关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911260926.3 (22)申请日 2019.12.10 (71)申请人 昆明医科大学第一附属医院 地址 650032 云南省昆明市西昌路295号 (72)发明人 李彦林贾笛韩睿杨龄坚 蔡国锋王国梁宋恩 (74)专利代理机构 昆明正原专利商标代理有限 公司 53100 代理人 金耀生于洪 (51)Int.Cl. A61K 38/12(2006.01) A61K 9/06(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A。

2、61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称 一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温 敏型凝胶及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种关节腔注射治疗骨关节炎 的TN14003温敏型凝胶及其制备方法， 属于骨关 节炎治疗技术领域。 该方法首先将壳聚糖以 0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解， 得到壳聚糖溶 液； 再将-甘油磷酸钠以PBS液溶解， 得到-甘 油磷酸钠溶液； 在冰浴下， 将-甘油磷酸钠溶液 逐滴滴加到壳聚糖溶液中， 充分搅拌均匀， 并采 用NaOH调节pH， 得到壳聚糖/-甘油磷酸钠溶 。

3、液； 将TN14003粉末添加到壳聚糖/-甘油磷酸 钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/- 甘油磷酸钠混合液。 本发明方法制备的温敏型凝 胶内部可形成稳定、 均匀的三维网络空间结构， TN14003可均匀分布在网络结构的孔洞内， 可长 效、 恒定释放药物， 满足了单次注射后可长效维 持治疗作用的效果。 权利要求书1页 说明书12页 附图12页 CN 110935008 A 2020.03.31 CN 110935008 A 1.一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 其特征在于， 包括 如下步骤： 步骤 （1） ， 将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌。

4、溶解， 得到壳聚糖溶液； 步骤 （2） ， 将 -甘油磷酸钠以PBS液溶解， 得到 -甘油磷酸钠溶液； 步骤 （3） ， 在冰浴下， 将步骤 （2） 得到的 -甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤 （1） 得到的壳 聚糖溶液中， 充分搅拌均匀， 并采用NaOH调节pH， 得到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液； 步骤 （4） ， 将TN14003添加到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳 聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 2.根据权利要求1所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 其特征在于， TN14003的添加量为0.8-1.2mg/ml。 3.根据权利要求1。

5、所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 其特征在于， TN14003的添加量为1mg/ml。 4.根据权利要求1所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 其特征在于， 所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2-2.4%， -甘油磷酸钠溶液质量浓度为55- 57%， 壳聚糖溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为4.5-5.5:1， 采用0.018-0.022 mol/l的NaOH 溶液调节pH至7.0。 5.根据权利要求4所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 其特征在于， 所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.2%， -甘油磷酸钠溶液。

6、质量浓度为56%， 壳 聚糖溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为5:1， 采用0.02 mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。 6.根据权利要求1或4所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方 法， 其特征在于， 所述的TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液在37下形成TN14003温敏型 凝胶。 7.权利要求15任意一项所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制 备方法制得的TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 8.权利要求7所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法制得 的TN14003温敏型凝胶。 权利要求书 1/1。

7、 页 2 CN 110935008 A 2 一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶及其制 备方法 技术领域 0001 本发明属于骨关节炎治疗技术领域， 具体涉及一种关节腔注射治疗骨关节炎的 TN14003温敏型凝胶及其制备方法。 背景技术 0002 近年来， 随着世界人口老龄化加速及体育运动兴盛， 导致全身关节尤其是膝关节 骨关节炎发病率日益剧增。 膝关节骨关节炎(Osteoarthritis， OA)是一类以软骨退变伴随 滑膜组织炎症为主要特征的慢性退变性疾病。 由于发病原因的复杂及软骨退变的不可逆 性， 膝关节OA的治疗一直充满挑战。 0003 传统的给药途径有口服非甾体类消。

8、炎镇痛药或关节腔注射透明质酸钠及糖皮质 激素等。 口服给药常经过胃肠代谢， 且由于 “首过效应” 的影响， 使得药物到达靶器官处已难 以维持治疗所需浓度。 而关节腔注射透明质酸钠或糖皮质激素往往单次应用后不能达到治 疗剂量， 需要反复多次给药， 给患者带来沉重的精神、 生理创伤及经济负担； 同时传统的关 节腔注射药物并不能起到抑制关节软骨退变的作用。 因此， OA一旦发生， 传统的给药方式已 难以逆转， 仅仅在于缓解临床症状。 0004 我们前期实验研究表明， 基质细胞衍生因子1(SDF-1)/趋化因子受体4(CXCR4)信 号通路启动后能介导关节软骨退变， 启动及加速OA发展。 TN1400。

9、3为高效的CXCR4拮抗剂， 可 靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路形成， 抑制软骨细胞分泌基质金属蛋白酶并延缓软骨细胞 外基质降解， 可有效延缓关节软骨退变， 我们前期的动物实验是在Duncan-Hartley豚鼠背 部置入皮下泵将TN14003长期泵入体内起到治疗OA的作用。 该方法虽然证实了TN14003的良 好效果， 但这种皮下泵入的方式不适用于临床应用及推广， 且单次给药不能满足OA治疗的 需求， 而反复给药除了加剧患者经济及精神、 生理负担外， 成倍积累的药物毒副作用也限制 了该药的推广应用。 目前， TN14003的应用是将其溶于PBS液后体内给药， 该制备药物方式单 一， 。

10、药物在动物体内衰退较快， 需反复多次给药才能达到药物治疗效果。 但成倍给药给动物 带来的损伤往往难以估计， 阻碍该药物的临床推广。 因此如何克服现有技术的不足是目前 骨关节炎治疗技术领域亟需解决的问题。 发明内容 0005 本发明的目的是针对当前膝关节OA传统给药途径不能满足长效治疗作用的不足， 提供一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶及其制备方法， 该TN14003温敏型 凝胶为一种关节腔注射缓释制剂， 能为临床获得安全、 高效的关节腔内靶向递药系统。 0006 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下： 0007 一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备。

11、方法， 包括如下步骤： 0008 步骤(1)， 将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解， 得到壳聚糖溶液； 0009 步骤(2)， 将 -甘油磷酸钠以PBS液溶解， 得到 -甘油磷酸钠溶液； 说明书 1/12 页 3 CN 110935008 A 3 0010 步骤(3)， 在冰浴下， 将步骤(2)得到的 -甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到 的壳聚糖溶液中， 充分搅拌均匀， 并采用NaOH调节pH， 得到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液； 0011 步骤(4)， 将TN14003添加到壳聚糖/-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到 TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 0012 进。

12、一步， 优选的是， TN14003的添加量为0.8-1.2mg/ml。 0013 进一步， 优选的是， TN14003的添加量为1mg/ml。 0014 在使用时， 按照实际应用目标的需要接受的药量对添加量做相应的调整。 0015 进一步， 优选的是， 所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2-2.4， -甘油磷酸钠溶液 质量浓度为55-57， 壳聚糖溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为4.5-5.5:1， 采用0.018- 0.022mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。 0016 进一步， 优选的是， 所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.2， -甘油磷酸钠溶液质 量浓度为56， 壳聚糖溶液与 -甘油磷酸。

13、钠溶液体积比为5:1， 采用0.02mol/l的NaOH溶液 调节pH至7.0。 0017 进一步， 优选的是， 所述的TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液在37下形成 TN14003温敏型凝胶。 0018 本发明同时提供上述关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法 制得的TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 0019 本发明同时提供上述关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法 制得的TN14003温敏型凝胶。 0020 本发明为获得单次药物注射后发挥长效治疗作用， 最大化降低药物毒副作用， 本 申请发明以壳聚糖及 -甘油磷酸钠为原料制备了具。

14、有温度敏感效应的可供关节腔注射的 TN14003凝胶， 结果发现， 该凝胶在室温下为液态， 便于注射操作， 当注射到动物体内且温度 升高至37时液态可迅速转变为半固体凝胶状。 经扫描电镜观察后发现该凝胶内部形成了 具有均匀孔隙且相互连接紧密而有序的三维网络结构， TN14003均匀地分布在各个孔隙内， 经体外缓释实验表明制备的凝胶可长效、 恒定释放TN14003。 将携载TN14003的凝胶溶液关 节腔注射到滇南小耳猪膝关节中， 结果发现TN14003温敏型凝胶较单独TN14003注射具有更 好的延缓关节软骨退变及抑制滑膜组织炎症的效果， 且作用时间更长。 0021 本发明与现有技术相比， 其。

15、有益效果为： 0022 1.本方法基于壳聚糖与 -甘油磷酸钠制备具有温度敏感特性的凝胶制剂， 该制剂 在室温下为液态， 便于注射， 注射到动物体内37环境下可迅速转变为半固体凝胶状， 发挥 缓释药效的同时还能避免药物浓度过高引起毒性反应。 0023 2.本方法可将TN14003携载于凝胶内注射到关节腔， 既保持TN14003抑制软骨退变 的作用， 又能发挥壳聚糖凝胶本身发挥润滑关节的效果。 0024 3.本方法制备的温敏型凝胶内部可形成稳定、 均匀的三维网络空间结构， TN14003 可均匀分布在网络结构的孔洞内， 可长效、 恒定释放药物， 满足了单次注射后可长效维持治 疗作用的效果。 002。

16、5 本研究结果皆表明在相同时间内TN14003温敏型凝胶较单独使用TN14003具有更 好的抑制软骨退变及抑制滑膜炎症效果； 同时TN14003温敏型凝胶较单独使用TN14003具有 更长的作用时效。 说明书 2/12 页 4 CN 110935008 A 4 附图说明 0026 图1空白凝胶电镜图像； 0027 图2携载TN14003后的凝胶电镜图像； 0028 图3TN14003在温敏型凝胶及PBS液内的释放曲线； 0029 图4TN14003温敏型凝胶注射前后注射部位未见异常变化； 其中， A为注射前； B为注 射后； 0030 图5膝关节腔大体观察； 0031 其中， A1： 1月A组。

17、， B1： 1月B组， C1： 1月C组， D1： 1月D组， A2： 2月A组， B2： 2月B组， C2： 2 月C组， D2： 2月D组， A3： 3月A组， B3： 3月B组， C3： 3月C组， D3： 3月D组 0032 图6膝关节软骨HE染色； 0033 其中， A1： 1月A组， B1： 1月B组， C1： 1月C组， D1： 1月D组， A2： 2月A组， B2： 2月B组， C2： 2 月C组， D2： 2月D组， A3： 3月A组， B3： 3月B组， C3： 3月C组， D3： 3月D组 0034 图7膝关节软骨番红O染色； 0035 其中， A1： 1月A组， B1：。

18、 1月B组， C1： 1月C组， D1： 1月D组， A2： 2月A组， B2： 2月B组， C2： 2 月C组， D2： 2月D组， A3： 3月A组， B3： 3月B组， C3： 3月C组， D3： 3月D组； 0036 图8膝关节软骨Col免疫组化染色； 0037 其中， A1： 1月A组， B1： 1月B组， C1： 1月C组， D1： 1月D组， A2： 2月A组， B2： 2月B组， C2： 2 月C组， D2： 2月D组， A3： 3月A组， B3： 3月B组， C3： 3月C组， D3： 3月D组； 0038 图9四组滑膜组织内SDF-1含量； 0039 图10四组滑膜组织内I。

19、L-1 含量； 0040 图11四组软骨内MMP-3 mRNA含量； 0041 图12四组软骨内MMP-13 mRNA含量； 0042 图13四组软骨内Col mRNA含量； 0043 图14四组软骨内ACAN mRNA含量； 0044 图15四组软骨内Col蛋白含量电泳图； 0045 图16四组软骨内Col蛋白含量直方图。 具体实施方式 0046 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。 0047 本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发 明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。 所用材料。

20、或设备未注明生产厂商者， 均为可以通过购买获得的 常规产品。 0048 实施例1 0049 一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0050 步骤(1)， 将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解， 得到壳聚糖溶液； 0051 步骤(2)， 将 -甘油磷酸钠以PBS液溶解， 得到 -甘油磷酸钠溶液； 0052 步骤(3)， 在冰浴下， 将步骤(2)得到的 -甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到 的壳聚糖溶液中， 充分搅拌均匀， 并采用NaOH调节pH， 得到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液； 说明书 3/12 页 5 CN 110935008 A 5。

21、 0053 步骤(4)， 将TN14003添加到壳聚糖/-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到 TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 0054 TN14003的添加量为1.2mg/ml。 0055 所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.4， -甘油磷酸钠溶液质量浓度为57， 壳聚 糖溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为5.5:1， 采用0.018-0.022mol/l的NaOH溶液调节pH至 7.0。 0056 所述的TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液在37下形成TN14003温敏型凝胶。 0057 实施例2 0058 一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 包括如。

22、下步骤： 0059 步骤(1)， 将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解， 得到壳聚糖溶液； 0060 步骤(2)， 将 -甘油磷酸钠以PBS液溶解， 得到 -甘油磷酸钠溶液； 0061 步骤(3)， 在冰浴下， 将步骤(2)得到的 -甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到 的壳聚糖溶液中， 充分搅拌均匀， 并采用NaOH调节pH， 得到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液； 0062 步骤(4)， 将TN14003添加到壳聚糖/-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到 TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 0063 TN14003的添加量为0.8mg/ml。 0064 所述的壳聚糖溶液的质量。

23、浓度为2， -甘油磷酸钠溶液质量浓度为55， 壳聚糖 溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为4.5:1， 采用0.018mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。 0065 所述的TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液在37下形成TN14003温敏型凝胶。 0066 实施例3 0067 一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0068 步骤(1)， 将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解， 得到壳聚糖溶液； 0069 步骤(2)， 将 -甘油磷酸钠以PBS液溶解， 得到 -甘油磷酸钠溶液； 0070 步骤(3)， 在冰浴下， 将步骤(2)得到的 。

24、-甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到 的壳聚糖溶液中， 充分搅拌均匀， 并采用NaOH调节pH， 得到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液； 0071 步骤(4)， 将TN14003添加到壳聚糖/-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到 TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液。 0072 TN14003的添加量为1mg/ml。 0073 所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.2， -甘油磷酸钠溶液质量浓度为56， 壳聚 糖溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为5:1， 采用0.02mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。 0074 所述的TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液在37下形成TN14003温敏型。

25、凝胶。 0075 应用实例 0076 (1)原料的准备 0077 壳聚糖(壳聚糖， 美国Sigma-Aldrich)； -甘油磷酸钠( -甘油磷酸钠， 美国Sigma- Aldrich)； TN14003冻干粉(北京中科亚光生物科技有限公司)、 磷酸盐缓冲液(美国 Hyclone)、 盐酸(烟台三和化学试剂有限公司)、 氢氧化钠(烟台三和化学试剂有限公司)。 0078 (2)温敏型凝胶配制 0079 天平称取适量壳聚糖粉末并以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解， 获得壳聚糖溶 液。 称取适量的 -甘油磷酸钠粉末并以PBS液溶解后获得 -甘油磷酸钠溶液。 在冰浴下将 - 说明书 4/12 页 。

26、6 CN 110935008 A 6 甘油磷酸钠溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中充分搅拌均匀后即制备成为空白温敏型凝胶溶 液。 0080 (3)温敏型凝胶初始胶凝温度测定 0081 取2ml制备好的空白温敏型凝胶溶液加入到5ml EP管内并放入初始温度为20的 恒温水浴箱， 保持EP管下部装有凝胶溶液的部分低于水面至少2cm， 每隔5min上调水浴箱温 度1， 观察EP管内空白凝胶溶液相变情况。 使用倒置法确定溶液转变为凝胶， 即将EP管倒 置于桌面至少10min， 当溶液不再流动说明空白凝胶溶液完全转变为凝胶， 此时水浴箱内的 温度即胶凝所需最低温度。 0082 (4)影响成胶温度的因素观察 00。

27、83 pH值对成胶温度的影响 0084 取质量浓度为2.0的壳聚糖溶液， 以壳聚糖与 -甘油磷酸钠体积比为7:1的比例 滴入的 -甘油磷酸钠溶液， 冰浴条件下充分搅拌后制备成为空白温敏型凝胶溶液， 分为6 份， 每份均2ml。 使用氢氧化钠调节每份凝胶溶液的pH值， 使其pH值分别为6.6、 6.8、 7.0、 7.2、 7.4、 7.6。 将6份凝胶溶液置入水浴锅内， 观察凝胶形成情况及记录成胶温度， 实验重复 3次。 结果发现当体系内pH值调节为6.6及6.8时， 观察不到溶液成胶： 当pH值上升到7.0时， 溶液可转变为凝胶， 成胶温度为37.6； 当pH值调节为7.2时， 溶液的成胶温。

28、度为37.2； 当 pH值升至7.4时， 32时便转变为凝胶； pH值再次上调至7.6时， 溶液不成胶， 而直接出现白 色絮状沉淀(见表1)。 0085 表1 pH值对成胶温度的影响 0086 pH值6.66.87.07.27.47.6 成胶温度/不成胶不成胶37.637.232.0沉淀 0087 壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例对成胶温度的影响 0088 取浓度为2.2的壳聚糖溶液5份， 分别滴加不同比例的质量浓度为56 -甘油磷 酸钠溶液， 使每份混合液内壳聚糖与 -甘油磷酸钠体积比分别为8:1、 7:1、 6:1、 5:1、 4:1， NaOH调节混合液pH为7.0， 在冰浴条件下充分搅拌后，。

29、 将5份混合液置入恒温水浴箱内， 观察 凝胶形成情况及成胶温度， 实验重复3次。 结果发现当壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例为8:1时， 成胶温度为34.5， 溶液内杂质较多， 且溶液较粘稠； 当壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例为7:1 时， 成胶温度为35； 当壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例为6:1时， 成胶温度为36.8； 当壳聚糖 与 -甘油磷酸钠比例为5:1时， 成胶温度为37.3； 当壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例为4:1时， 成胶温度为44， 说明壳聚糖与 -甘油磷酸钠最佳比例为5:1(见表2)。 0089 表2壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例对成胶温度的影响 0090 壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例8:17:。

30、16:15:14:1 成胶温度/34.53536.837.344 0091 壳聚糖浓度对成胶温度的影响 0092 分别称取180mg、 200mg、 220mg、 240mg的壳聚糖粉末， 加入一定量0.1mol/L的稀盐 酸配制为浓度为1.8、 2.0、 2.2、 2.4的壳聚糖溶液， 在各自壳聚糖溶液内分别加入 相同比例的质量浓度为56 -甘油磷酸钠溶液， 壳聚糖溶液与 -甘油磷酸钠溶液体积比为 5:1， 用NaOH将pH值调节为7.0， 将各组混合液在冰浴条件下充分搅拌均匀后， 置入恒温水浴 箱内， 观察凝胶形成情况及记录成胶温度， 实验重复3次。 结果发现当壳聚糖浓度为1.8 说明书 。

31、5/12 页 7 CN 110935008 A 7 时， 溶液较稀疏， 体系不形成凝胶； 当壳聚糖浓度为2.0时， 溶液在37.5时转变为凝胶； 当壳聚糖浓度为2.2时， 溶液在37时成胶； 当壳聚糖浓度为2.4时， 溶液在35时可形 成凝胶， 但溶液过于粘稠， 流动性较差， 表明壳聚糖的最佳浓度为2.2时， 溶液在37时成 胶(见表3)。 0093 表3壳聚糖浓度对成胶温度的影响 0094 壳聚糖浓度/1.82.02.22.4 成胶温度/不成胶37.537.035.0 0095 (5)正交设计优化壳聚糖/ -甘油磷酸钠温敏型凝胶制备方法 0096 为了更加科学、 准确地反映各种因素对凝胶成胶。

32、的影响及制备出更稳定的温度敏 感型凝胶， 我们采用正交实验对各影响因素进行筛选， 以优化凝胶制备的方法。 本实验期望 制备出关节腔内注射后可在接近体温(37)的温度条件下凝胶形成的复合凝胶制剂， 因此 我们以37为预期标准温度对正交实验结果进行筛选， 结果各个因素水平极值偏离37越 小越优先选取。 按照正交设计的原则考察pH值、 壳聚糖与 -甘油磷酸钠比例及壳聚糖浓度 对凝胶溶液成胶特性的影响。 每个因素选3个水平， 按照正交实验表L9(33)核对安排实验， 每 个处方各做3次实验， 以成胶温度为评价指标， 因素水平见表4。 从正交分析结果中可看到， 本实验三个因素的R值排列顺序为CAB， 说。

33、明壳聚糖浓度对37凝胶形成影响最大。 而各 因素水平分析结果为： A1A2A3； B： B3B2B1； C： C2C1C3， 表明最佳制备处方为A1B3C2， 即 pH值为7.0， 壳聚糖与 -甘油磷酸钠体积比为5： 1， 壳聚糖浓度为2.2(表5)。 0097 表4成胶影响因素 0098 0099 表5正交实验结果 0100 说明书 6/12 页 8 CN 110935008 A 8 0101 0102 (5)TN14003温敏型凝胶结构特征 0103 以优化后的方法配制壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液在37下形成空白温敏凝胶， 将 TN14003粉末添加到壳聚糖/ -甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得。

34、到TN14003/壳聚糖/ -甘油 磷酸钠混合液在37下形成空白温敏凝胶获得载药温敏凝胶， 将两组凝胶样本置于液氮中 冷冻5min； 将预冻好的两组样本装入5ml离心管内， 并以锡箔纸覆盖管口； 在覆盖管口的锡 箔纸表面打几个小孔后将离心管放于超低温冷冻干燥机内冻干48h； 取出冻干后的样本， 将 其切成小块后用导电胶粘到扫描支架上； 对样本小块真空喷金300s后放于电子显微镜下观 察凝胶内部结构。 扫描电镜显示无论空白凝胶还是载药凝胶都具有稳定的网络构架， 孔隙 排列均匀、 规则。 扫描电镜可见携载药物后并未影响凝胶的网络结构， 能看到药物均匀分布 于孔洞内， 为药物在凝胶内缓慢释放提供了可。

35、能(见图1、 图2)。 0104 (6)TN14003凝胶体外缓释性能TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠凝胶制备： 以最佳 工艺条件制备TN14003温敏型凝胶溶液(TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液， TN14003的 浓度为1mg/ml)， 将其充分混匀后备用； 0105 TN14003溶液制备： 室温下将1mgTN14003冻干粉溶解于PBS液内备用， 制备成为 1mg/ml TN14003纯溶液。 0106 分别将TN14003/壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液及TN14003纯溶液注入透析袋中， 透析袋封口； 0107 将透析袋置入装有25ml PBS液的恒温振荡器内， 调整。

36、温度至37， 观察待 TN14003壳聚糖/ -甘油磷酸钠混合液成胶后以60r/min转速匀速振荡； 0108 分别于第1至14天内每天定点取5ml PBS液， 同时补充相应溶剂的PB S液(每批 样本取3个样， 即实验重复3次)； 说明书 7/12 页 9 CN 110935008 A 9 0109 收集所有取出的溶出介质过0.45 m水系滤器后转入液相瓶内备HPLC检测用； 0110 样品手收集完毕后， 使用高效液相色谱法(High Performance Liquid Ch romatography， HPLC)检测溶出介质内TN14003的浓度并计算不同时间点两组样品内 TN14003。

37、的累计释放率(表6)； HPLC条件见表7。 0111 色谱参数 0112 柱子： thermo synchronis 250*4.6mm， 4.6um 0113 流动相： A： 0.05三氟乙酸， 2乙腈 0114 B： 0.05三氟乙酸， 90乙腈 0115 流速： 1ml/min 0116 柱温： 25 0117 分析时间： 20min 0118 洗脱模式： 梯度 0119 流动相配制 0120 (1)A相： 分别量取250 L三氟乙酸、 10mL色谱级乙腈于500mL容量瓶中， 用超纯水定 容至刻度线， 摇晃后充分混匀。 将配制好的溶液经0.22 m滤器过滤后转移至500mL无菌蓝盖 。

38、瓶内， 在超声仪内以35000HZ、 100功率、 20下超声30min后使用； 0121 (2)B相： 分别量取250 l三氟乙酸、 450mL色谱级乙腈于500mL容量瓶中， 用超纯水 定容至刻度线， 摇晃后充分混匀。 将配制好的溶液经0.22 m滤器过滤后转移至500mL无菌蓝 盖瓶内， 超声仪内以35000HZ、 100功率、 20下超声30min后使用； 0122 表6壳聚糖/ -甘油磷酸钠凝胶及TN14003纯溶液对TN14003的累积释放率 0123 说明书 8/12 页 10 CN 110935008 A 10 0124 0125 表7 HPLC设置条件 0126 0127 绘。

39、制时间-药物释放率曲线， 对壳聚糖/ -甘油磷酸钠凝胶内及单纯药物溶液相 同时间释放的TN14003含量进行比较， 平行实验重复三次。 0128 实验结果发现壳聚糖/ -甘油磷酸钠组的TN14003仅在24h释放相对较快， 释放了 17， 随后便进入缓慢释放期， 直到第14天才释放70， 之后便缓慢进入平台期； 而TN14003 纯溶液组在24h便释放到40， 随后第2、 3、 4天则分别释放了50、 62及81， 之后进入平 台期， 释放曲线见图3。 0129 (7)TN14003温敏型凝胶关节腔注射抑制滇南小耳猪膝关节软骨退变研究 0130 选取36只经前期造模建立的右膝关节骨关节炎成年滇。

40、南小耳猪作为研究对象。 将猪平均分为A、 B、 C、 D四组： TN14003温敏型凝胶组(A组)、 TN14003组(B组)、 空白凝胶组(C 组)及空白对照(D组)。 TN14003凝胶组给予右膝关节腔注射2ml TN14003/壳聚糖/ -甘油磷 酸钠溶液， TN14003组给予右膝关节腔注射2ml TN14003溶液， 空白凝胶组给予2ml壳聚糖/ 说明书 9/12 页 11 CN 110935008 A 11 -甘油磷酸钠溶液， 空白对照组不给予任何处理， 各组常规饲养。 0131 每组进行相应处理后观察猪的全身情况， 包括精神、 饮食、 毛色、 大小便、 活动情 况及注射部位局部表。

41、现。 结果发现所有动物在关节腔注射后精神、 饮食、 毛色、 大小便及活 动情况较注射前无明显改变， 注射部位未出现明显肿胀、 发红、 破溃、 感染等征象(图4)。 0132 每组在注射后1月、 2月及3月时各时间点随机抽取3只猪处死， 暴露膝关节腔并 依次观察滑膜充血、 水肿情况、 股骨髁及胫骨平台颜色、 质地， 以及软骨表面有无粗糙、 划痕 或缺损。 结果发现A组及B组注射后1月关节腔内无明显滑膜充血表现， 股骨髁表面光滑， 无 明显软骨退变及损伤表现； 注射后2月， A组软骨平滑， 无明显滑膜充血表现， 而B组股骨髁软 骨表面虽无明显退变及损伤表现， 但软骨周围覆盖大量充血滑膜组织； 注射。

42、后3月时A组软 骨依旧保持平滑， 仅颜色部分变暗， 提示轻度退变， 而B组股骨髁软骨颜色变暗， 滑车沟表面 软骨明显破坏。 C组注射后1月时关节腔内未见明显充血的滑膜组织， 股骨内外髁无明显破 坏， 股骨滑车沟表面软骨颜色变暗； 注射后2月时股骨髁及滑车沟软骨表面有少量充血滑膜 覆盖， 滑车沟表面有轻度软骨破坏， 但股骨髁软骨无明显改变； 注射后3月时可见充血滑膜 组织覆盖于软骨表面， 股骨内外髁及滑车沟表面可见部分软骨颜色变暗及划痕。 D组注射后 1月时滑膜组织充血， 股骨内髁负重面软骨表层部分缺失， 软骨下骨未完全暴露； 注射后2月 时滑膜充血， 除股骨内髁负重面明显软骨缺损外， 股骨滑车。

43、沟也可见软骨缺失； 注射后3月 时股骨内外髁及股骨滑车沟皆可见大面积软骨破坏， 软骨下骨外露， 充血的滑膜爬行覆盖 在股骨髁及滑车沟表面(图5)。 0133 分别在饲养至注射后1月、 2月及3月时， 每个组在每个时间点随机抽取3只猪， 采 用3戊巴比妥钠耳缘静脉注射处死， 同法暴露膝关节腔后取股骨内髁及内侧胫骨平台负 重面软骨组织(包含表层软骨及部分软骨下骨)， 放入4多聚甲醛中保存以进行组织学染 色(HE染色、 番红O染色及Col免疫组化染色)。 0134 1.HE染色结果发现： A组与B组注射后1月时软骨表面光滑， 细胞排列正常， 染色均 匀， 潮线完整， 软骨下骨结构正常； 注射后2月时。

44、A组软骨表面依旧光滑， 细胞排列整齐， 染色 均匀， B组软骨表面轻度粗糙， 细胞数量增加， 染色不均匀， 排列稍紊乱； 注射后3月时A组软 骨表面轻度粗糙， 细胞数量增加， 潮线及软骨下骨完整， B组软骨表面明显粗糙， 细胞数量减 少。 C组注射后1月时软骨表面光滑， 细胞排列正常， 染色均匀， 潮线完整， 软骨下骨结构正 常； 注射后2月时软骨表面粗糙， 细胞数量增加， 染色不均匀， 排列稍紊乱； 注射后3月时软骨 表面部分缺失， 细胞数量减少， 潮线不完整。 D组1月软骨表面轻度粗糙， 软骨细胞排列相对 正常， 染色均匀， 潮线完整， 软骨下骨结构正常； 2月时软骨表面粗糙， 细胞排列紊。

45、乱， 染色不 均匀， 细胞数量增加， 潮线完整， 软骨下骨结构正常； 注射后3月时软骨表面大面积缺损， 软 骨细胞数量明显减少， 潮线破坏， 软骨下骨外露(图6)。 0135 2.番红O染色显示： A组与B组注射后1月时软骨对番红亲和较高， 软骨表面光滑， 细 胞排列正常； 注射后2月时A组软骨表面依旧光滑， 对番红亲和力高， 细胞排列整齐， 而B组软 骨表面轻度粗糙， 对番红亲和力降低， 细胞数量增加， 排列稍紊乱； 注射后3月时A组软骨表 面轻度粗糙， 对番红亲和力仍高， 细胞数量增加， B组软骨表面明显粗糙， 对番红亲和力稍降 低， 细胞数量减少。 C组注射后1月时软骨对番红亲和力较高，。

46、 表面光滑， 软骨细胞排列正常； 注射后2月时软骨表面粗糙， 对番红亲和力降低， 软骨细胞数量增加， 排列稍紊乱； 注射后3 月时软骨对番红亲和力明显降低， 软骨表面部分缺失， 细胞数量减少。 D组1月时软骨对番红 说明书 10/12 页 12 CN 110935008 A 12 亲和力高， 软骨表面轻度粗糙， 软骨细胞排列相对正常； 2月时软骨对番红亲和力稍降低， 软 骨表面粗糙， 细胞排列紊乱， 细胞数量增加； 3月时软骨对番红亲和力明显降低， 软骨表面明 显缺损， 软骨细胞数量显著减少(图7)。 0136 3.Col免疫组化染色结果发现： 注射后1月时A、 B、 C组软骨表面光滑， A、。

47、 B组Col 染色明显较其它两组深， D组软骨表面轻度粗糙。 注射后2月时A、 B两组Col染色仍较深， 而 C、 D组软骨表面粗糙， Col染色变淡。 注射后3月时， A组软骨表面轻度粗糙， Col染色在四 组中最深， B组软骨表面粗糙， Col染色较2月时明显减弱， C组软骨表面更加粗糙， 而D组软 骨表面出现明显缺损， C、 D两组Col染色进一步减弱。 0137 分别在饲养至注射后1月、 2月及3月时， 每个组每个时间点随机抽取3只猪， 切取 下股骨内髁周围的滑膜组织， ELSIA实验检测IL-1 及SDF-1含量， 结果发现： 0138 1.随着时间增加， 四组滑膜组织内SDF-1含。

48、量均发生变化。 A组与B组SDF-1含量随 时间增加逐渐下降； 到3月时都降到最低， 此时A组内SDF-1含量在四组中最低。 C组与D组内 SDF-1含量都随时间增加逐渐增加， 到3月含量达最高， 此时D组SDF-1含量在四组内最高； 0139 2.随观察时间延长， 四组滑膜组织内IL-1 含量均发生变化。 A组与B组内IL-1 含 量随时间增加逐渐下降， 第3月时A组内IL-1 含量在四组中最低。 C组与D组内IL-1 含量随 时间延长逐渐增加， 3月时含量上升至最高， 此时D组IL-1 含量在四组内最高(图8)。 0140 分别在饲养至注射后1月、 2月及3月时， 每个组在每个时间点随机抽。

49、取3只猪， 采 用3戊巴比妥钠耳缘静脉注射处死， 取关节软骨周围滑膜组织ELISA检测SDF-1及IL-1 含 量后发现： 0141 1.随着时间增加， 四组滑膜组织内SDF-1含量均发生变化。 空白组及空白凝胶组 SDF-1含量都随时间增加逐渐增加， 到3月含量达最高， 此时空白组SDF-1含量在四组内最 高； TN4003组及TN4003凝胶组SDF-1含量随时间增加逐渐下降； 到3月时都降到最低， 而 TN14003凝胶组内SDF-1含量在四组中最低(图9)； 0142 2.随观察时间增加， 四组滑膜组织内IL-1 含量均发生变化。 空白组及空白凝胶组 IL-1 含量随时间增加逐渐增加，。

50、 3月时含量上升至最高， 而空白组IL-1 含量在四组内最 高。 TN4003组及TN4003凝胶组IL-1 含量随时间增加逐渐下降， 第3月时， TN14003凝胶组内 IL-1 含量在四组中最低(图10)； 0143 分别在饲养至注射后1月、 2月及3月时， 每个组在每个时间点随机抽取3只猪， 采 用3戊巴比妥钠耳缘静脉注射处死， 同法暴露膝关节腔后取股骨内髁及内侧胫骨平台表 层软骨并分为两组， 一组放入放入干燥管内用于后续western blot检测， 一组置于 RNAstore保存液中用于后续qRT-PCR检测。 结果发现： 0144 1.随时间延长， A组与B组内MMP-3mRNA含。