用于牙髓间充质干细胞分离、培养、储存的材料及材料盒.pdf

《用于牙髓间充质干细胞分离、培养、储存的材料及材料盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于牙髓间充质干细胞分离、培养、储存的材料及材料盒.pdf（20页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911126865.1 (22)申请日 2019.11.18 (71)申请人 深圳市润科生物科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市南山区粤海街 道高新南一道006号TCL工业研究院大 厦B401室 (72)发明人 魏宗科林科佳马冬磊张若楠 (74)专利代理机构 深圳市精英专利事务所 44242 代理人 冯筠 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A01N 1/02(2006.01) (54)发明名称 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储。

2、存的 材料及材料盒 (57)摘要 本发明提供了用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料及材料盒， 所述材料由牙髓采 集液、 细胞培养液、 细胞培养辅助液和细胞冻存 液构成； 所述牙髓采集液由牙齿保存液、 牙齿清 洗液和牙齿消毒液构成； 所述细胞培养液由四种 试剂混合后构成； 所述细胞培养辅助液由两种试 剂混合后构成； 所述细胞冻存液由细胞第一冻存 液和细胞第二冻存液构成， 所述细胞第一冻存液 由MSCGM-CDTMBulletKit和Ultroser G按照(1-10)： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻 存液由DMSO和右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： (0-2)的重量比组成。 所。

3、述材料不影响牙髓间充 质干细胞的活率、 细胞数量、 成脂诱导、 成骨诱导 以及对表面标志物的表达。 权利要求书2页 说明书8页 附图9页 CN 110923202 A 2020.03.27 CN 110923202 A 1.用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 由牙髓采集液、 细胞培 养液、 细胞培养辅助液和细胞冻存液构成； 所述牙髓采集液由牙齿保存液、 牙齿清洗液和牙齿消毒液构成； 所述细胞培养液由MSCGM-CDTMBullet Kit、 GibcoTMGlutaMAX Supplement、 PALLTMUltroser G和GibcoTMPenicillin-。

4、Streptomycin-Glutamine构成； 所述细胞培养辅助液由GibcoTM0.25Trypsin和GibcoTMDPBS构成； 所述细胞冻存液由细胞第一冻存液和细胞第二冻存液构成， 所述细胞第一冻存液由 MSCGM-CDTMBulletKit和Ultroser G按照MSCGM-CDTMBulletKit：Ultroser G (1-10)： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由DMSO和右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐 1： (0-2)的重量比组成。 2.如权利要求1所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 所述 细胞第一冻存液由MSCGM-CDTMB。

5、ulletKit和Ultroser G按照MSCGM-CDTMBulletKit： Ultroser G9： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由DMSO和右旋糖酐按照 DMSO： 右旋糖酐1： 1的重量比组成。 3.如权利要求1或2任一所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在 于， 将所述细胞第一冻存液与所述细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液： 细胞第二冻存液 (3-5)： 1的体积比配置成细胞冻存液。 4.如权利要求3所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 将所 述MSCGM-CDTMBullet Kit、 所述GibcoTMGlutaMA。

6、X Supplement、 所述PALLTMUltroser G与所 述GibcoTMPenicillin-Streptomycin-Glutamine按照MSCGM-CDTMBullet Kit： GibcoTMGlutaMAX Supplement： PALLTMUltroser G： GibcoTMPenicillin-Streptomycin- Glutamine(400-600)： (4-6)： (4-6)： 5的体积比配置成细胞培养液。 5.如权利要求4所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 将所 述细胞第一冻存液与所述细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液：。

7、 细胞第二冻存液4： 1的 体积比配置成细胞冻存液； 将所述MSCGM-CDTMBullet Kit、 所述GibcoTMGlutaMAX Supplement、 所述PALLTMUltroser G与所述GibcoTMPenicillin-Streptomycin-Glutamine 按照MSCGM-CDTMBullet Kit： GibcoTMGlutaMAX Supplement： PALLTMUltroser G： GibcoTMPenicillin-Streptomycin-Glutamine500： 5： 5： 5的体积比配置成细胞培养液。 6.如权利要求5所述用于牙髓间充质干细胞。

8、分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 所述 牙齿保存液为含有80-120IU/ml的青霉素和80-120 g/ml链霉素的DMEM培养基。 7.如权利要求6所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 所述 牙齿清洗液为氯化钠注射液； 所述牙齿消毒液为碘伏消毒液。 8.如权利要求7所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 其特征在于， 所述 MSCGM-CDTMBullet Kit货号为00190632； 所述GibcoTMGlutaMAX Supplement货号为 35050061； 所述PALLTMUltroser G血清替代品货号为15950-0。

9、17； 所述GibcoTMPenicillin- Streptomycin-Glutamine货号为10378016； 所述GibcoTM0.25Trypsin货号为15050065； 所 述GibcoTMDPBS货号为14190250。 9.用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 其特征在于， 包括牙髓采集套装、 权利要求书 1/2 页 2 CN 110923202 A 2 细胞培养套装和细胞冻存套装； 所述牙髓采集套装由含有20-40ml所述牙齿保存液的第一瓶、 含有5-15ml所述牙齿清 洗液的第二瓶、 含有5-15ml所述牙齿消毒液的第三瓶和含有5-15ml所述牙齿清洗液的。

10、第四 瓶构成； 所述细胞培养套装由含有400-600ml所述MSCGM-CDTMBullet Kit的第五瓶、 含有4-6ml 所述GibcoTMGlutaMAX Supplement的第六瓶、 含有4-6ml所述PALLTMUltroser G的第七瓶、 含有4-6ml所述GibcoTMPenicillin-Streptomycin-Glutamine的第八瓶、 含有400-600ml所 述GibcoTM0.25Trypsin的第九瓶和含有40-60ml所述GibcoTMDPBS的第十瓶构成； 所述细胞冻存套装由含有40-70ml所述细胞第一冻存液的第十一瓶和含有8-12ml所述 细胞第二冻。

11、存液的第十二瓶构成； 所述细胞第一冻存液由所述MSCGM-CDTMBulletKit和所述 Ultroser G按照MSCGM-CDTMBulletKit：Ultroser G(1-10)： 1的重量比组 成， 所述细胞第二冻存液由所述DMSO和所述右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： (0-2)的重量 比组成。 10.如权利要求9所述用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 其特征在于， 还包括工具套装， 所述工具套装由1-3把无菌眼科手术剪或1-3把无菌一次性手术刀、 2-4把 无菌一次性医用镊子和1-3块无菌医用纱布构成。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110923202 。

12、A 3 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料及材料盒 技术领域 0001 本发明涉及干细胞培养技术领域， 尤其是指一种用于牙髓间充质干细胞分离、 培 养、 储存的材料及材料盒。 背景技术 0002 干细胞具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,所以又被医学界称之为 “万用 细胞” 。 人体由200多种类型、 总数约50-75万亿个细胞构成,每min约有3亿个细胞死亡， 同时 有相当数量的新细胞产生,形成新陈代谢,这些新细胞均来自干细胞。 近年来， 随着研究的 深入， 已经能够在脐血、 脐带、 胎盘等组织中提取培养各种干细胞， 牙髓中的干细胞数量相 当于一个人体的干细胞备份， 是宝贵的生。

13、命资源。 0003 牙髓间充质干细胞相比于其他来源的间充质干细胞， 来源丰富， 儿童脱落的乳牙 以及成人的智齿均可以提取出牙髓间充质干细胞， 且采集方便安全， 过程无痛苦， 无伦理争 议， 储存的机会也多。 目前， 关于牙髓间充质干细胞的研究也越来越受到重视， 如何能够快 速高效的获取一定数量的牙髓间充质干细胞仍是需要解决的一个重要问题。 在获取牙髓间 充质干细胞过程中， 应用的材料种类以及工具多， 单独配置耗时长， 且容易引入污染风险。 此外， 所用材料必须保证冻存后不影响牙髓间充质干细胞的活率、 细胞数量、 成脂诱导、 成 骨诱导以及对表面标志物的表达， 否则， 得到的牙髓间充质干细胞不能。

14、被研究或利用。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是： 制作用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材 料盒， 其内的材料用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存时， 保证获得的牙髓间充质干细 胞冻存后不影响牙髓间充质干细胞的活率、 细胞数量、 成脂诱导、 成骨诱导以及对表面标志 物的表达。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为： 0006 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料， 由牙髓采集液、 细胞培养液、 细胞 培养辅助液和细胞冻存液构成。 0007 所述牙髓采集液由牙齿保存液、 牙齿清洗液和牙齿消毒液构成。 0008 所述细胞培养液由MSCGM-。

15、CDTM Bullet Kit、 GibcoTM GlutaMAX Supplement、 PALLTM Ultroser G和GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine构成。 0009 所述细胞培养辅助液由GibcoTM 0.25Trypsin和GibcoTM DPBS构成。 0010 所述细胞冻存液由细胞第一冻存液和细胞第二冻存液构成， 所述细胞第一冻存液 由MSCGM-CDTM BulletKit和Ultroser G按照MSCGM-CDTM BulletKit： Ultroser G(1-10)： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由DMSO和。

16、右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： (0-2)的重量比组成。 0011进一步的， 所述细胞第一冻存液由MSCGM-CDTM BulletKit和Ultroser G按 照MSCGM-CDTM BulletKit：Ultroser G9： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由 说明书 1/8 页 4 CN 110923202 A 4 DMSO和右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： 1的重量比组成。 0012 进一步的， 将所述细胞第一冻存液与所述细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液： 细胞第二冻存液(3-5)： 1的体积比配置成细胞冻存液。 0013 进一步的， 将所述MSCGM-CDTM Bu。

17、llet Kit、 所述GibcoTM GlutaMAX Supplement、 所述PALLTM Ultroser G与所述GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine按照MSCGM- CDTM Bullet Kit： GibcoTM GlutaMAX Supplement： PALLTM Ultroser G： GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine(400-600)： (4-6)： (4-6)： 5的体积比配置成细胞 培养液。 0014 进一步的， 将所述细胞第一冻存液与所述细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液。

18、： 细胞第二冻存液4： 1的体积比配置成细胞冻存液； 将所述MSCGM-CDTM Bullet Kit、 所述 GibcoTM GlutaMAX Supplement、 所述PALLTM Ultroser G与所述GibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine按照MSCGM-CDTM Bullet Kit： GibcoTM GlutaMAX Supplement： PALLTM Ultroser G： GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine500： 5： 5： 5的体积比 配置成细胞培养液。 0015 进一步的，。

19、 所述牙齿保存液为含有80-120IU/ml的青霉素和80-120 g/ml链霉素的 DMEM培养基。 0016 进一步的， 所述牙齿清洗液为氯化钠注射液； 所述牙齿消毒液为碘伏消毒液。 0017 进一步的， 所述MSCGM-CDTM Bullet Kit货号为00190632； 所述GibcoTM GlutaMAX Supplement货号为35050061； 所述PALLTM Ultroser G血清替代品货号为15950-017； 所述 GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine货号为10378016； 所述GibcoTM 0.25 Trypsin。

20、货号为15050065； 所述GibcoTM DPBS货号为14190250。 0018 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 包括牙髓采集套装、 细胞培养 套装和细胞冻存套装。 0019 所述牙髓采集套装由含有20-40ml所述牙齿保存液的第一瓶、 含有5-15ml所述牙 齿清洗液的第二瓶、 含有5-15ml所述牙齿消毒液的第三瓶和含有5-15ml所述牙齿清洗液的 第四瓶构成。 0020 所述细胞培养套装由含有400-600ml所述MSCGM-CDTM Bullet Kit的第五瓶、 含有 4-6ml所述GibcoTM GlutaMAX Supplement的第六瓶、 含有4-。

21、6ml所述PALLTM Ultroser G的 第七瓶、 含有4-6ml所述GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine的第八瓶、 含有400- 600ml所述GibcoTM 0.25Trypsin的第九瓶和含有40-60ml所述GibcoTM DPBS的第十瓶构 成。 0021 所述细胞冻存套装由含有40-70ml所述细胞第一冻存液的第十一瓶和含有8-12ml 所述细胞第二冻存液的第十二瓶构成； 所述细胞第一冻存液由所述MSCGM-CDTM BulletKit 和所述Ultroser G按照MSCGM-CDTM BulletKit：Ultroser G(。

22、1-10)： 1的 重量比组成， 所述细胞第二冻存液由所述DMSO和所述右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： (0- 2)的重量比组成。 0022 进一步的， 还包括工具套装， 所述工具套装由1-3把无菌眼科手术剪或1-3把无菌 一次性手术刀、 2-4把无菌一次性医用镊子和1-3块无菌医用纱布构成。 0023 本发明的有益效果在于： 材料盒的材料以及工具， 能够方便操作人对成人智齿和 说明书 2/8 页 5 CN 110923202 A 5 儿童脱落的乳牙进行及时处理， 方便、 快速、 高效地分离出牙髓间充质干细胞并进行扩增培 养、 储存， 无需操作人员做复杂繁多的准备工作。 应用此材料盒中的。

23、材料， 操作人可以储存 大量牙髓间充质干细胞， 并且保证获得的牙髓间充质干细胞冻存后不影响牙髓间充质干细 胞的活率、 细胞数量、 成脂诱导、 成骨诱导以及对表面标志物的表达， 即能够在临床疾病治 疗以及再生医学领域的研究和应用中提供可靠保证。 附图说明 0024 下面结合附图详述本发明的具体结构 0025 图1为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的P0 代牙髓间充质干细胞的形态图； 0026 图2为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的P1 代牙髓间充质干细胞的形态图； 0027 图3为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、。

24、 储存的材料盒后获得的P2 代牙髓间充质干细胞的形态图； 0028 图4为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的冻 干前P2代牙髓间充质干细胞的成脂诱导分化图； 0029 图5为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的冻 干后P2代牙髓间充质干细胞的成脂诱导分化图； 0030 图6为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的冻 干前P2代牙髓间充质干细胞的成骨诱导分化图； 0031 图7为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的冻 干后P2代牙髓间充质干细胞的成骨诱导分化图； 003。

25、2 图8为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的冻 干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD34表达结果图； 0033 图9为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的冻 干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD45表达结果图； 0034 图10为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的 冻干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD73表达结果图； 0035 图11为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的 冻干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD29表达结果图； 0。

26、036 图12为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的 冻干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD44表达结果图； 0037 图13为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的 冻干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD90表达结果图； 0038 图14为使用本发明的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒后获得的 冻干前后P2代牙髓间充质干细胞的表面标记物CD105表达结果图。 具体实施方式 0039 本发明最关键的构思在于： 设计不影响牙髓间充质干细胞的活率、 细胞数量、 成脂 说明书 3/8 页 6 CN 11092。

27、3202 A 6 诱导、 成骨诱导以及对表面标志物的表达的材料， 并整合牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储 存过程中所需的材料和工具， 形成材料盒， 方便操作人员使用。 0040 为了论述本发明构思的可行性， 根据本发明的技术内容、 构造特征、 所实现目的及 效果， 以下结合实施方式并配合附图详予说明。 0041 实施例1 0042 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 包括牙髓采集套装、 细胞培养 套装和细胞冻存套装； 所述牙髓采集套装包括含有30ml牙齿保存液的第一瓶、 含有10ml牙 齿清洗液的第二瓶、 含有10ml牙齿消毒液的第三瓶和含有10ml牙齿清洗液的第四瓶； 所述。

28、 细胞培养套装由含有500mlMSCGM-CDTM Bullet Kit的第五瓶、 含有5mlGibcoTM GlutaMAX Supplement的第六瓶、 含有5mlPALLTM Ultroser G的第七瓶、 含有5mlGibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine的第八瓶、 含有500mlGibcoTM 0.25Trypsin的第九瓶和含有 50mlGibcoTM DPBS的第十瓶构成； 所述细胞冻存套装由含有50ml细胞第一冻存液的第十一 瓶和含有10ml细胞第二冻存液的第十二瓶构成； 所述材料盒还包括工具套装， 所述工具套 装由2把无菌眼科手术。

29、剪或2把无菌一次性手术刀、 3把无菌一次性医用镊子和2块无菌医用 纱布构成。 0043所述细胞第一冻存液由MSCGM-CDTM BulletKit和Ultroser G按照MSCGM- CDTM BulletKit：Ultroser G9： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由DMSO和右 旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： 1的重量比组成。 0044 使用时， 将所述细胞第一冻存液与所述细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液： 细 胞第二冻存液4： 1的体积比配置成细胞冻存液； 将所述MSCGM-CDTM Bullet Kit、 所述 GibcoTM GlutaMAX Supplement、 所。

30、述PALLTM Ultroser G与所述GibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine按照MSCGM-CDTM Bullet Kit： GibcoTM GlutaMAX Supplement： PALLTM Ultroser G： GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine500： 5： 5： 5的体积比 配置成细胞培养液。 0045 实施例2 0046 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 包括牙髓采集套装、 细胞培养 套装和细胞冻存套装； 所述牙髓采集套装包括含有20ml牙齿保存液的第一瓶、 含有。

31、5ml牙齿 清洗液的第二瓶、 含有5ml牙齿消毒液的第三瓶和含有5ml牙齿清洗液的第四瓶； 所述细胞 培养套装由含有400mlMSCGM-CDTM Bullet Kit的第五瓶、 含有4mlGibcoTM GlutaMAX Supplement的第六瓶、 含有4mlPALLTM Ultroser G的第七瓶、 含有4mlGibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine的第八瓶、 含有400mlGibcoTM 0.25Trypsin的第九瓶和含有 40mlGibcoTM DPBS的第十瓶构成； 所述细胞冻存套装由含有40ml细胞第一冻存液的第十一 瓶和含有8m。

32、l细胞第二冻存液的第十二瓶构成； 所述材料盒还包括工具套装， 所述工具套装 由1把无菌眼科手术剪或1把无菌一次性手术刀、 2把无菌一次性医用镊子和1块无菌医用纱 布构成。 0047所述细胞第一冻存液由MSCGM-CDTM BulletKit和Ultroser G按照MSCGM- CDTM BulletKit：Ultroser G1： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由DMSO组 成。 说明书 4/8 页 7 CN 110923202 A 7 0048 使用时， 将所述细胞第一冻存液与所述细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液： 细 胞第二冻存液3： 1的体积比配置成细胞冻存液； 将所述MSCGM。

33、-CDTM Bullet Kit、 所述 GibcoTM GlutaMAX Supplement、 所述PALLTM Ultroser G与所述GibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine按照MSCGM-CDTM Bullet Kit： GibcoTM GlutaMAX Supplement： PALLTM Ultroser G： GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine400： 4： 4： 5的体积比 配置成细胞培养液。 0049 实施例3 0050 用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 包括牙髓。

34、采集套装、 细胞培养 套装和细胞冻存套装； 所述牙髓采集套装包括含有40ml牙齿保存液的第一瓶、 含有15ml牙 齿清洗液的第二瓶、 含有15ml牙齿消毒液的第三瓶和含有15ml牙齿清洗液的第四瓶； 所述 细胞培养套装由含有600mlMSCGM-CDTM Bullet Kit的第五瓶、 含有6mlGibcoTM GlutaMAX Supplement的第六瓶、 含有6mlPALLTM Ultroser G的第七瓶、 含有6mlGibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine的第八瓶、 含有600mlGibcoTM 0.25Trypsin的第九瓶和含有 60m。

35、lGibcoTM DPBS的第十瓶构成； 所述细胞冻存套装由含有70ml细胞第一冻存液的第十一 瓶和含有12ml细胞第二冻存液的第十二瓶构成； 所述材料盒还包括工具套装， 所述工具套 装由3把无菌眼科手术剪或3把无菌一次性手术刀、 4把无菌一次性医用镊子和3块无菌医用 纱布构成。 0051所述细胞第一冻存液由MSCGM-CDTM BulletKit和Ultroser G按照MSCGM- CDTM BulletKit：Ultroser G10： 1的重量比组成， 所述细胞第二冻存液由DMSO和 右旋糖酐按照DMSO： 右旋糖酐1： 2的重量比组成。 0052 使用时， 将所述细胞第一冻存液与所述。

36、细胞第二冻存液按照细胞第一冻存液： 细 胞第二冻存液5： 1的体积比配置成细胞冻存液； 将所述MSCGM-CDTM Bullet Kit、 所述 GibcoTM GlutaMAX Supplement、 所述PALLTM Ultroser G与所述GibcoTM Penicillin- Streptomycin-Glutamine按照MSCGM-CDTM Bullet Kit： GibcoTM GlutaMAX Supplement： PALLTM Ultroser G： GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine600： 6： 6： 5的体积比 配置成。

37、细胞培养液。 0053 上述实施例1-3中， 所述牙齿保存液为含有80-120IU/ml的青霉素和80-120 g/ml 链霉素的DMEM培养基。 优选地， 所述牙齿保存液为含有100IU/ml的青霉素和100 g/ml链霉 素的DMEM培养基。 所述牙齿清洗液为氯化钠注射液； 所述牙齿消毒液为碘伏消毒液。 所述 MSCGM-CDTM Bullet Kit货号为00190632； 所述GibcoTM GlutaMAX Supplement货号为 35050061； 所述PALLTM Ultroser G血清替代品货号为15950-017； 所述GibcoTM Penicillin-Strept。

38、omycin-Glutamine货号为10378016； 所述GibcoTM 0.25Trypsin货号 为15050065； 所述GibcoTM DPBS货号为14190250。 0054 牙髓采集套装、 细胞培养套装、 细胞冻存套装、 工具套装分别为独立的套装小盒， 使用时， 四个套装小盒之间互不干扰， 即牙髓采集套装的套装小盒、 工具套装的套装小盒、 细胞培养套装的套装小盒、 细胞冻存套装的套装小盒共同结合才形成本发明的用于牙髓间 充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒。 0055 采用实施例1的用于牙髓间充质干细胞分离、 培养、 储存的材料盒， 进一步说明本 发明的用于牙髓间充质干细胞。

39、分离、 培养、 储存的材料及材料盒的具体应用方法。 具体使用 说明书 5/8 页 8 CN 110923202 A 8 方法步骤如下： 0056 1)采用牙髓采集套装对牙齿进行处理： 0057 A、 将要脱落的乳牙或成人智齿， 在有资质的牙科门诊中拔出； 将拔出的牙齿装入 第一瓶， 运输至实验室进行处理； 0058 B、 在生物安全柜中,用无菌一次性医用镊子将牙齿从第一瓶中夹出， 并迅速放入 第二瓶中； 0059 C、 轻轻晃动第二瓶对牙齿进行清洗1-2min， 并用无菌一次性手术刀或无菌眼科手 术剪去除牙齿周围的牙垢以及牙周组织； 0060 D、 用无菌一次性医用镊子将牙齿转移至第三瓶中消毒。

40、1-2min， 然后取出牙齿并放 入第四瓶， 浸润1-2min。 0061 2)牙髓组织处理及牙髓间充质干细胞培养 0062 E、 将第五瓶的MSCGM-CDTM Bullet Kit、 第六瓶的GibcoTM GlutaMAX Supplement、 第七瓶的PALLTM Ultroser G和第八瓶的GibcoTM Penicillin-Streptomycin-Glutamine全 部混合配置得到细胞培养液， 待用。 0063 F、 用两块无菌医用纱布将从第四瓶取出的牙齿进行包裹， 放入台钳中压碎， 在生 物安全柜中用无菌一次性医用镊子取出牙髓放入1-2ml细胞培养液中， 用无菌一次性手。

41、术 刀或无菌眼科手术剪将牙髓组织切碎， 得到P0代牙髓间充质干细胞； 0064 G、 将已切碎的牙髓组织转入T25培养瓶中进行分散培养， 补充加入1-2ml细胞培养 液， 保持牙髓组织块湿润； 0065 H、 将培养瓶放入37， 5CO2培养箱中培养， 得到P1代牙髓间充质干细胞； 0066 I、 待细胞融合度达到75-85时从培养箱中取出培养瓶， 弃去培养液； 加入10- 30ml第九瓶的GibcoTM 0.25Trypsin对细胞进行洗涤， 在200-800g条件下离心5min， 弃去 上清液； 0067 J、 加入2ml第十瓶的GibcoTM DPBS放入37， 5CO2培养箱中消化3m。

42、in； 0068 K、 加入5ml细胞培养液将细胞吹打起来， 然后转入15ml离心管中， 在200g条件下离 心5min， 弃去上清； 0069 L、 用5-10ml细胞培养液重悬细胞， 按5000-6000个/cm2种瓶， 放入37， 5CO2培养 箱中传代培养得到P2代牙髓间充质干细胞。 0070 3)采用细胞培养套装和细胞冻存套装对牙髓间充质干细胞进行冻存处理： 0071 M、 待P2代牙髓间充质干细胞融合度达到80以上时， 从培养箱中取出细胞培养 瓶， 弃去细胞培养液； 加入10-30ml第九瓶的GibcoTM 0.25Trypsin洗涤细胞， 在200-800g 条件下离心5min，。

43、 弃去上清； 0072 N、 加入2ml第十瓶的GibcoTM DPBS， 放入37， 5CO2培养箱中消化3min； 0073 O、 加入5ml细胞培养液将细胞吹打起来， 然后转入15ml离心管中， 在200g条件下离 心5min， 弃去上清液； 0074 P、 加入5ml第十一瓶的细胞第一冻存液， 吹打重悬细胞至混合均匀， 得到P2代牙髓 间充质干细胞重悬液， 然后取样计数； 0075 Q、 根据计数结果， 加入第十一瓶的细胞第一冻存液调整细胞密度至所述牙髓间充 质干细胞冻存密度为1106-10106个/ml。 说明书 6/8 页 9 CN 110923202 A 9 0076 R、 以密。

44、度为1106-10106个/ml的P2代牙髓间充质干细胞重悬液的总重量为细 胞第一冻存液的总重量， 按照细胞第一冻存液： 细胞第二冻存液4： 1的体积比， 往P2代牙 髓间充质干细胞重悬液中加入第十二瓶的细胞第二冻存液， 轻轻混匀得到待保存液； 0077 S、 将待保存液转到细胞冻存管中， 放入程序降温盒后， 置于-80冰箱进行冻存； 0078 T、 次日将细胞冻存管转入液氮罐中进行长期冻存。 0079 在步骤R中， 由于P2代牙髓间充质干细胞重悬液由细胞和细胞第一冻存液组成， 往 P2代牙髓间充质干细胞重悬液中加入细胞第二冻存液后， 相当于将细胞第一冻存液和细胞 第二冻存液混合后再对细胞进行。

45、重悬， 最后得到的待保存液组成一致， 故在实际操作中， 可 以以P2代牙髓间充质干细胞重悬液的总体积作为细胞第一冻存液的总体积。 0080 传代时， 每传代一次， 取适量牙髓间充质干细胞进行细胞形态观察， 观察结果如图 1-3所示。 其中， P0代牙髓间充质干细胞的形态图如图1所示， P1代牙髓间充质干细胞的形态 图如图2所示， P2代牙髓间充质干细胞的形态图如图3所示。 从图1-3中可知， 使用本发明材 料盒获得的牙髓间充质干细胞， 在传代时， 不同传代的细胞， 细胞形态一致， 同时也证明了 使用本发明的材料盒中的材料不会对牙髓间充质干细胞制备过程产生不良影响。 0081 采用本发明的材料盒。

46、中材料获得冻存的牙髓间充质干细胞后， 为了进一步论述本 发明材料盒中材料能够对牙髓间充质干细胞分离培养， 且不影响获得的牙髓间充质干细胞 的分化潜能， 以下进行牙髓间充质干细胞的分化潜能检测， 包括成脂诱导试验和成骨诱导 试验； 此外， 还进行牙髓间充质干细胞的表型鉴定试验、 存活检测以及细胞计数。 其中， 冻存 后的P2代牙髓间充质干细胞为冻存一个月后的细胞。 0082 1)成脂诱导： 收集冻存前后的P2代牙髓间充质干细胞， 按2104个/cm2接种到24孔 板， 37、 体积分数为5CO2培养箱中静置培养， 48h后， 小心吸去培养液， 枪头勿触板底， 每 孔加入1ml PBS， 沿板壁缓。

47、缓打入后晃动24孔板洗涤细胞， 弃掉PBS， 加入成脂诱导分化细胞 培养液， 之后每隔3d换液1次。 培养14d后， 4多聚甲醛固定后进行油红O染色， 每孔加入1ml ddH2O洗涤细胞， 洗涤三次。 每孔加入0.5ml ddH2O， 置于倒置显微镜下观察染色结果， 每孔取 200 x倍数图片， 统计染色面积总和及图片视野面积总和， 计算出染色面积所占比例。 冻存复 苏后的牙髓间充质干细胞成脂诱导14d后油红O染色可见胞浆内脂滴形成， 具体结果如图4- 5所示， 其中， 图4为冻存前的牙髓间充质干细胞成脂诱导分化结果图， 图5为冻存后的牙髓 间充质干细胞成脂诱导分化结果图。 从图4-5的结果中。

48、可以看出， 冻存后， 牙髓间充质干细 胞成脂诱导分化能力不发生变化。 0083 2)成骨诱导： 收集冻存前后的P2代牙髓间充质干细胞， 按2104个/cm2接种到24孔 板， 37、 体积分数为5CO2培养箱中静置培养， 小心吸去培养液， 枪头勿触板底， 每孔加入 1ml PBS， 沿板壁缓缓打入后晃动24孔板洗涤细胞， 弃掉PBS， 加入成骨诱导分化细胞培养 液， 之后每隔3d换液1次。 培养14d后， 4多聚甲醛固定后进行茜素红染色， 每孔加入1ml ddH2O洗涤细胞， 洗涤三次。 每孔加入0.5ml ddH2O， 置于倒置显微镜下观察染色结果， 每孔取 200 x倍数图片， 统计染色面。

49、积总和及图片视野面积总和， 计算出染色面积所占比例。 成骨诱 导14d后茜素红染色色可见细胞胞浆中有较多的红色钙化基质沉积， 已形成小片状矿化结 节， 具体结果如图6-7所示。 其中， 图6为冻存前的牙髓间充质干细胞成骨诱导分化结果图， 图7为冻存后的牙髓间充质干细胞成骨诱导分化结果图。 从图6-7的结果中可以看出， 冻存 后， 牙髓间充质干细胞成骨诱导分化能力不发生变化。 说明书 7/8 页 10 CN 110923202 A 10 0084 综上所述， 冻存后牙髓间充质干细胞与未冻存牙髓间充质干细胞的成脂诱导和成 骨诱导比较， 无明显差异(P0.05)。 说明冻存复苏后牙髓干细胞的多向分化。

50、潜能仍保持不 变。 0085 3)表型鉴定试验： 将分离出的牙髓间充质干细胞进行培养， 并传代培养至P2代， 消 化并收集细胞进行表型鉴定。 冻存前， 取适量冻存密度为1-10106个/ml的牙髓间充质干 细胞， 进行表面标志物检测， 所述表面标志物包括CD34、 CD45、 CD73、 CD29、 CD44、 CD90和 CD105。 分别对冻存前后的牙髓间充质干细胞进行检测CD34、 CD45、 CD73、 CD29、 CD44、 CD90、 CD105， 检测结果如图8-14所示。 从图8-14的结果中可以看出， 冻存前后的牙髓干细胞均不 表达或低表达CD34、 CD45； 冻存后的牙髓。