结果发现单抗23D11 和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:7,000和1:9,000倍时 Tissue print-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳， 根据抗体最适工作浓度建立Tissue print-ELISA方法。 0084 4.建立的血清学方法的口岸检验检疫应用 0085 用建立的ACP-ELISA、 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法对 2019年来自口岸 一批共25个番茄样品进行PepMV检测，。

36、 发现其中有7个样品产生阳性反应(图2A-2C)。 样品同 时用RT-PCR方法进行分析， 结果表明所有血清学方法检测阳性样品中均扩增到PepMV 特异 性的基因片段， 而所有血清学检测阴性的样品中均未扩增到特异性基因片段(图2D)， PCR产 物核酸测序及序列比对分析表明， RT-PCR阳性样品确实感染PepMV， 表明3种血清学方法的 检测结果与RT-PCR完全一致。 说明ACP-ELISA、 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法能准 确、 可靠地用于植物中PepMV的检测。 说明书 6/9 页 8 CN 110904053 A 8 0086 5.凤果花叶病毒dot。

37、-ELISA检测试剂盒 0087 1)试剂盒主要成分： 0088 0089 以上试剂均保存于4 0090 硝酸纤维素膜(NC) 10张 0091 脱脂奶粉 30g 0092 10X PBST 1瓶 100mL 0093 底物缓冲液 1瓶 100mL 0094 2)检测番茄样品的操作步骤： 0095 a.番茄植物组织称重、 在研钵中研磨， 按1:20-50比例(w/v,g/mL) 加入0.01M PBS (pH7.4)后匀浆； 0096 b.匀浆液5,000rpm离心3min； 0097 c.取2.5 L上清点样于NC膜上， 同时设置健康和感染PepMV的番茄组织分别作为阴 性和阳性对照， 室温。

38、干燥10-20min； 0098 d.NC膜浸入到含5脱脂奶粉的PBST(含0.05Tween-20的0.01M PBS)封闭液中 室温封闭30min； 0099 e.NC膜放入1:5,000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min； 0100 f.用PBST洗膜3-4次， 每次3min； NC膜放入1:8,000稀释的AP 酶标记羊抗鼠IgG二 抗中室温孵育30-60min； 0101 g.PBST洗膜4-5次， 每次3min； 0102 h.66 L NBT和33 L BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、 0.1M NaCl、 0.025M MgCl2、 pH9.。

39、5)中， 混匀后膜放入底物液中显色， 肉眼观察结果， 待阳性对照显明显 紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应， 拍照记录结果。 0103 3)保存及有效期： 0104 于2-8避光保存， 有效期12个月。 0105 4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS， pH7.4)配方： 说明书 7/9 页 9 CN 110904053 A 9 0106 0107 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4， 定容至1,000mL 0108 6.凤果花叶病毒Tissue print-ELISA检测试剂盒 0109 1)试剂盒主要成分： 0110 0111 以上试剂均保存于4 0112 硝酸纤维素膜(。

40、NC) 10张 0113 脱脂奶粉 30g 0114 10X PBST 1瓶 100mL 0115 底物缓冲液 1瓶 100mL 0116 2)检测番茄样品的操作步骤： 0117 a.样品准备： 取番茄的叶片或茎， 将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面， 嫩茎直 接切成横断面； 0118 b.点样： 将横断面在NC膜上按压3sec， 同时将健康和感染PepMV 组织分别作为阴 性和阳性对照， 37烘箱干燥5min； 0119 c.NC膜浸入到含5脱脂奶粉的PBST(含0.05Tween-20的0.01M PBS)封闭液中 室温封闭30min； 0120 d.NC膜放入1:5,000倍稀释的单抗中。

41、室温孵育30-60min； 0121 e.用PBST洗膜3-4次， 每次3min； NC膜放入1:8,000稀释的AP 酶标记羊抗鼠IgG二 抗中室温孵育30-60min； 0122 f.PBST洗膜4-5次， 每次3min； 0123 g.66 L NBT和33 L BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、 0.1M NaCl、 0.025M MgCl、 pH9.5)中， 混匀后膜放入底物液中显色， 肉眼观察结果， 待阳性对照显明显紫 色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应， 拍照记录结果。 0124 3)保存及有效期： 说明书 8/9 页 10 CN 110904053 A 10 0125 于2-8避光保存， 有效期12个月。 0126 4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS， pH7.4)配方： 0127 0128 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4， 定容至1,000mL。 说明书 9/9 页 11 CN 110904053 A 11 图1 图2 说明书附图 1/1 页 12 CN 110904053 A 12 。