诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911354423.2 (22)申请日 2019.12.25 (71)申请人 昆明医科大学 地址 650500 云南省昆明市呈贡区雨花街 道办事处春融西路1168号 (72)发明人 李力燕马微郭建辉杨金伟 王先斌刘矿嫔刘洁刘伟 臧成昊吴朕梁宇李春艳 (74)专利代理机构 昆明普发诺拉知识产权代理 事 务 所( 特 殊 普 通 合 伙 ) 53209 代理人 蒋晗 (51)Int.Cl. C12N 5/0793(2010.01) (54)发明名称 一种诱导卫星胶质细胞转分化为。

2、神经元的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种诱导卫星胶质细胞转分 化为神经元的方法， 所述方法操作如下： 取传代 培养后的卫星胶质细胞在含有Anti-proBDNF的 诱导培养液中诱导培养37天后得到神经元。 本 发明在生理条件下(未进行外源性基因转染)， 抑 制内源性proBDNF能够诱导卫星胶质细胞向神经 元表型的分化。 本发明为周围神经系统的发生提 供了一种新的理论支持， 发现周围神经发生的一 种新的方式-由神经胶质细胞直接转分化为神 经元。 为外周神经发育及损伤修复治疗研究提供 了新的理论依据， 而且本发明方法操作更简便， 转分化率较高。 权利要求书1页 说明书9页 附图7页 CN 。

3、110982788 A 2020.04.10 CN 110982788 A 1.一种诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于， 所述方法操作如下： 取 传代培养后的卫星胶质细胞在合有Anti-proBDNF的诱导培养液中诱导培养37天后得到 神经元。 2.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于， 所述 诱导培养液中Anti-proBDNF的浓度为35 g/mL。 3.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于， 所述 诱导培养液的配方如下： 每50mL DRG-SGCs培养液中DMEM/F12含量为4648mL， B27细胞。

4、培 养添加剂含量为0.41.2mL， 青霉素-链霉素混合液含量为0.41.2mL， L-谷氨酰胺含量为 1.82.2mmol/L， BSA含量为1520mg/mL， NRG1- 1含量为8-12 g/mL， 地塞米松含量为22- 27 g/mL， Insulin含量为3-7mg/mL， T3含量为8-12 g/mL， T4含量为396-404 g/mL， Anti- proBDNF的浓度为35 g/mL。 4.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于， 所述 卫星胶质细胞来源于新生大鼠背根神经节， 传代培养35代。 5.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞转分化为。

5、神经元的方法， 其特征在于， 所述 卫星胶质细胞转分化为神经元时每12天换一次诱导培养液。 6.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于， 所述 诱导培养条件如下： 在含4.55.5CO2的温箱中培养， 温度为36.537.5， 湿度为70- 80。 7.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于， 取传 代培养后的卫星胶质细胞在含有Anti-proBDNF的诱导培养液中诱导培养37天诱导分化 为神经元样细胞， 再经神经元培养液继续培养24天后得到成熟神经元。 8.根据权利要求7所述的诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 其特征在于，。

6、 所述 神经元培养液配方如下： 青霉素-链霉素混合液为0.82.2mL， L-谷氨酰胺为0.8-2.2mL， B27细胞培养添加剂为0.82.2mL， Neurobasal A神经元基础培养基为93.497.6mL。 9.根据权利要求18任一所述的方法获得的神经元。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110982788 A 2 一种诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞转分化领域， 尤其涉及一种诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的 方法。 背景技术 0002 神经系统(nervous system， NS)包括中枢神经系统(central nervous syst。

7、em， CNS) 和周围神经系统(peripheral nervous system， PNS)， 是机体内对生理功能活动的调 节起主导作用的系统是机体最重要的系统。 神经系统结构、 功能复杂， 依旧存在很多未解之 谜。 因此， 神经系统的发育、 损伤以及修复一直是医学研究领域的热点之一。 0003 在中枢神经系统中， 神经细胞的损伤、 凋亡后的修复主要是通过神经干细胞 (Neural stem cells， NSCs)的诱导分化为神经细胞， 从而替代损伤部位的神经细胞。 成年 哺乳动物中枢神经系统存在神经发生的现象， 其结果和重要性已是一个公认的医学研究观 点， 神经发生现象在大脑可塑性、 。

8、学习记忆等认知功能和损伤修复中起着关键性的作用。 那 么， 在外周神经系统是否也存在同中枢神经系统类似的神经发生现象？ 研究发现外周神经 系统也存在神经发生或神经元数量增多现象， 但却较少被认识到。 0004 背根神经节(dorsal root ganglion， DRG)位于两节椎骨之间的椎孔内， 属于周围 神经系统， 是外周传入神经和传出神经的中转站， 为初级感觉神经元的聚集处， 是躯体感觉 的初级传入神经元。 外周神经疾病或者损伤可导致背根节神经元减少、 神经元之间的连接 出现紊乱、 创伤性神经瘤的形成等， 造成感觉传导异常， 引起神经病理性疼痛。 神经病理性 疼痛是神经系统损伤引起的一。

9、种难以治愈的慢性痛状态。 损伤发生后不仅引起神经病理性 疼痛， 同时还存在神经修复作用、 神经再生的过程， 提示神经病理性疼痛与神经修复再生之 间存在某种联系， 所以在探索神经损伤新的治疗方法的同时也必须考虑到对神经修复和再 生的影响。 0005 卫星胶质细胞(Satellite Glial Cells， SGCs)是背根神经节中围绕在感觉神经 元周围的一群细胞， 具有同中枢神经系统中的星形胶质细胞的作用， 是外周神经系统中一 种重要的神经胶质细胞， 广泛分布在背根神经节(dorsal root ganglia， DRG)和三叉神经 节(trigeminal ganglia， TG)中， 对神。

10、经元起支持、 保护、 营养等作用。 最初人们认为卫星胶 质细胞仅仅为神经元提供结构支撑、 营养支持， 从而促进神经元的生长发育。 0006 proBDNF(precursor for brain-derived neurotrophic factor)是成熟脑源性 神经营养因子的前体形式， 裂解后形成成熟BDNF。 脑源性神经营养因子前体不仅可以作为 脑源性神经营养因子的前体形式， 它也可以由神经细胞突触分泌到细胞外区域， 与脑源性 神经营养因子起着不同的作用。 proBDNF与神经损伤后神经元的死亡及神经退行性变等神 经系统疾病都有关， 其作用方式和传导通路与成熟的BDNF也不尽相同。 00。

11、07 目前尚无文献报道卫星胶质细胞能够转分化为神经元。 本发明在前期成功建立一 种稳定的、 高效的、 高纯度的DRG-SGCs体外原代培养模型后， 又研究了卫星胶质量细胞的转 分化过程， 并且成功获得了神经元。 说明书 1/9 页 3 CN 110982788 A 3 发明内容 0008 本发明提供一种诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 本发明采用Anti- proBDNF (proBDNF抗血清或proBDNF抗体)诱导背根神经节(dorsal root ganglia， DRG)来 源的卫星胶质细胞(satellite glial cells， SGCs)向神经元转化， 为周围神经系统。

12、的发生 提供了一种新的理论支持， 发现周围神经发生的一种新的方式： 由神经胶质细胞直接转分 化为神经元。 为外周神经发育及损伤修复治疗研究提供了新的理论依据。 0009 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案如下： 0010 一种诱导卫星胶质细胞转分化为神经元的方法， 所述方法操作如下： 取传代培养 后的卫星胶质细胞在含有Anti-proBDNF的诱导培养液中诱导培养37天后得到神经元。 0011 作为优选， 所述诱导培养液中Anti-proBDNF的浓度为35ug/mL。 0012 作为优选， 所述诱导培养液的配方如下： 每50mL DRG-SGCs培养液中DMEM/F12含量 为4648m。

13、L， B27细胞培养添加剂含量为0.41.2mL， 青霉素-链霉素混合液含量为0.4 1.2mL， L-谷氨酰胺含量为1.82.2mmol/L， BSA含量为1520mg/mL， NRG1- 1含量为8-12 g/mL， 地塞米松含量为22-27 g/mL， Insulin含量为3-7mg/mL， T3含量为8-12 g/mL， T4含量 为 396-404 g/mL， Anti-proBDNF的浓度为35 g/mL。 本发明采用的试剂B27细胞培养添加 剂、 青霉素-链霉素混合液等通常有两种规格50和100。 50和100表示试剂所需要稀 释的倍数， 本领域技术人员可以采用50的规格， 也可。

14、以采用100的规格。 比如配制细胞 培养液时按照每配制50mL细胞培养液加入0.81.2ml的B27细胞培养添加剂50， 或每配 制50mL细胞培养液加入0.40.6ml的B27细胞培养添加剂100， 青霉素-链霉素混合液也 是以这样的方法添加。 另外， 体系中DMEM/F12、 B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液 的总体积不足50mL， 余量为其他试剂配置采用的溶液。 0013 进一步地， 所述卫星胶质细胞来源于新生大鼠(出生24小时以内的乳鼠)的背根神 经节， 传代培养35代。 0014 进一步地， 所述卫星胶质细胞转分化为神经元时每12天换一次诱导培养液。 0015 进一步地， 。

15、所述诱导培养条件如下： 在含4.55.5CO2的温箱中培养， 温度为 36.537.5， 湿度为70-80。 0016 作为优选， 取传代培养后的卫星胶质细胞在含有Anti-proBDNF的诱导培养液中诱 导培养 37天得到神经元样细胞， 再经神经元培养液继续培养24天后得到成熟神经元。 由于合有胎牛血清的培养基用于神经胶质细胞培养， 可能不是神经元生长和成熟的最佳条 件， 因此将培养基更换为神经元培养基发现会促进神经元样细胞的成熟。 0017 作为优选， 所述神经元培养液配方如下： 青霉素-链霉素混合液为0.82.2mL， L- 谷氨酰胺为0.8-2.2mL， B27细胞培养添加剂为0.82。

16、.2mL， Neurobasal A神经元基础培养 基为 93.497.6mL。 神经元培养液中青霉素-链霉素混合液、 L-谷氨酰胺和B27细胞培养添 加剂的试剂通常有50和100两种规格， 50和100表示试剂需要稀释的倍数， 本领域 技术人员可以采用50的规格， 也可以采用100的规格。 比如100mL神经元培养液中加入 1.82.2mL 的B27细胞培养添加剂50， 也可以根据购买的规格不同， 选择加入0.8 1.2mL的B27细胞培养添加剂100， 青霉素-链霉素混合液和L-谷氨酰胺也是以这样的方式 添加。 0018 另外， 本发明还提供所述的方法获得的神经元， 本发明通过形态学观察、。

17、 免疫荧光 说明书 2/9 页 4 CN 110982788 A 4 染色鉴定细胞形态的变化， 膜片钳技术检测诱导分化后各组细胞的电生理特性， 进一步证 明诱导分化为的细胞为神经元。 0019 本发明的特点在于， 在没有现有文献的指导下， 本申请首次研究出了背根神经节 来源的卫星胶质细胞的转分化过程， 并成功转分化得到了神经元。 与目前通过基因编辑等 转分化手段不同， 本发明通过在培养液中加入Anti-proBDNF(抗proBDNF血清)， 抑制了内源 性旁分泌或自分泌而来的proBDNF表达， 调节细胞微环境中proBDNF的表达， 诱导卫星胶质 细胞表型向神经元表型的转分化。 本发明是在。

18、生理条件下(未进行外源性基因转染)， 能够 诱导胶质细胞分化为神经元， 提供了从SGC转分化为由生理因子的自分泌/旁分泌调节机制 调节的神经元的第一个例子。 0020 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 本发明在生理条件下(未进行外源性 基因转染)， 成功诱导胶质细胞分化为神经元， 操作更简便， 经济， 而且转分化率较高。 附图说明 0021 图1为背根神经节原代培养3天、 7天、 14天和21天时卫星胶质细胞的形态图； 0022 图2为卫星胶质细胞传代培养后的细胞形态图； 0023 图3为卫星胶质细胞中三种标志物的阳性率； 0024 图4为在4 g/mL Anti-proBDNF血清。

19、处理后DRG-SGC的形态学变化； 0025 图5为Anti-proBDNF处理三天后卫星胶质细胞的免疫荧光鉴定图； 0026 图6为Anti-proBDNF干预后第三天和第七天标记特异性标记物进行双标鉴定； 0027 图7为从DRG-SGC转化的神经元细胞的电生理学特征； 0028 图8为同一组各时间点细胞的动作电位峰值， 阈值和持续时间图； 0029 图9为Elisa试剂盒检测1d和3d组卫星胶质细胞培养基中proBDNF和BDNF的自分泌 和表达水平； 0030 图10为SGC特异性标记物GS以及神经元特异性标记Tuj1和NeuN鉴定细胞图。 具体实施方式 0031 下面结合附图和具体实。

20、施例对本发明的技术方案做进一步详细说明， 但本发明并 不局限于以下技术方案。 0032 以下实施例采用的试剂如下： DMEM/F12(1 1)培养基、 B-27添加剂(50)、 双抗(青 霉素及链霉素溶液)(50)、 BSA(15mg/mL)、 地塞米松(25ug/mL)、 牛胰岛素Insulin(5mg/ mL)购自 biosharp公司； T3(10ug/mL)、 T4(400ug/mL)、 NRG- 1购自abcam公司、 胎牛血清、 0.25胰酶均购自美国Life Technology公司； L-赖氨酸、 PBS均购自美国Genview公司； Anti-proBDNF 来源于澳大利亚南。

21、澳大学周新富教授实验室的赠送； L-谷氨酰胺(L- Glutamine， 100)、 Neurobasal A神经元基础培养基购买于Gibco试剂公司。 0033 实施例1 0034 取新生SD大鼠背根节原代培养(按照201611170545.2一种原代培养背根神经节卫 星胶质细胞的方法的操作进行)， 待卫星胶质细胞迁徙出后， 进行传代纯化培养。 0035 DRG-SGC(背根神经节-卫星胶质细胞)原代、 传代培养、 纯化和分组 0036 当SGCs在培养皿底部占据70-80后(大约将DRG培养10天)， 将DRG转移至用聚 D- 说明书 3/9 页 5 CN 110982788 A 5 赖氨。

22、酸氢溴酸盐(PDL)(P7405-5MG， Sigma-Aldrich， MO， USA)包被的六孔板中。 然后用 0.25胰蛋白酶-EDTA(25200-056， Gibco life technologies， Invitrogen， CA， USA)消化 SGCs， 消化时间随DRG培养的时间以及胰酶的效价决定， 一般消化时间为3min， 待卫星胶质 细胞开始从培养板上脱落时 ， 便用等体积的10FBS(12657029， Gibco life technologies， Invitrogen， CA， USA)终止消化。 经反复吹打后收集悬液到15mL的离心管 中， 以1000prm/。

23、min 离心6分钟， 弃上清液， 根据细胞浓度为6105加入DRG-SGC培养基， 吹 打混匀细胞， 可将细胞悬液中板至24孔板用于免疫细胞化学染色。 将卫星胶质细胞中板至 25cm的培养瓶中， 并将培养板和培养瓶放在湿度为5CO2培养箱(37)中。 培养液隔天更 换， 在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态， 如图1和图2所示。 0037 图1中卫星胶质细胞从背根节中迁出随着培养时间的延长， 卫星胶质细胞迁出率 越高， 分别观察的背根节培养3d、 7d、 14d、 21d时卫星胶质细胞的形态。 比例尺500 m。 图2 中A： 卫星胶质细胞从背根节中迁出的形态， B： 卫星胶质细胞传代后的形态。

24、学观察， 细胞胞 体饱满， 呈椭圆形， 胞体两极有突起生成， 细胞间突起存在相互连接。 0038 免疫荧光鉴定传代后的卫星胶质细胞及其纯度 0039 (1)将培养在24孔板中的卫星胶质细胞取出； 吸去板中的培养基， 用0.01mol/L PBS 漂洗2次， 每次3min； 0040 (2)为防止载玻片上的细胞脱落， 用4多聚甲醛溶液中浸泡固定20min； 0041 (3)0.01mol/L PBS漂洗3次， 每次10min； 0042 (4)5羊血清室温封闭1h； 0043 (5)0.01mol/L PBS漂洗3次， 每次10min； 0044 (6)加入配置好的一抗后于4冰箱孵育过夜。 根据。

25、抗体说明书结合实验经验选择 合适的稀释比， 阴性对照组加入5羊血清； 0045 (7)将抗体孵育盒取出静置30min， 使其恢复至室温。 PBST漂洗3次， 每次10min； 0046 (8)加入荧光二抗室温孵育2h， 荧光二抗选用羊抗鼠Cy3， 稀释比例1 1000。 注意避 光； 0047 (9)PBST漂洗3次， 每次10min； 0048 (10)用含有DAPI的荧光封片剂封片； 0049 (11)采用Nikon 90i荧光显微镜下采集图像， 每一组织在同一倍数下采集不同视 野图片不少于5张。 0050 (12)从每组中随机抽取5张在200倍放大倍数下在不同视野下的图片， 通过PS工具。

26、 的技术工具计数阳性细胞数量。 0051 传3-5代后， 将细胞培养3天， 然后通过标记三种SGC特异性标记物GS， GFAP和 S100 进行鉴定。 如前所述进行荧光显微镜检查， 所有培养的细胞均显示GS， GFAP和S100 免疫 反应性。 DAPI显示为蓝色。 因此， 培养的细胞被证实为SGC。 表达三种SGC特异性标志物GS， GFAP和S100 的SGC阳性率分别为97.10， 67.69和91.66， 如图3所示。 0052 将鉴定后的卫星胶质细胞(SGC)分为两个大组： 对照组(SGCs组)、 Anti-proBDNF 干预组， 将以一个培养瓶中的细胞量作为一个组， 不做任何干预。

27、为SGC组， 以4ug/mL浓度的 Anti-proBDNF诱导培养液干预卫星胶质细胞12小时为Anti-proBDNF0.5d组、 以4ug/mL 浓 度的Anti-proBDNF诱导培养液干预卫星胶质细胞24小时为Anti-proBDNF1d组、 以 4ug/mL 说明书 4/9 页 6 CN 110982788 A 6 浓度的Anti-proBDNF诱导培养液干预卫星胶质细胞3天为Anti-proBDNF3d组、 以 4ug/mL浓 度的Anti-proBDNF诱导培养液干预卫星胶质细胞7天为Anti-proBDNF7d组， 以 4ug/mL浓度 的Anti-proBDNF诱导培养液干预。

28、卫星胶质细胞7天后换成神经元培养液培养3 天为Anti- proBDNF7d+NC3d组。 因此总的实验分组情况如表1所示。 0053 表1 实验分组情况 0054 0055 0056 不进行Anti-proBDNF干预的六个对照组只用DRG-SGC培养液进行培养， 所述DRG- SGC 培养液的配方如表2所示。 Anti-proBDNF干预组在诱导培液中培养， 所述诱导培养液在 表2 的DRG-SGC培养液基础上加入Anti-proBDNF， 浓度为4ug/mL。 对照组和干预组均是隔天 换液， 培养条件均是在37、 5CO2的温箱中培养。 0057 待各组达到所要求的干预时间后， 在各个时。

29、间点取出细胞做相应实验。 通过形态 学观察、 免疫荧光染色鉴定细胞形态的变化。 膜片钳技术检测诱导分化后各组细胞的电生 理特性。 0058 表2 DRG-SGC培养液配方 说明书 5/9 页 7 CN 110982788 A 7 0059 0060 0061 Anti-proBDNF对卫星胶质细胞进行干预及鉴定 0062 Anti-proBDNF对卫星胶质细胞干预后形态学观察 0063 各个时间点在倒置显微镜下观察相差图像， 结果显示诱导前的卫星胶质细胞呈圆 形且明亮， 且过程较短。 在培养物中加入Anti-proBDNF 3天后， 部分细胞大小形态明显改 变， 细胞变得紧密， 细胞胞体增大，。

30、 胞体圆润和明亮， 细胞显示多边形， 突起呈多极表现， 细 胞突起间相互连接形成网络结构， 同神经元相似， 如图4所示。 图4中A表示正常培养基培养 7d 时DRG-SGC的形态特征； 图4中B-D分别表示Anti-proBDNF处理3d、 5d、 7d天后DRG-SGC 的 形态特征， 图4中比例尺200 m。 0064 Anti-proBDNF对卫星胶质细胞干预后免疫荧光鉴定 0065 Anti-proBDNF处理3天后， 经免疫荧光鉴定， 如图5所示。 通过神经干细胞特异性标 记物Nestin标记SGC， 结果显示经Anti-proBDNF处理培养的细胞均显示Nestin免疫反应性， D。

31、API显示为蓝色。 0066 图5中(A)： 将从背根神经节中迁移收集的细胞团标记为GS(绿色)。 (B)： DAPI 标记 细胞核， 显示为蓝色。 (C)： 被标记为神经干细胞特异性标记物(Nestin)(红色)(D)： 将ABC合 图(merge)。 比例尺100 m。 缩写： DAPI， 4 ， 6-二脒基-2-苯基吲 (4 ， 6-diamidino-2- phenylindole)。 图5结果提示： SGCs是多能祖细胞， 它们的分化受到环境信号的影响， 可在 适当是环境下分化为成熟神经细胞或神经胶质细胞。 0067 Anti-proBDNF干预后第三天和第七天检测通过标记SGC特异。

32、性标记物S100 和 P75NTR和感觉神经元特异性标记物CGRP进行进行双标鉴定。 如前所述进行荧光显微镜检查。 对照组中所有培养的细胞均显示S100 免疫反应性， 但未检测到CGRP阳性标记。 实验中 Anti-proBDNF干预第三天， 检测到CGRP阳性标记卫星胶质细胞， 阳性率为8.7， 在 Anti- 说明书 6/9 页 8 CN 110982788 A 8 proBDNF干预第七天， CGRP的阳性率明显升高， 阳性率为42， 如表3和图6所示。 0068 表3 CGRP标记物的阳性率 0069 0070 膜片钳技术检测电生理操作过程如下： 0071 (1)玻璃微电极的制备 00。

33、72 1)采用垂直二步拉制法(第一步拉制温度为58.1， 第二步为48.0)制备玻璃微 电极， 拉好的电极用抛光仪热抛光， 消除残留的毛刺， 以有利于形成巨阻封接。 电极抛光后 的入水阻抗约为814M。 0073 (2)膜片钳记录过程 0074 1)取细胞： 将贴附有细胞的玻片从培养基中取出， 放至新的加有细胞外液的培养 皿中， 将培养皿放至显微镜平台。 本实验所用细胞外液(mM)： 144 NaCl， 2.5 KCl， 2 CaCl2， 0.5 MgCl2， 5 HEPES， 10 glucose， 用NaOH调节至pH 7.4。 0075 2)Patch过程： 镜下选取状态比较好的DRG-。

34、SGC。 将充灌有电极内液的玻璃微电极 固定在电极夹持器上， 此时电路呈断路状态， 电阻很高。 用注射器给电极施以正压后用电动 微操纵器将电极入水， 此时电路接通， 软件显示电极阻抗， 观察电极阻抗为814M， 单击液 接电位补偿中的 Auto 键进行液接电位补偿。 在显微镜下找到电极尖端， 用微操纵器将电 极移至目标细胞附近， 调整电极位置， 使电极刚好压到细胞的正上方稍偏向电极夹持器方 向一点， 镜下看细胞表面与电极接触， 此时电极电阻上升， 撤去正压并给予轻微负压， 直至 电阻增加至1G以上形成高阻封接。 单击 C-Fast 中的 Auto 键， 仪器自动进行快电容补偿。 再次向微电极内。

35、施以负压， 打破电极尖端下的细胞膜， 单击 C-Slow 中的 Auto 键， 进行慢 电容补偿。 将细胞钳制电位设置在-70mV-90mV之间， 采用 I-CLAMP 模式， 信号采样频率 为5kHz， 低通滤波频率为1kHz， 按照预设的protocol进行全细胞记录。 0076 (3)记录过程 0077 1)电流钳模式： 记录模式设置为电流钳， 细胞注射电流为0pA， 此时记录的为卫星 胶质细胞的静息膜电位(resting membrane potential， RMP)， 之后观察对照组和干预组卫 星胶质细胞电位情况。 0078 用来自SD大鼠大脑皮层的神经元作为阳性对照组， SD大鼠。

36、大脑皮质离体培养神经 元的动作电位阈值， 持续时间和振幅分别为和在没有 Anti-proBDNF诱导的情况下， 在DRG-SGC中没有检测到动作电位。 在Anti-proBDNF诱导处理 7天时检测到动作电位的幅度， 并且用神经元培养基组培养的SGC与神经元组类似， 可参考 图7。 0079 图7中A： 培养7天的DRG-SGC的电生理特性。 B， C和D： Anti-proBDNF干预1天， 3天和 7天后诱导分化的细胞的电生理特性。 E： 细胞在加入了Anti-proBDNF的SGC培养基中培养7 天后， 再换成神经元培养液培养3天诱导分化的细胞。 F： 来自SD大鼠大脑皮质的神经元的电 。

37、生理测定作为对照组。 在同一组中， 各时间点细胞的动作电位峰值， 阈值和持续时间分别显 示在图8的G， H和I图中， *P0.05相对于先前时间点(例如7d组相对于 3d组的动作电位阈 值)； 用神经元培养基和神经元组培养的SGC， 3d， 7d和SGC组的P0.05。 说明书 7/9 页 9 CN 110982788 A 9 0080 在 A n t i - p r o B D N F 诱 导 1 ， 3 和 7 天 组 中 ， 动 作 电 位 阈 值 分 别 为 和动作电位幅度分别为 和动作电位时间分别为和当诱导后的DRB-SGC 在 神 经 元 培 养 基 中 培 养 3 天 后 ， 动。

38、 态 电 位 阈 值 ， 幅 度 和 幅 度 分 别 显 示 为 和 0081 发现用Anti-proBDNF处理3天后检测到类似于神经元动作电位。 电生理实验表明， 在 proBDNF诱导SGC转分化的神经元样细胞能够产生与神经元相似的动作电位， 与阳性对 照没有显着差异， 进一步证实了Anti-proBDNF诱导SGC分化为神经元。 0082 Elisa检测细胞培养液中蛋白的表达 0083 通过Elisa试剂盒检测1d和3d组细胞培养基中proBDNF和BDNF是否存在， 以及表达 水平。 如图9中A结果所示， 与对照组比较， Anti-proBDNF1d组和Anti-proBDNF 3d。

39、组中 proBDNF蛋白在培养基中的表达都明显降低(P0.05)。 如图9中B结果所示， 与对照组比较， Anti-proBDNF1d组中BDNF蛋白在培养基中的表达都明显降低。 而Anti-proBDNF 3d组中 BDNF蛋白在培养基中的表达明显上调， 但3d与1d比较， 3d正常组BDNF蛋白在培养基中的表 达明显降低。 (P0.05)。 表明， 细胞外环境中BDNF/proBDNF的表达水平对DRG-SGC 的转分 化有影响。 卫星胶质细胞对内源性proBDNF有反应， 并且依赖proBDNF维持卫星胶质细胞表 型。 Anti-proBDNF干预后， 成熟的BDNF信号传导可能起主导作。

40、用， 并促进从卫星胶质细胞表 型向神经元表型的转化。 0084 实施例2用神经元培养基代替SGC培养基后DRG-SGCs的特性 0085 用Anti-proBDNFAnti干预DRG-SGCs 7d后， 用神经元培养基代替SGC培养基， 神经 元培养基配方如下表所示。 0086 表4 神经元培养基的配制 0087 0088 用神经元培养基培养SGC培养3天后， 细胞形态与神经元相似。 通过倒置荧光显微 镜观察， 通过标记SGC特异性标记物GS以及神经元特异性标记Tuj1和NeuN鉴定细胞， 如图 10所示。 所有培养的细胞显示卫星胶质细胞特异性标记物GS阳性(图10A， B中的绿色)， 神经 。

41、元特异性标记物NeuN阳性(图10C中的红色)和Tuji阳性(图10D中的红色)。 在细胞中可以观 察到GS和Tuj1(图10H中的黄色)， 以及GS和NeuN(图10G中的黄色)的共表达。 E， F代表细胞核 4 ， 6-二脒基-2-苯基吲哚(4 ， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI)染色。 0089 实施例3选择Anti-proBDNF的最适干预剂量 0090 将卫星胶质细胞分组后， 分别以不同的Anti-proBDNF浓度的诱导培养液对卫星胶 质细胞进行干预， 通过细胞形态以及免疫细胞荧光化学检测， 选择最适Anti-proBDNF干预 浓度。 分别以An。

42、ti-proBDNF 0ug/mL、 2ug/mL、 4ug/mL、 6ug/mL、 8ug/mL以及10ug/mL作为梯度 说明书 8/9 页 10 CN 110982788 A 10 浓度， 在卫星胶质细胞被不同浓度Anti-proBDNF干预后的不同时间点， 在倒置显微镜下对 细胞进行观察， 以及通过免疫荧光细胞化学检测鉴定细胞的状态。 0091 在抗proBDNF血清浓度梯度处理过程中发现： 6 g/mL、 8 g/mL、 10 g/mL抗proBDNF 血清组在加入第3天， 细胞全部死亡； 2 g/mL抗proBDNF血清组长时间没有Tuj1阳性结果， 而4 g/mL抗proBDNF。

43、血清组在加入第三天可检测到Tuj1阳性表达,因此选取4 g/mL作为抗 proBDNF血清处理细胞时的优选浓度。 说明书 9/9 页 11 CN 110982788 A 11 图1 图2 说明书附图 1/7 页 12 CN 110982788 A 12 图3 图4 说明书附图 2/7 页 13 CN 110982788 A 13 图5 说明书附图 3/7 页 14 CN 110982788 A 14 图6 说明书附图 4/7 页 15 CN 110982788 A 15 图7 说明书附图 5/7 页 16 CN 110982788 A 16 图8 说明书附图 6/7 页 17 CN 110982788 A 17 图9 图10 说明书附图 7/7 页 18 CN 110982788 A 18 。