哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911101041.9 (22)申请日 2019.11.12 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M2019316 2019.04.29 (71)申请人 集美大学 地址 361000 福建省厦门市集美区银江路 185号 (72)发明人 徐晓津李慧耀鄢庆枇江兴龙 黄力行祁欣陈郁浓 (74)专利代理机构 厦门市新华专利商标代理有 限公司 35203 代理人 朱凌 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) A61K 39/106(2006.01) A61。

2、P 31/04(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种哈 维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用。 该细胞 株为VibrioharveyiflrB-RNAi， 于2019年4月 29日保藏于中国典型培养物保藏中心， 简称 CCTCC， 保藏地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号 为CCTCCNO： M2019316。 所述哈维氏弧菌flrB基 因沉默细胞株可用于制备防治哈维氏弧菌的药 物或疫苗。 实验表明本发明的哈维氏弧菌flrB基 因沉默株能有效降低哈维氏弧菌粘附能力。

3、， 对防 治鱼病有重要意义。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 110938578 A 2020.03.31 CN 110938578 A 1.一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株， 其特征在于： 为Vibrio harveyi flrB-RNAi， 于2019年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心， 简称CCTCC， 保藏地址为中国武汉武汉 大学， 保藏编号为CCTCC NO： M2019316。 2.如权利要求1所述的哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株的应用， 其特征在于： 所述哈维 氏弧菌flrB基因沉默细胞株用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫苗。 权利要求书 1/1 页 2 C。

4、N 110938578 A 2 哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应 用。 背景技术 0002 近年来， 在中国沿海地区， 如福建， 浙江和广东， 大黄鱼养殖业发展迅速。 然而， 随 着繁殖规模的扩大， 各种传染病的发生频率越来越高， 尤其是由哈维氏弧菌引起的疾病。 哈 维氏弧菌(Vibiro harveyi)是一种重要的条件致病菌， 是海洋生物的严重病原体， 它是导 致笼养亚洲鲈鱼死亡的重要病原体。 0003 抗生素是目前水产动物细菌性疾病治疗的主要手段， 随着抗生素在治疗细菌性疾 病中广泛。

5、应用， 产生细菌耐药性、 导致药物残留等缺点。 而大黄鱼自身抵抗力日益降低， 病 害问题日趋严重， 给大黄鱼养殖业带来了较大的损失。 因此研究与开发生物药物或者疫苗 对防治鱼病有重要意义。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题， 在于提供一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应 用。 0005 本发明是这样实现的： 0006 本发明首先提供了一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株， 为Vibrio harveyi flrB-RNAi， 于2019年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心， 简称CCTCC， 保藏地址为中 国武汉武汉大学， 保藏编号为CCTCC NO： M2019316。 。

6、0007 本发明还提供了所述的哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株的应用， 将所述哈维氏弧 菌flrB基因沉默细胞株用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫苗。 0008 本发明具有如下优点： 实验表明本发明的哈维氏弧菌flrB基因沉默株能有效降低 哈维氏弧菌粘附能力， 对防治鱼病有重要意义。 附图说明 0009 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。 0010 图1为生物膜形成实验结果。 0011 图2为粘附实验结果。 0012 图3为运动性实验结果。 0013 图4为哈维氏弧菌鞭毛图。 具体实施方式 0014 实施例1构建哈维氏弧菌flrB基因沉默株 0015 哈维氏弧菌flrB基因沉默株的构。

7、建方法， 包括以下步骤： 说明书 1/3 页 3 CN 110938578 A 3 0016 1)设计并合成哈维氏弧菌flrB基因特异性shRNA： 0017 F : 5 - G A T C C G C T T G C T A C A G T C T C G T A T C A T T C A A G A G A T G A T A C G A GACTGTAGCAAGCTTTTTTGCATG-3 0018 R:5-CAAAAAAGCTTGCTACAGTCTCGTATCATCTCTTGAATGATAC GAGACTGTAGCAAGCG-3 0019 2)将所述shRNA退火形成双链RNA； 0。

8、020 退火反应体系为： 0021 0022 退火程序： 0023 95 2min 0024 每8s下降0.1， 降至25 约90min 0025 4 Forever 0026 3)提取pACYC184质粒并用BamHI和SpHI酶进行双酶切， 进行琼脂糖凝胶电泳后纯 化回收线性化的质粒。 0027 4)步骤2)所述双链RNA与步骤3)所述回收产物利用T4连接酶进行连接， 并热激转 化至大肠杆菌DH5 中。 利用含有34mg/mL氯霉素的LB 培养基平板筛选， 筛选获得的菌株进 行测序验证， 测序所得序列含有特异性 shRNA即为连接成功。 0028 连接反应步骤如下： 0029 A、 按以下。

9、体系配制连接反应混合液： 0030 线性质粒 2 L 0031 shRNA 5 L 0032 Solution I 7 L 0033 B、 16反应3小时后立即用于转化实验。 0034 5)从步骤4)所述大肠杆菌SM10与野生株哈维氏弧菌进行接合实验， 供受比例为5: 1(将重组载体导入菌株是制备沉默株的难点， 将供受体菌比例控制在合适的比例， 可以提 高导入的成功率。 但是导入过程并非完全可控， 导入成功还需要一定的偶发性， 因此该沉默 株的构建过程并不是可重复实现的)制备哈维氏弧菌flrB基因沉默株， 同时， 将原始 pACYC184质粒接合转化进入哈维氏弧菌制备对照菌株。 根据pACYC。

10、184质粒携带的氯霉素抗 性， 用含34mg/mL氯霉素的TCBS平板筛选携带pACYC184质粒的哈维氏弧菌， 16s rRNA测序后 经NCBI比对确定筛选所得菌株为哈维氏弧菌。 0035 实施例2生物膜形成实验 0036 先将过夜培养的哈维氏弧菌cheA基因沉默株和对照株的OD550调整到0.2左右， 并 将100 l菌液加入96孔酶标板。 28孵育24h后， 用无菌PBS洗脱两次除去未粘附于孔板上的 菌， 60烘干后加入 125ul 0.1结晶紫室温染色15min， 之后再用PBS洗三次孔， 加入 说明书 2/3 页 4 CN 110938578 A 4 200uL 33(v/v)冰乙。

11、酸， 用酶标仪测OD590。 实验重复两次， 每组实验作三次平行。 0037 生物膜形成实验结果： 稳定沉默的菌株flrB-RNAi的生物膜形成能力显著降低， 野 生株OD590值为0.68， cheA基因沉默株为0.33。 如图1所示。 0038 实施例3粘附实验 0039 将大黄鱼粘液(20 L)均匀地加入载玻片(22mm22mm)中并在室温下用甲醇固定 20分钟。 使用无菌PBS将细菌悬浮液调节至OD 6000.3 (3.010 8CFU/mL)的终浓度。 将 200 L细菌悬浮液均匀涂布在涂有粘液的载玻片上， 然后在28下孵育2小时， 用PBS洗涤三 次。 用4甲醇固定细菌30分钟， 。

12、细菌用1结晶紫染色3分钟。 然后在光学显微镜( 1000) 下检查载玻片， 选择20个显微镜视野， 计数细菌。 无菌PBS用作阴性对照， 对照菌株 V.harveyi用作阳性对照。 每组进行三次试验。 0040 粘附实验结果： 野生株粘附量为1081 .22cells/field of view， 沉默株为 458.67cells/field of view。 如图2所示。 0041 实施例4运动性实验 0042 将过夜培养的哈维氏弧菌在LB中调节至OD6000.3， 将1 L悬浮液滴加到LB平板 (0.3琼脂)上， 并将平板在28温育24小时， 对照菌株 V.harveyi用作阳性对照。 测。

13、量菌 落直径。 每组进行三次独立的生物学重复。 0043 运动性结果： 野生株菌落直径22.17mm， 沉默株为12.36mm。 如图3所示。 0044 实施例5鞭毛合成能力实验 0045 用透射电子显微镜观察哈维氏弧菌鞭毛。 将野生型哈维氏弧菌及flrB 基因沉默 株， 进行三次纯化培养， 使用无菌牙签轻轻刮取平板上的菌落， 并重悬于无菌PBS中， 将铜网 置于菌悬液中5min， 转移到2.5戊二醛中固定 5min， 用去离子水清洗铜网两次， 于1钨 酸中染色1min， 自然干燥， 用透射电子显微镜观察细菌鞭毛。 每个样品随机选择6个图像并 使用Osiris 4.0 软件测量鞭毛长度。 每组。

14、进行三次独立的生物学重复。 0046 野生株的鞭毛长度为4.77 m， 沉默株为2.49 m。 如图4所示。 0047 由实施例2-5可以看出， 粘附实验结果中， 沉默株能力下降， 其余均为与粘附相关 的功能， 沉默株能力也同时下降了。 其中鞭毛合成能力实验中， 由于flrb基因是鞭毛基因， 沉默株鞭毛合成能力降低， 说明沉默结果可信， 此外， 鞭毛是细菌的运动器官， 可以调节粘 附能力， 鞭毛缺失导致粘附能力等其他功能的下降。 以上均说明了本发明的哈维氏弧菌 flrB基因沉默株能有效降低哈维氏弧菌粘附能力， 可用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫 苗。 0048 虽然以上描述了本发明的具体实施方式， 但是熟悉本技术领域的技术人员应当理 解， 我们所描述的具体的实施例只是说明性的， 而不是用于对本发明的范围的限定， 熟悉本 领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化， 都应当涵盖在本发明的 权利要求所保护的范围内。 说明书 3/3 页 5 CN 110938578 A 5 图1 图2 说明书附图 1/2 页 6 CN 110938578 A 6 图3 图4 说明书附图 2/2 页 7 CN 110938578 A 7 。