基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911315346.X (22)申请日 2019.12.19 (71)申请人 武汉中帜生物科技股份有限公司 地址 430075 湖北省武汉市东湖技术开发 区高新大道858号生物医药园A6-2栋 (72)发明人 李先强姜昕厉洁黄永伟 陈巨龚丽君 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 42222 代理人 彭劲松 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/682(2018.0。

2、1) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞 病毒、 副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于双扩增技术联合检 测呼吸道合胞病毒、 副流感病毒及腺病毒的试剂 盒及其应用。 将采集的样本经细胞裂解液裂解后 释放病原体核酸， 经过逆转录和转录过程， 实现 病原体核酸片段的扩增。 扩增后的RNA产物加入 到包被有包被探针的微孔中， 同时加入特异探针 及放大探针， 其中包被探针可与特异探针CES的 一端结合固定扩增产物RNA； 特异探针LES的一端 结合到RNA产物上， 另一端与放大探针结合， 实现 信号放大。 本发明。

3、无需RNA提取， 在检测中不易污 染， 灵敏度高、 特异性强， 可广泛用于呼吸道合胞 病毒、 副流感病毒及腺病毒核酸检测。 权利要求书3页 说明书19页 序列表10页 附图2页 CN 110964853 A 2020.04.07 CN 110964853 A 1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、 副流感病 毒及腺病毒核酸的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： 1） 扩增反应液： 含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 12 mM MgCl2， 70 mMKCl， 15% DMSO， 5mM DTT， 每种dNTP各1 mM， 每种NTP各2m。

4、M， 扩增引物各0.2 M， 其中扩增引物包括四组： 呼吸道 合胞病毒， 包括A型和B型、 副流感病毒， 包括1、 2、 3型、 腺病毒， 包括B属、 C属和E属、 和人内参 基因， 具体的： （1） 呼吸道合胞病毒的扩增引物： RSV-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCAAA3 ； RSVA-F引物： 5 TGTTATAGGACTTTCTTT3 ； RSVB-F引物： 5 AGTGACTTCTATGTCTAT3 ； （2） 副流感病毒的扩增引物： PIV1-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGATTGTAA。

5、AAAGCAAGATT3 ； PIV1-F引物： 5 GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3 ； PIV2-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTACTTATT3 ； PIV2-F引物： 5 CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3 ； PIV3-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATCCTG3 ； PIV3-F引物： 5 TCACTTTCTCAGTTAATAT3 ； （3） 腺病毒 （5 -3 ） 的扩增引物： ADV-B属-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAG。

6、ATTCCCGGTCAACGGGTACGA; ADV-B属-F引物： ACCTGAGTCCGGGTCTGGTG; ADV-C属-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATCYTCAGTTCCATGRTT; 其中， Y=T/C； ADV-C属-F引物： TTGCARGACAGAAACACAGAGCT; ADV-E属-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATATCAGCATAAATTACTGTG; ADV-E属-F引物： AGCTTTAAACCCTACTCCGG; （4） 内参基因的扩增引物： 内参-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAG。

7、ACACCAGAGACACTCAGCTAAGAGCA3 ; 内参-F引物： 5 CAGCAGCCGCGGTAATTC3 ; 2） 扩增酶： 包含三种， 逆转录酶、 T7 RNA聚合酶和RnaseH； 优选地， 所述逆转录酶为AMV 或M-MLV； 3） 细胞裂解液： 购至美国Signosis公司， 货号CL-0001； 4） 放大探针： 一种标有生物素的核酸序列， 该探针可以和特异探针的LES系列的一端结 合， 具体序列 （5 -3 ） 为: AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA- Biotin-TAAGCATCGTGCCCT。

8、TTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG； 5） 特异探针： 每个指标特异探针有两种， 分别为CES系列和LES系列， 其中CES系列和LES 系列又可以设计多条， 具体如下： （1） RSVA特异探针序列： RSVA-LES1: 5 TTGACAGATATGATACTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVA-LES2: 5 TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 权利要求书 1/3 页 2 CN 110964853 A 2 RSVA-LES3:5 TTGGGTGATGTGA。

9、ATTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVA-LES4: 5 CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVA-LES5: 5 AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVA-CES: 5 ACTTCTATATCTATTGAGTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； （2） RSVB特异探针序列： RSVB-LES1： 5 TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVB-。

10、LES2： 5 GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVB-LES3： 5 GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； RSVB-CES： 5 TTGACAGATATTATGCTATCTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； （3） PIV1特异探针序列： PIV1-LES1： 5 TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； PIV1-LES2： 5 TAGCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCA。

11、TGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； PIV1-CES： 5 TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； （4） PIV2特异探针序列： PIV2-LES1： 5 TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； PIV2-LES2： 5 CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； PIV2-CES： 5 TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； （5） PIV3特异探针序列： PIV3-L。

12、ES1： 5 GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； PIV3-LES2： 5 AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； PIV3-CES： 5 TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； （6） AdV-B属的特异探针序列： ADV-B -LES1： AAATTTAGAAACCCCACATTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； ADV-B-LES2： GTGGCGCCCACCCACGATTTTT CATGTGAG。

13、AACGCGAACGTGGT3 ； ADV-B-LES3： GTGACCACCGACCGTAGCTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； ADV-B-CES1： GCCCGTGCAACAGACACCTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； ADV-B-CES2： TACTTCAGTATGGGGAACTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； （7） AdV-C属的特异探针序列： ADV-C-LES1： 5 TTTTCYATGTGGAATCAGGCTGTWGTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 其中， W=A/T； ADV-C-LES2： 5。

14、 ACAGCTATGATCCAGATGTYAGAATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； ADV-C-CES： 5 GGTGATAGAACCAGRTAYTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 其中， R=A/G； （8） AdV-E属的特异探针序列： ADV-E-LES1： 5 GCCAGTGGAAGGATGCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； ADV-E-LES2： 5 ACAGCAAAATGCATACCTTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； ADV-E-LES3： 5 TTGGGGTAGCTGCCATGCTT。

15、TTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； ADV-E-CES1： 5 ACAACAGTCTGGCTCCCATTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； ADV-E-CES2： 5 AGGGAGCGCCCAATACCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 权利要求书 2/3 页 3 CN 110964853 A 3 （9） 人内参基因特异探针序列： 内参LES1： 5 AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 内参LES2： 5 TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTG。

16、GT3 ； 内参LES3： 5 TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 内参LES4： 5 ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 内参CES1： 5 AGCTCCAATAGCGTATATTTTT CTGTACGTATGTATGT3 ； 内参CES2： 5 TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 6） 微孔板： 每个微孔中包被包被探针， 该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端 序列互补配对结合， 具体序列 （5 -3 ） 为： 5。

17、 ACATACATACGTACAG3 ； 7） HRP-链霉亲和素酶联物： 标记有链霉亲和素的HRP酶联物， 该酶联物可以和放大探针 上生物素结合； 8） 配制杂交液、 洗液A （5） 、 洗液B （5） 、 封闭液、 底物稀释液， 杂交液： 含0.1% SDS的5 SSC； 洗液A （5） ： 含0.5% SDS的5SSC； 洗液B （5） ： 含0.5% SDS的5PBS； 封闭液： 含 0.5% BSA、 1 PBS； 底物稀释液： 50mM pH8.5 Tris-HCl； 9） 底物： 购至Thermo Fisher， 货号37075的鲁米诺化学发光底物， 遇到HRP酶催化后能 够产生。

18、化学发光信号， 被仪器检测到。 2.权利要求1所述的试剂盒在制备呼吸道合胞病毒、 副流感病毒及腺病毒检测试剂中 的应用。 权利要求书 3/3 页 4 CN 110964853 A 4 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、 副流感病毒 及腺病毒的试剂盒及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物检测技术领域， 具体涉及一种基于双扩增(RNA恒温扩增+多生物 素信号放大)技术联合检测呼吸道合胞病毒、 副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒及其应用。 背景技术 0002 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus， RSV)是单链RNA包膜病毒， 含有 两个亚型A型和B型。。

19、 广泛分布于世界各地， 是引起婴幼儿下呼吸道感染主要的和常见 的病原体， 在绝大部分地区RSV所致的1岁以内婴幼儿的肺炎和支气管炎远远高于其他病原 微生物。 RSV的流行具有季节性， 易于在冬天和早春感染并引起多达5个月的流行期。 我国 每年数千万住院的婴幼儿因RSV感染的占50， 且RSV的再感染率很高， 成人RSV的再感染同 样很常见。 该病毒具有传染性强， 症状与副流感病毒肺炎、 轻流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺 炎在临床上几乎无法区别， 因此， 实验室诊断就显得非常重要。 0003 副流感病毒(Parainfluenza virus， PIV)是单链RNA包膜病毒， 四种亚型各有不同 的临。

20、床和流行病学特征。 1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎， 1型是 儿童喉气管支气管炎的主要原因， 而2型次之。 1型2型均能造成其他的上呼吸道和下呼吸道 疾病。 3型经常导致肺炎和细支气管炎。 4型通常被认为散发存在， 引起的呼吸道症状轻微。 副流感病毒是常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒， 其致病性仅次于呼吸道合胞病毒 (RSV)。 人类副流感病毒的潜伏期一般在17天左右。 0004 腺病毒(Adenovirus， AdV)是一种无包膜的双链DNA病毒， 共有56种血清型， 分A-G 七个亚属， 其中引起呼吸道感染的主要是B、 C、 E亚属， B属感染目前已经成为急性呼吸道。

21、感 染的重要因素。 腺病毒感染呼吸道的典型症状是咳嗽、 鼻塞和咽炎， 同时伴有发热、 寒战、 头 痛和肌肉痛等， 多感染6个月到5岁的儿童， 占儿童呼吸道感染的5到20， 潜伏期一般一 周左右。 一般秋春以呼吸道感染为多， 春、 初夏以合并结膜炎为多。 大多以飞沫传染， 少部分 因粪便接触感染。 病程一般约一周左右， 也有超过一周的。 腺病毒还可引起除呼吸道感染以 外的泌尿道和胃肠道的感染， 症状与其他病原微生物的感染很相似， 根据临床表现很难进 行诊断， 非常有必要进行实验室诊断加以证实。 0005 RSV、 PIV和AdV感染的实验室诊断方法有很多， 一般可以分为实验室分离培养， 免 疫学。

22、技术检测和分子生物学诊断。 分离培养是最传统的检测， 该方法虽然可靠， 但耗时长， 因此使该方法无法在临床上得到有效应用。 免疫学检测主要包括免疫荧光法、 酶联免疫法 和胶体金法等。 免疫学检测方法特异性和灵敏度适中， 简便快捷， 也是现在临床上常用的检 测方法， 但存在难以解决的假阴性假阳性问题。 分子生物学方法主要为荧光PCR法， 可直接 检测核酸， 灵敏度高、 特异性强， 在缩短检测窗口期、 提高病原体检出率方面具有相当的优 势。 但是PCR的方法对硬件设施有一定的要求， 要有专门的PCR诊断实验室、 昂贵的实验仪 器， 不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。 因此， 人们仍然需要寻找一。

23、种操作简单、 快 速、 价格低廉的RSV、 PIV和AdV的诊断方法。 说明书 1/19 页 5 CN 110964853 A 5 发明内容 0006 鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-多 生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、 副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒及其应 用。 该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸， 然后在逆转录酶和 T7RNA 聚合酶的作用下， 经过逆转录和转录过程， 实现病原体核酸片段的扩增。 扩增后的 RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中进行杂交， 同时加入的还有该包被探针对应的特 异探针及放大探针。 其中包被。

24、探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合， CES系列探针的另一端可结合到RNA产物上， 使RNA产物锚定到微孔中； 每个指标的LES系列 探针的一端可结合到RNA产物上， 另一端与放大探针结合， 实现信号放大过程。 标记有多生 物素的放大探针随后与链霉亲和素-HRP酶联物结合， 最终形成包被探针-特异探针-RNA扩 增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-HRP酶联物复合体， 最后加入HRP酶化学发光底 物， 在化学发光仪上进行检测。 实现病原体核酸的检测。 因此， 本发明没有复杂的RNA提取过 程， 即使是一个水浴锅都能实现扩增反应， 基于RNA分子易降解的特点， 本发明在实。

25、际检测 中不易污染， 具有灵敏度高、 特异性强以及操作简单的优势， 使呼吸道合胞病毒、 副流感病 毒及腺病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。 0007 为了实现上述目标， 本发明采用如下技术方案： 0008 第一方面， 提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合 胞病毒、 副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒， 包括： 0009 1)扩增反应液： 含40mM Tris-HCl(pH 8.0)， 12mM MgCl2， 70mMKCl， 15DM SO， 5mM DTT， 每种dNTP各1mM， 每种NTP各2mM， 扩增引物各0.2 M， 其中扩增引物包括四组： 呼吸道合 胞。

26、病毒(包括A型和B型)、 副流感病毒(包括1、 2、 3型)、 腺病毒(包括B属、 C属和E属)和人内参 基因， 具体的： 0010 (1)呼吸道合胞病毒(P基因的一段保守区序列)的扩增引物： 0011 RSV-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCAAA3 ； 0012 RSVA-F引物： 5 TGTTATAGGACTTTCTTT3 ； 0013 RSVB-F引物： 5 AGTGACTTCTATGTCTAT3 ； 0014 (2)副流感病毒(L基因一段保守区序列)的扩增引物： 0015 PIV1-R引物： 5 TAATACGACTCACTAT。

27、AGGGAGATCCGATTGTAAAAAGCAAGATT3 ； 0016 PIV1-F引物： 5 GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3 ； 0017 PIV2-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTACTTATT3 ； 0018 PIV2-F引物： 5 CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3 ； 0019 PIV3-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATCCTG3 ； 0020 PIV3-F引物： 5 TCACTTTCTCAGTTAATAT3 ； 0021 (3)腺病毒(5 。

28、-3 )(AdV-B属是L3基因的一段保守区序列、 AdV-C属是hexon的一段 保守区序列、 AdV-E属是hexon protein的一段保守区序列)的扩增引物： 0022 ADV-B属-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCCGGTCAACGGGTACGA； 0023 ADV-B属-F引物： ACCTGAGTCCGGGTCTGGTG； 0024 ADV-C属-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATCYTCAGTTCCATGRTT； 0025 注： 本发明中的简并碱基Y代表T/C； 说明书 2/19 页 6 CN 110964853 A。

29、 6 0026 注： 本发明中的简并碱基R代表A/G； 0027 ADV-C属-F引物： TTGCARGACAGAAACACAGAGCT； 0028 ADV-E属-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATATCAGCATAAATTACTGTG； 0029 ADV-E属-F引物： AGCTTTAAACCCTACTCCGG； 0030 (4)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物： 0031 内参-R引物： 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCAGCTAAGAG CA3 ； 0032 内参-F引物： 5 CAGCAGCCGC。

30、GGTAATTC3 ； 0033 由于副流感病毒基因序列变异较大， 在设计引物时分别针对副流感病毒1型、 副流 感病毒2型、 副流感病毒3型进行单独设计； 呼吸道合胞病毒在设计时F引物设计两条， R引物 共用一条； 腺病毒核酸基因序列同样存在变异较大的情况， AdV属不同血清型基因序列差异 性也较大， 本发明在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸， 在设计 引物时分别针对腺病毒的B、 C、 E属进行设计。 所以AdV-C属的引物和探针设计成简并碱基， 可以对这些流行株进行全覆盖。 本发明所设计的引物能够扩增出所有常见血清型， 又能够 最小化的影响彼此之间的扩增效率。 本发明设计。

31、的各对引物R引物5 端都引入了T7 RNA聚 合酶启动子序列。 0034 2)扩增酶： 包含三种， 逆转录酶(如AMV或M-MLV)、 T7 RNA聚合酶和RnaseH； 0035 3)细胞裂解液： 购至美国Signosis公司， 货号CL-0001， 可以裂解细胞， 释放核酸； 0036 4)放大探针： 一种标有生物素的核酸序列， 该探针可以和特异探针的LES系列的一 端结合， 具体序列(5 -3 )为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATA GGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCA。

32、CGTTCGCGTTCTCA CATG； 0037 5)特异探针： 每个指标特异探针有两种， 分别为CES系列和LES系列， 其中CES系列 和LES系列又可以设计多条， 具体如下： 0038 (1)RSVA特异探针序列： 0039 RSVA-LES1:5 TTGACAGATATGATACTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0040 RSVA-LES2:5 TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0041 RSVA-LES3:5 TTGGGTGATGTGAATTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGT。

33、GGT3 ； 0042 RSVA-LES4:5 CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0043 RSVA-LES5:5 AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0044 RSVA-CES:5 ACTTCTATATCTATTGAGTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0045 (2)RSVB特异探针序列： 0046 RSVB-LES1： 5 TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACG TGGT3 ； 0047 RSVB-L。

34、ES2： 5 GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACG TGGT3 ； 0048 RSVB-LES3： 5 GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0049 RSVB-CES： 5 TTGACAGATATTATGCTATCTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0050 (3)PIV1特异探针序列： 0051 PIV1-LES1： 5 TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0052 PIV1-LES2： 5 TA。

35、GCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT 3 ； 0053 PIV1-CES： 5 TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0054 (4)PIV2特异探针序列： 说明书 3/19 页 7 CN 110964853 A 7 0055 PIV2-LES1： 5 TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0056 PIV2-LES2： 5 CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0057。

36、 PIV2-CES： 5 TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0058 (5)PIV3特异探针序列： 0059 PIV3-LES1： 5 GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0060 PIV3-LES2： 5 AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT 3 ； 0061 PIV3-CES： 5 TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0062 (6)AdV-B属的特异探针序列： 00。

37、63 ADV-B-LES1： AAATTTAGAAACCCCACATTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0064 ADV-B-LES2： GTGGCGCCCACCCACGATTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0065 ADV-B-LES3： GTGACCACCGACCGTAGCTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0066 ADV-B-CES1： GCCCGTGCAACAGACACCTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0067 ADV-B-CES2： TACTTCAGTATGGGGAACTTTTCTGTAC。

38、GTATGTATGT3 ； 0068 (7)AdV-C属的特异探针序列： 0069 ADV-C-LES1： 5 TTTTCYATGTGGAATCAGGCTGTWGTTTT CATGTGAGAACGCGAA CGTGGT3 ； 0070 注： 本发明中的简并碱基W代表A/T。 0071 ADV-C-LES2： 5 ACAGCTATGATCCAGATGTYAGAATTTTTCATGTGAGAACGCGAAC GTGGT3 ； 0072 ADV-C-CES： 5 GGTGATAGAACCAGRTAYTTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0073 (8)AdV-E属的特异探针序列： 0074。

39、 ADV-E-LES1： GCCAGTGGAAGGATGCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0075 ADV-E-LES2： ACAGCAAAATGCATACCTTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0076 ADV-E-LES3： TTGGGGTAGCTGCCATGCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0077 ADV-E-CES1： ACAACAGTCTGGCTCCCATTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0078 ADV-E-CES2： AGGGAGCGCCCAATACCTTTTTCTGTACGTAT。

40、GTATGT3 ； 0079 (9)人内参基因特异探针序列： 0080 内参LES1： 5 AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0081 内参LES2： 5 TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0082 内参LES3： 5 TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0083 内参LES4： 5 ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3 ； 0084 内参CES1： 。

41、5 AGCTCCAATAGCGTATATTTTT CTGTACGTATGTATGT3 ； 0085 内参CES2： 5 TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTCTGTACGTATGTATGT3 ； 0086 6)微孔板： 每个微孔中包被包被探针， 该包被探针可以和每个指标的CES系列探针 一端序列互补配对结合， 具体序列(5 -3 )为： 5 ACATACATACGTACAG3 ； 0087 7)HRP-链霉亲和素酶联物： 标记有链霉亲和素的HRP酶联物， 该酶联物可以和放大 探针上生物素结合； 0088 8)配制杂交液、 洗液A(5)、 洗液B(5)、 封闭液、 底物稀释液， 杂交液：。

42、 含0.1 SDS的5SSC； 洗液A(5)： 含0.5SDS的5SSC； 洗液B(5)： 含0.5SDS的5P BS； 封闭 液： 含0.5BSA、 1PBS； 底物稀释液： 50mM pH8.5 Tris-HCl； 0089 9)底物： 鲁米诺化学发光底物(购至Thermo Fisher， 货号37075)， 遇到HRP酶催化 说明书 4/19 页 8 CN 110964853 A 8 后能够产生化学发光信号， 被仪器检测到。 0090 本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道 合胞病毒、 副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒检测呼吸道合胞病毒、 副流感病毒及腺病。

43、毒 核酸的方法， 包括如下步骤： 0091 (1)RNA恒温扩增 0092 本发明检测指标有9个： 呼吸道合胞病毒(包括A和B型)、 副流感病毒(包括1、 2、 3 型)、 腺病毒(包括AdV B属、 C属和E属)和人内参基因。 针对每个指标设计一对(F/R 引物)扩 增引物， 其中R引物5 端带有T7 RNA聚合酶启动子。 本发明在同一扩增管内实现各个指标核 酸的扩增， 具体如下： 扩增时， 在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下， 将待测RNA转 化为RNA:cDNA杂合体； 扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA， 得到单链cDNA； 在F引物和 反转录酶的DNA聚合酶。

44、功能的作用下合成第二链， 形成带有T7 启动子的双链DNA； 带有T7启 动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA 分子产物。 转录的RNA分子产物可以 进入循环扩增过程， 首先F引物会结合转录的RNA分子产物， 在逆转录酶的作用下将转录的 RNA转化为RNA:cDNA杂合体； 扩增酶中的RnaseH 消化RNA:cDNA中的RNA， 得到单链cDNA； 接 着R引物会结合到单链cDNA上， 在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链， 再次富 集合成更多的带有T7启动子的双链 DNA分子， 为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板， 进而 在T7 RNA聚合酶的作用下转录。

45、生成大量的RNA分子产物(如图1)。 0093 本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、 扩增体系的有 效性。 当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞， 在检测时一定会被检测到， 样本检 测阴性时内参应该为阳性， 否则整个检测需要重新采样进行重测。 0094 (2)多生物素信号放大 0095 a， 设计特异探针、 放大探针和包被探针 0096 特异探针： 每个指标特异探针包括在两种： CES系列和LES系列， 每种探针可以设计 多条。 其中CES探针包含两个部分， 一端可以和扩增的RNA产物特异性结合， 另一端可以和包 被在微孔板中的包被探针集合， 起到固定扩增产物RNA。

46、的作用， 这两个部分用45个T 链 接。 每条LES探针也包含两个部分， 一端可以和扩增的RNA产物特异性结合， 另一端可以和放 大探针结合， 起到链接放大探针的作用， 这两个部分用45个T链接。 0097 放大探针： 放大探针为含有多个生物素的探针， 该探针可以和特异探针LES的一端 结合， 探针上的生物素可以和HRP-链霉亲和素酶联物结合。 0098 包被探针： 包被探针被固定在微孔板中， 可以和特异探针CES的一端结合， 起到固 定的作用。 0099 所诉特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉， CES系列同放大 探针以及包被探针无交叉， 以保证检测的特异性。 0100 所诉。

47、特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步 骤的灵敏度， 从而增加检测体系的灵敏度。 0101 b， 检测结果判断 0102 扩增检测时同时设置阴性对照， 即在检测样本的同时也扩增阴性质控物(细胞裂 解液， 购至美国Signosis公司， 货号CL-0001)。 每管扩增产物会被均分到四个微孔板微孔 中， 其中 RSV微孔在杂交时会加入呼吸道合胞病毒特异探针； PIV微孔在杂交时会加入副流 说明书 5/19 页 9 CN 110964853 A 9 感病毒特异探针； AdV微孔在杂交时会加入腺病毒特异探针； 内质控微孔在杂交时会加入内 参特异探针。 杂交洗涤后加入化。

48、学发光底物， 并进行化学发光值测定， 对样本检测指标的比 值R进行计算， 其中R待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5阴性质控物检测指标相对 光单位 (RLU)值)； 根据比值R对样本进行定性判断， 比值R大于1.0则判断为阳性， 小于等于 1.0则为阴性。 0103 结合上述原理， 对本发明上述方法的工作过程介绍如下： 0104 (1)核酸提取 0105 采集疑似呼吸道合胞病毒、 副流感病毒或腺病毒患者的咽拭子样本， 使用细胞裂 解液裂解的方法释放病毒RNA分子。 0106 (2)RNA恒温扩增 0107 向17 L的含有呼吸道合胞病毒、 副流感病毒、 腺病毒和内参引物的扩增反应液中 加。

49、入 2 L核酸提取物， 95加热两分钟， 42预热2分钟， 加入1 L扩增酶， 42恒温扩增1小 时。 待测样本中若有呼吸道合胞病毒、 副流感病毒或腺病病毒核酸， 扩增时会对指标RNA分 子进行大量扩增富集。 0108 (3)多生物素信号放大 0109 a， 将RNA恒温扩增产物与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)、 放大探针 及杂交液同时加入到微孔板中， 50恒温孵育1小时。 0110 扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。 CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对， 另一端同微孔板中的包被探针结合， 可以将 RNA分子固定在微孔板中；。

50、 LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对， 另一端可以与放大探 针互补配对， 形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针复合物， 该复合物被固定在微孔板 上(如图2)。 0111 b， 用洗液A洗去未结合于微孔板上的RNA分子、 特异探针和放大探针。 0112 c， 加入封闭液， 室温封闭12分钟， 封闭非特异性位点。 0113 d， 将HRP-链霉亲和素酶联物加入微孔板孵育， 该酶联物可以和放大探针上的生物 素结合， 最终形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针-HRP-链霉亲和素酶联物， 并被固定 在微孔板上。 0114 e， 用洗液B洗去游离的HRP-链霉亲和素酶联物。。