纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911167721.0 (22)申请日 2019.11.25 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 16963 2018.12.05 (71)申请人 山东省科学院生态研究所(山东省 科学院中日友好生物技术研究中 心) 地址 250000 山东省济南市历城区经十东 路28789号 (72)发明人 扈进冬吴远征李纪顺隋丽娜 魏艳丽刘宝军杨合同 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 于晓晓 (51)Int.Cl. C12N 15/80(200。

2、6.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C12R 1/885(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方 法及其应用 (57)摘要 本发明涉及微生物遗传转化技术领域， 具体 涉及一种采用镁硅酸盐纳米粘土介导的丝状真 菌遗传转化方法及其在丝状真菌基因工程和功 能研究中的应用， 所述方法包括以下步骤： 1)提 取质粒； 2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液； 3)制 备基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物； 4)制备 受体菌悬浮液； 5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化； 所述应用为上述纳米粘土介。

3、导的丝状真菌遗传 转化方法在丝状真菌遗传转化中的应用。 本转化 方法最大优点是无明显的寄主限制， 几乎适合于 任何受体材料， 操作简单， 适用于高通量筛选所 需的简便操作流程。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 110923257 A 2020.03.27 CN 110923257 A 1.一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)提取质粒； 2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液； 3)制备基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物； 4)制备受体菌悬浮液； 5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化。 2.如权利要求1所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特。

4、征在于， 所述 步骤1)包括： 提取丝状真菌整合质粒， 将浓度浓缩为1001000ng/uL。 3.如权利要求1所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述 步骤2)包括： 称取镁硅酸盐纳米粘土载体， 利用无菌超纯水将其制备成质量分数0.1的悬 浮液， 将配置好的悬浮液放入无菌密封试管中， 然后置于超声波仪中超声5min备用。 4.如权利要求3所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述 镁硅酸盐纳米粘土载体的制备方法包括以下步骤： 将4.2g MgCl26H2O溶于100g无水乙醇中， 然后向该溶液中滴入6.5mL 3-氨丙基三乙 氧基硅烷(APT。

5、ES)， 同时不断地搅拌， 5min后溶液变成白色浆液， 继续搅拌1216h， 然后离 心分离沉淀， 用250mL无水乙醇漂洗二次， 40干燥即获得镁硅酸盐纳米粘土载体。 5.如权利要求1所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述 步骤3)包括： 将镁硅酸盐纳米粘土镁硅酸盐纳米粘土悬浮液稀释后， 按步骤1)提取的质粒 与稀释后镁硅酸盐纳米粘土悬浮液体积比19:1的比例混合， 室温孵育5min， 得到基因-镁 硅酸盐纳米粘土载体复合物。 6.如权利要求1所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述 步骤4)包括： 配制固体平板PDA培养基， 接种受体。

6、菌， 28培养至产生分生孢子， 用接菌环刮 取分生孢子一环至PDB液体培养基中28培养1216h， 取菌液3000rpm离心5min， 取沉淀， 加PBS缓冲液(pH6.0， 0.01M)重悬细胞， 并重悬细胞调成l107CFU/mL备用。 7.如权利要求6所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述 受体菌包括木霉菌、 镰孢菌、 红曲霉、 黑曲霉。 8.如权利要求1所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 其特征在于， 所述 步骤5)包括： 取基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物和200 L受体菌悬浮液以体积比1:1的 比例混合， 并充分涡旋； 然后将混合液放入超声波。

7、清洗机中， 在超声波输出功率为0.01 200W/cm2， 发射频率为10100KHz条件下， 超声10500s， 涂布抗性平板， 28恒温培养箱 中黑暗条件下培养57d。 9.一种如权利要求1所述的纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法在丝状真菌遗传转 化中的应用。 10.如权利要求9所述的一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法的应用， 其特征在 于， 所述丝状真菌包括木霉菌、 镰孢菌、 红曲霉、 黑曲霉。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110923257 A 2 一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物遗传转化技术领域， 具体涉及一种采用镁硅酸盐。

8、纳米粘土介导 的丝状真菌遗传转化方法及其在丝状真菌基因工程和功能研究中的应用。 背景技术 0002 丝状真菌是许多工业和农业生产菌株， DNA遗传转化技术是对丝状真菌进行菌种 改良、 提高生产效率、 进行基因克隆和研究基因功能的重要研究手段。 目前对于丝状真菌来 讲， 常用的遗传转化方法有PEG介导的原生质体转化、 电转化、 根癌农杆菌介导转化和限制 酶介导整合转化、 醋酸锂的转化等。 0003 PEG介导的原生质体转化和限制酶介导整合转化通常是需要制备丝状真菌原生质 体的， 而丝状真菌的原生质体制备是转化中的一大难点。 虽然， 原生质体制备方法大同小 异， 但要制备数量多、 质量高的原生质体。

9、， 并能成功转化需要注意脱壁酶的选择、 菌丝龄的 大小、 细胞预处理、 高渗液、 再生率、 融合频率等因素的影响。 不同的丝状真菌转化率差异非 常大， 同时也存在转化率低、 稳定性差、 细胞易聚合产生二倍体甚至多倍体等问题。 0004 经典的电转化法通常也还是需要制备原生质体的， 但其转化效率并不高， 因此限 制了其应用。 目前许多学者通过改良电转化的方法已经提高了转化的效率， 如2012年 Schuster通过改良， 实现了利用木霉进行电转化的方法， 为电转化的应用提供新的契机； 但 其对设备要求高， 需要专门的电转化设备支持。 0005 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化是目前很多研究人员采用的。

10、一种转化方法， 与其 他遗传转化方法相比， 具有不用制备原生质体， 受体细胞来源简单， 孢子、 菌丝均可， 同时该 方法相较其他转化方法转化率高， 一般是单拷贝， 转化子稳定性好。 现在已经有大量根癌农 杆菌介导转化的成功实例， 已成为工农业重要丝状真菌分子遗传学研究的重要手段， 但其 转化过程相对还是比较繁琐， 影响因素多， 对于某些菌株来说转化效率也不甚理想。 0006 因此， 为了实现丝状真菌遗传改良高通量筛选需要发明一种操作简单、 转化效率 高转化方法。 发明内容 0007 针对现有技术缺少一种操作简单、 转化效率高的丝状真菌遗传转化方法的问题， 本发明提供一种纳米粘土介导的丝状真菌遗。

11、传转化方法及其应用， 本方法利用镁硅酸盐纳 米粘土材料可以和丝状真菌的细胞膜结合， 同时能在细胞膜上形成孔洞的特点， 使介导遗 传物质进入丝状真菌细胞内， 然后整合到受体细胞或组织染色体上并进行表达， 从实现外 源基因的转化。 0008 第一方面， 本发明提供一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 所述方法包 括以下步骤： 0009 1)提取质粒； 0010 2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液； 说明书 1/5 页 3 CN 110923257 A 3 0011 3)制备基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物； 0012 4)制备受体菌悬浮液； 0013 5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化。 0014 进一。

12、步的， 所述步骤1)包括： 提取丝状真菌整合质粒， 将浓度浓缩为1001000ng/ uL。 0015 进一步的， 所述步骤2)包括： 称取镁硅酸盐纳米粘土载体， 利用无菌超纯水将其制 备成质量分数0.1的悬浮液， 将配置好的悬浮液放入无菌密封试管中， 然后置于超声波仪 中超声5min备用。 0016 进一步的， 所述镁硅酸盐纳米粘土载体的制备方法包括以下步骤： 0017 将4.2g MgCl26H2O溶于100g无水乙醇中， 然后向该溶液中滴入6.5mL 3-氨丙基 三乙氧基硅烷(APTES)， 同时不断地搅拌， 5min后溶液变成白色浆液， 继续搅拌1216h， 然 后离心分离沉淀， 用2。

13、50mL无水乙醇漂洗二次， 40干燥即获得镁硅酸盐纳米粘土载体。 0018 进一步的， 所述步骤3)包括： 将镁硅酸盐纳米粘土镁硅酸盐纳米粘土悬浮液稀释 后， 按步骤1)提取的质粒与稀释后镁硅酸盐纳米粘土悬浮液体积比19:1的比例混合， 室 温孵育 5min， 得到基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物。 0019 进一步的， 所述步骤4)包括： 配制固体平板PDA培养基， 接种受体菌， 28培养至产 生分生孢子， 用接菌环刮取分生孢子一环至PDB液体培养基中28培养1216h， 取菌液 3000rpm离心5min， 取沉淀， 加PBS缓冲液(pH6.0， 0.01M)重悬细胞， 并重悬细胞调成 l。

14、 107CFU/mL备用。 0020 进一步的， 所述受体菌包括木霉菌、 镰孢菌、 红曲霉、 黑曲霉。 0021 进一步的， 所述步骤5)包括： 取基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物和200 L受体 菌悬浮液以体积比1:1的比例混合， 并充分涡旋； 然后将混合液放入超声波清洗机中， 在超 声波输出功率为0.01200W/cm2， 发射频率为10100KHz条件下， 超声10500s， 涂布抗性 平板， 28恒温培养箱中黑暗条件下培养57d。 0022 第二方面， 本发明提供一种上述纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法在丝状真 菌遗传转化中的应用。 0023 进一步的， 所述丝状真菌包括木霉菌、 镰。

15、孢菌、 红曲霉、 黑曲霉。 0024 本发明的有益效果在于， 0025 本发明提供的纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法是一种物理过程， 其转化的 受体可以认为是所有具潜在分生能力的细胞与组织， 因此它的最大优点是无明显的寄主限 制， 几乎适合于任何受体材料； 0026 此外， 由于本转化方法操作简单， 只需将待转化的丝状真菌细胞和质粒DNA-镁硅 酸盐纳米粘土载体复合物等混合， 放置在玻璃瓶或Eppendorf小管中， 然后将小瓶或小管放 置在超声波仪器内腔中， 通过简单的超声处理即可完成转化过程， 不需要共孵育、 再生等过 程， 所以完全适用于高通量筛选所需的简便操作流程。 附图说明 002。

16、7 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 对于本领域普通技术人员而 说明书 2/5 页 4 CN 110923257 A 4 言， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。 0028 图1是实施例1和对比例1-6的转化子个数柱状图； 0029 图2是实施例1-5的转化子个数柱状图。 具体实施方式 0030 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案， 下面将结合本发明实 施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施 例仅仅是本。

17、发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都应当属于本发明保护 的范围。 0031 实施例1 0032 一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 所述方法包括以下步骤： 0033 1)提取质粒： 0034 选取丝状真菌载体pCAMBIA1300 质粒 ， 选 用质粒大提试剂盒提取 质粒 pCAMBIA1300， 浓度浓缩至100ng/ L； 0035 2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液： 0036 将4.2g MgCl26H2O溶于100g无水乙醇中， 然后向该溶液中滴入6.5mL 3-氨丙基 三乙氧基。

18、硅烷(APTES)同时不断地搅拌， 5min后溶液变成白色浆液， 继续搅拌16h， 然后离心 分离沉淀， 用250mL无水乙醇漂洗二次， 40干燥即获得镁硅酸盐纳米粘土载体； 0037 称取镁硅酸盐纳米粘土载体0.1g， 溶于100g无菌超纯水中， 并置于超声波仪中超 声5min 制备成0.1镁硅酸盐纳米粘土悬浮液备用； 0038 3)制备基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物： 0039 将0.1镁硅酸盐纳米粘土悬浮液稀释成浓度100ppm， 取pCAMBIA1300质粒500 L 加入100 L浓度为100ppm镁硅酸盐纳米粘土悬浮液中， 充分涡旋， 室温孵育5min得到基因- 镁硅酸盐纳米粘土。

19、载体复合物； 0040 4)制备受体菌悬浮液： 0041 将冻存的木霉菌20111在PDA固体培养基平板上培养温度28活化1次使其产生分 生孢子， 用接菌环刮取活化后的新生分生孢子一环至PDB液体培养基中， 28震荡培养16h， 取菌液1.5mL至离心管中4下3000rpm离心5min， 取沉淀， 加入PBS缓冲液(pH6.0， 0.01M) 重悬细胞， 冰浴并重悬细胞调成l107CFU/mL， 分装每管100 L备用； 0042 5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化： 0043 将基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物与木霉菌20111悬浮液等比例混合并充分 涡旋， 然后将混合液放入超声波清洗机中超声12。

20、0s， 超声波清洗机输出功率为1W/cm2， 发射 频率为 30KHz， 超声后混合液涂布含150 g/mL潮霉素和0.1曲酮的抗性平板， 28恒温培 养箱中黑暗条件下培养7d。 0044 实施例2 0045 一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法， 所述方法包括以下步骤： 0046 1)提取质粒： 0047 选取丝状真菌载体pCAMBIA1300 质粒 ， 选 用质粒大提试剂盒提取 质粒 说明书 3/5 页 5 CN 110923257 A 5 pCAMBIA1300， 浓度浓缩至1 g/ L； 0048 2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液： 0049 将4.2g MgCl26H2O溶于100g。

21、无水乙醇中， 然后向该溶液中滴入6.5mL 3-氨丙基 三乙氧基硅烷(APTES)同时不断地搅拌， 5min后溶液变成白色浆液， 继续搅拌12h， 然后离心 分离沉淀， 用250mL无水乙醇漂洗二次， 40干燥即获得镁硅酸盐纳米粘土载体； 0050 称取镁硅酸盐纳米粘土载体0.1g， 溶于100g无菌超纯水中， 并置于超声波仪中超 声5min 制备成0.1镁硅酸盐纳米粘土悬浮液备用； 0051 3)制备基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物： 0052 将0.1镁硅酸盐纳米粘土悬浮液稀释成浓度100ppm， 取pCAMBIA1300质粒100 L 加入100 L浓度为100ppm镁硅酸盐纳米粘土悬浮。

22、液中， 充分涡旋， 室温孵育5min得到基因- 镁硅酸盐纳米粘土载体复合物； 0053 4)制备受体菌悬浮液： 0054 将冻存的木霉菌20111在PDA固体培养基平板上培养温度28活化2次至产生分生 孢子， 用接菌环刮取活化后的新生分生孢子一环至PDB液体培养基中， 28震荡培养12h， 取 菌液1.5mL至离心管中4下3000rpm离心5min， 取沉淀， 加入PBS缓冲液(pH6.0， 0.01M) 重悬细胞， 冰浴并重悬细胞调成l107CFU/mL， 分装每管100 L备用； 0055 5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化： 0056 将基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物与木霉菌20111悬浮液。

23、等比例混合并充分 涡旋， 然后将混合液放入超声波清洗机中超声60s， 超声波清洗机输出功率为0.5W/cm2， 发 射频率为 22KHz， 超声后混合液涂布含150 g/mL潮霉素和0.1曲酮的抗性平板， 28恒温 培养箱中黑暗条件下培养5d， 至平板上长出的直径约大于5mm的单菌落。 0057 实施例3-8 0058 实施例3-8与实施例2的不同之处在于步骤3)中0.1镁硅酸盐纳米粘土悬浮液稀 释后浓度， 实施例3-8的稀释后浓度依次为25ppm、 50ppm、 75ppm、 150ppm、 200ppm和250ppm。 0059 测试例1 0060 对实施例2-8在抗性平板上长出的直径大于。

24、5mm的单菌进行单菌落计数(CFU)， 计 算转化效率， 转化效率转化子数目/质粒DNA质量， 计算结果如表1、 图1所示。 当镁硅酸盐 纳米粘土悬浮液浓度为25ppm250ppm范围内时， pCAMBIA1300质粒能够转化木霉菌20111， 说明镁硅酸盐纳米粘土载体具备介导效果， 且当纳米粘土悬浮液浓度为100ppm时， 木霉菌 20111的转化效率最高， 可以达到622CFU/ g质粒pCAMBIA1300。 0061 表1实施例2-8的转化效率 0062 0063 测试例2 说明书 4/5 页 6 CN 110923257 A 6 0064 采用本发明方法， 分别以纳米粘土介导木霉菌2。

25、0111、 木霉菌LTR-2、 假禾谷镰孢菌 ACCC38067、 红曲霉SM01和黑曲霉Z6的遗传转化， 其中， 木霉菌20111为深绿木霉HB20111， 于 2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏编号为CGMCC No.16963； 0065 木霉菌LTR-2于2005年1月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 保藏编号为CGMCC No.1498， 该木霉菌LTR-2已公开于中国发明专利 “绿色木霉LTR- 2 菌株及其制剂” (申请号200510104385.7)中； 0066 。

26、假禾谷镰孢菌ACCC38067购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心； 0067 红曲霉SM01公开于 “麦麸米糠混合发酵生产红曲色素条件的研究” (山东科学， 2015， 28(06)： 121-126)； 0068 黑曲霉Z6公开于 “黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达” (生物技术， 2008， 18 (06)： 18-20)。 0069 对相应抗性平板上长出的直径大于5mm的单菌进行单菌落计数(CFU)， 结果如图2 所示， 同时计算转化效率， 转化效率转化子数目/质粒DNA质量。 实验数据证明， 通过本发 明方法， 上述四种丝状真菌均获得了较高的转化， 转化效率198513CFU。

27、/g质粒 pCAMBIA1300， 说明镁硅酸盐纳米粘土介导的丝状真菌的转化方法可以适用于多种丝状真 菌， 具有较广的使用范围。 0070 尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述， 但本发明 并不限于此。 在不脱离本发明的精神和实质的前提下， 本领域普通技术人员可以对本发明 的实施例进行各种等效的修改或替换， 而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任 何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到变化或替换， 都应 涵盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为 准。 说明书 5/5 页 7 CN 110923257 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 110923257 A 8 。