单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911179495.8 (22)申请日 2019.11.27 (71)申请人 迪瑞医疗科技股份有限公司 地址 130103 吉林省长春市高新区宜居路 3333号 (72)发明人 高智玲翟涛李冬梅韩美玉 高威孙成艳何浩会 (74)专利代理机构 长春众邦菁华知识产权代理 有限公司 22214 代理人 王莹 (51)Int.Cl. G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 21/76(2。

2、006.01) (54)发明名称 单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试 剂盒及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种单纯疱疹病毒抗体IgG化学 发光免疫检测试剂盒及其制备方法， 属于免疫检 测技术领域。 解决现有技术中检测单纯疱疹病毒 IgG抗体的方法存在的试剂有效期短、 操作繁琐、 灵敏度低、 检测成本高的技术问题。 本发明的试 剂盒包括R1试剂、 R2试剂和项目稀释液， R1试剂 包括磁珠包被抗原， 抗原为HSV-1抗原或HSV-2抗 原； R2试剂包括化学发光标记物标记的抗人IgG 抗体； 项目稀释液为pH6.08.0的含有盐、 表面 活性剂、 防腐剂及蛋白的缓冲液。 该试剂盒具有。

3、 灵敏度高、 特异性强、 稳定性好、 重复性好、 检测 范围广、 检测时间短、 成本相对较低的优点， 可广 泛用于临床检测。 权利要求书2页 说明书19页 CN 111007249 A 2020.04.14 CN 111007249 A 1.单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在于， 包括R1试剂、 R2试剂 和项目稀释液； R1试剂包括磁珠包被抗原， 抗原为HSV-1抗原或HSV-2抗原； R2试剂包括化学发光标记物标记的抗人IgG抗体； 项目稀释液为pH6.08.0的含有盐、 表面活性剂、 防腐剂及蛋白的缓冲液。 2.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫。

4、检测试剂盒， 其特征在 于， 所述R1试剂中， 磁珠包被抗原的浓度为0.05wt0.2wt。 3.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在 于， 所述磁珠包被抗原采用的磁珠的粒径为0.53.0 m。 4.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在 于， 所述磁珠与包被抗原的质量比为10mg:(50500) g。 5.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在 于， 所述R2试剂中， 化学发光标记物标记的抗人IgG抗体的浓度为0.11.0 g/ml。 6.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体I。

5、gG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在 于， 所述化学发光标记物标记的抗人IgG抗体， 抗人IgG抗体与化学发光标记物的标记摩尔 比为1:(310)； 化学发光标记物为吖啶酯或三联吡啶钌； 抗人IgG为鼠抗人IgG或羊抗人 IgG。 7.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在 于， 所述项目稀释液中， 盐为50200mM的磷酸盐、 柠檬酸盐或Bistris丙烷； 表面活性剂为 0.020.05的吐温20或0.050.1氯化胆碱； 防腐剂为0.010.03的迭氮钠和 0.010.03的PC300， 蛋白为0.13牛血清蛋白和0.010.2牛球蛋白。 8.根据。

6、权利要求1所述的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在 于， 该试剂盒还包括校准品、 化学发光激发液和清洗液中的一种或多种； 所述校准品包括阳性校准品和阴性校准品， 阳性校准品为单纯疱疹病毒IgG阳性血清 灭活、 过滤后， 经缓冲液稀释而成； 阴性校准品为单纯疱疹病毒IgG阴性血清灭活、 过滤后经 缓冲液稀释而成； 所述化学发光激发液包括A液和B液， A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液， B液为氢氧化钠 溶液； 所述清洗液为PB缓冲液。 9.权利要求18任何一项所述的单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫检测试剂盒的制备 方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 步骤一、 制备R1试剂 将磁。

7、珠溶液混匀， 磁分离移除上清液， 清洗液清洗多次后重悬， 加入包被抗原， 混匀， 并 在持续旋转混匀下， 37孵育24h， 磁分离去上清液， 清洗液清洗多次后， 用赖氨酸封闭液 进行封闭， 磁分离去上清， 留取磁珠包被抗原， 用缓冲液重悬至所需浓度， 得到R1试剂； 步骤二、 制备R2试剂 先将抗人IgG单克隆抗体放入离心管中， 保证抗人IgG单克隆抗体位于离心管底部位置 后加入碳酸缓冲液， 充分混匀， 混匀后加入化学发光标记物的N,N-二甲基甲酰胺溶液， 用离 心机室温条件下离心2040s； 权利要求书 1/2 页 2 CN 111007249 A 2 然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒。

8、中， 将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀， 加入赖氨酸封闭液， 放入气浴恒温振荡器中混匀， 封闭0.52h； 再将封闭好的抗人IgG单克隆抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化， 用磷酸缓冲液洗脱， 分别 收集； 最后将收集好的抗人IgG单克隆抗体溶液用缓冲液稀释， 即为R2试剂； 步骤三、 根据项目稀释液的配方配制项目稀释液； 步骤四、 将R1试剂、 R2试剂和项目稀释液分装， 完成单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫 检测试剂盒的制备。 10.根据权利要求9所述的单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 重悬使用的缓冲液为25M的pH7.2的Tris缓冲液； 所。

9、述步骤二 中， 稀释用的缓冲液与项目稀释液相同。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111007249 A 3 单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备 方法 技术领域 0001 本发明属于免疫检测技术领域， 具体涉及一种单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免 疫检测试剂盒及其制备方法。 背景技术 0002 单纯疱疹病毒I和II型(HSV-1和HSV-2)是疱疹病毒家族的两个成员。 形态上与疱 疹病毒科的其它成员相似， 具有衣壳和DNA核。 普通人群中HSV-1感染率约为70-80， HSV-2 感染率约为17-25。 HSV-1和HSV-2通过血清阴性个体和分泌病毒个体之间的密切接触进。

10、 行传播。 HSV-1和HSV-2感染的临床表现较多样， 如粘膜和皮肤损害以及眼部、 内脏和中枢神 经系统(CNS)的疾病。 免疫抑制的病人感染HSV可表现为严重广泛的损害。 尽管HSV-1和HSV- 2常通过不同的途径传播并且感染机体的不同部位， 但这两种病毒之间流行病学特征和临 床表现仍有许多相同之处。 通常HSV-1主要引起黏膜感染， 如眼、 口腔及嘴角黏膜处的感染， 它也是引起成人严重散发性脑炎的重要原因之一。 HSV-2主要引起生殖器部位的皮肤及粘 膜的损伤： 生殖器疱疹现已是常见的性接触传播疾病之一。 但HSV病毒的种类与感染部位的 关系并不是绝对的。 一旦发生HSV病毒感染， 病。

11、毒将潜伏在人体的感官神经中枢， 多种刺激 都会导致病毒周期性复发， 可能会带来临床损伤。 免疫抑制性病人更容易出现反复感染， 这 说明血清抗体及病毒特异性细胞介质免疫有助于疾病康复。 0003 感染生殖道疱疹的孕妇流产或早产的概率是正常孕妇的23倍。 孕妇生殖道病毒 活跃可导致生产时婴儿与感染的生殖道接触而引起严重的HSV病毒感染， 若孕妇生产时感 染了HSV， 4060的婴儿也会被感染， 如果不及时治疗， 会引发婴儿的高发病率和高死 亡率。 35的儿童到5岁时具有HSV-1病毒的抗体， 80的成人到25岁时特异性抗HSV-1病毒 的抗体。 0004 由于HSV-1和HSV-2具有相同的抗原决。

12、定簇， 这两种病毒的抗体可能会发生交叉反 应。 尽管体内有抗病毒抗体， 这两种类型的病毒也会经常复发。 快速准确地诊断HSV感染有 助于及早采用抗病毒治疗， 减少感染传播。 感染HSV后， 人体免疫系统会马上合成特异性抗 HSV IgM抗体， 一周后即可被检测到。 0005 一般HSV IgM抗体的存在表示近期感染或复发感染。 原发性感染病人23周后， 体 内一般会出现特异性IgG抗体， 但几个月后其滴度会下降， 而复发感染的病人滴度不会增 高。 通过对IgG的检测可评估患者的免疫状态并且提供HSV既往感染的血清学证据。 结合 HSV-1或HSV-2抗体血清转化的结果可帮助诊断近期(原发性或继。

13、发性)HSV感染。 0006 现有技术中， 常用的检测单纯疱疹病毒IgG抗体的方法有放射免疫技术(RIA)、 酶 联免疫分析技术(ELISA)及免疫印迹法(WB)， 但RIA具有存在放射性污染、 标记物半衰期短、 对操作者具有放射性损伤、 操作繁琐、 检测时间长等缺点； ELISA具有灵敏度低、 检测范围 窄、 检测时间长、 重复性差等缺点； WB具有免疫印迹法试剂需要低温保存等缺点。 说明书 1/19 页 4 CN 111007249 A 4 发明内容 0007 有鉴于此， 为解决现有技术中检测单纯疱疹病毒IgG抗体的方法存在的试剂有效 期短、 操作繁琐、 灵敏度低、 检测成本高的技术问题，。

14、 本发明提供一种单纯疱疹病毒抗体IgG 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。 0008 本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。 0009 单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 包括R1试剂、 R2试剂和项目稀释 液； 0010 R1试剂包括磁珠包被抗原， 抗原为HSV-1抗原或HSV-2抗原； 0011 R2试剂包括化学发光标记物标记的抗人IgG抗体； 0012 项目稀释液为pH6.08.0的含有盐、 表面活性剂、 防腐剂及蛋白的缓冲液。 0013 优选的是， 所述R1试剂中， 磁珠包被抗原的浓度为0.05wt0.2wt。 0014 优选的是， 所述磁珠包被抗原采用的磁珠的粒径为。

15、0.53.0 m。 0015 优选的是， 所述磁珠与包被抗原的质量比为10mg:(50500) g。 0016 优选的是， 所述R2试剂中， 化学发光标记物标记的抗人IgG抗体的浓度为0.11.0 g/ml。 0017 优选的是， 所述化学发光标记物标记的抗人IgG抗体， 抗人IgG抗体与化学发光标 记物的标记摩尔比为1:(310)； 化学发光标记物为吖啶酯或三联吡啶钌； 抗人IgG为鼠抗 人IgG或羊抗人IgG。 0018 优选的是， 所述项目稀释液中， 盐为50200mM的磷酸盐、 柠檬酸盐或Bistris丙 烷； 表面活性剂为0.020.05的吐温20或0.050.1氯化胆碱； 防腐剂为。

16、0.01 0.03的迭氮钠和0.010.03的PC300， 蛋白为0.13牛血清蛋白和0.010.2 牛球蛋白。 0019 优选的是， 该试剂盒还包括校准品、 化学发光激发液和清洗液中的一种或多种； 0020 所述校准品包括阳性校准品和阴性校准品， 阳性校准品为单纯疱疹病毒IgG阳性 血清灭活、 过滤后， 经缓冲液稀释而成； 阴性校准品为单纯疱疹病毒IgG阴性血清灭活、 过滤 后经缓冲液稀释而成； 0021 所述化学发光激发液包括A液和B液， A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液， B液为氢氧 化钠溶液； 0022 所述清洗液为PB缓冲液。 0023 上述单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫检测试剂盒的制。

17、备方法， 包括如下步骤： 0024 步骤一、 制备R1试剂 0025 将磁珠溶液混匀， 磁分离移除上清液， 清洗液清洗多次后重悬， 加入包被抗原， 混 匀， 并在持续旋转混匀下， 37孵育24h， 磁分离去上清液， 清洗液清洗多次后， 用赖氨酸 封闭液进行封闭， 磁分离去上清， 留取磁珠包被抗原， 用缓冲液重悬至所需浓度， 得到R1试 剂； 0026 步骤二、 制备R2试剂 0027 先将抗人IgG单克隆抗体放入离心管中， 保证抗人IgG单克隆抗体位于离心管底部 位置后加入碳酸缓冲液， 充分混匀， 混匀后加入化学发光标记物的N， N-二甲基甲酰胺溶液， 用离心机室温条件下离心2040s； 说明。

18、书 2/19 页 5 CN 111007249 A 5 0028 然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中， 将暗盒放入气浴恒温振荡器中混 匀， 加入赖氨酸封闭液， 放入气浴恒温振荡器中混匀， 封闭0.52h； 0029 再将封闭好的抗人IgG单克隆抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化， 用磷酸缓冲液洗脱， 分别收集； 0030 最后将收集好的抗人IgG单克隆抗体溶液用缓冲液稀释， 即为R2试剂； 0031 步骤三、 根据项目稀释液的配方配制项目稀释液； 0032 步骤四、 将R1试剂、 R2试剂和项目稀释液分装， 完成单纯疱疹病毒IgG的化学发光 免疫检测试剂盒的制备。 0033 优选的是， 所述。

19、步骤一中， 重悬使用的缓冲液为25M的pH7.2的Tris缓冲液； 所述步 骤二中， 稀释用的缓冲液与项目稀释液相同。 0034 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 0035 1、 本发明的单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒采用化学发光免疫分 析法检测， 该方法具有种操作简单， 无放射性风险及检测时间短， 并且可以对抗原、 抗体类 目标物质进行检测的优点。 0036 2、 本发明的单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫检测试剂盒选择吖啶酯等化学发光 标记物为化学发光免疫分析法的标记材料， 该类标记材料由激发态回到基态时产生的能量 跃迁为直接化学发光， 不需要酶的参与， 节约时间及成本。。

20、 0037 3、 本发明的单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发 光免疫分析仪为检测工具， 完成对单纯疱疹病毒IgG的检测； 试剂盒与仪器配套， 组成封闭 系统， 系统误差小； 可直接给出数值， 缩短了临床检测所需的时间； 减少人为操作误差， 检测 精度和灵敏度较高； 并且实现无人值守， 成本低。 0038 综上， 本发明的单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫检测试剂盒具有灵敏度高、 特异 性强、 稳定性好、 重复性好、 检测范围广、 检测时间短、 成本相对较低的优点， 可广泛用于临 床检测。 具体实施方式 0039 为了进一步理解本发明， 下面对本发明的具体实施方式进行详。

21、细描述， 但是应当 理解， 这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点， 而不是对本发明权利要求的限制。 0040 本发明的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒， 包括R1试剂、 R2试剂和 稀释液； 0041 R1试剂包括磁珠包被抗原， 抗原为HSV-1抗原或HSV-2抗原； 为使磁珠包被抗原稳 定保存， R1试剂还包括缓冲液； 0042 R2试剂包括化学发光标记物标记的抗人IgG抗体， 为使化学发光标记物标记的抗 人IgG抗体稳定保存， R2试剂还包括缓冲液； 0043 项目稀释液为pH6.08.0的含有盐、 表面活性剂、 防腐剂及蛋白的缓冲液。 0044 上述技术方案， R1试剂。

22、中的缓冲液和R2试剂中的缓冲液没有特殊限制， 能够起到 稳定保存磁珠包被抗原和化学发光标记物标记的抗人IgG抗体的作用即可， 如R1试剂中的 缓冲液为25M的pH为7.2的Tris溶液， R2试剂中的缓冲液与项目稀释液相同。 0045 上述技术方案， R1试剂中， 磁珠包被抗原的浓度优选为0.05wt0.2wt。 磁珠 说明书 3/19 页 6 CN 111007249 A 6 的粒径为0.53.0 m， 更优选的为3 m； 磁珠与包被抗原的质量比为10mg:(50500) g。 0046 上述技术方案， R2试剂中， 化学发光标记物标记的抗人IgG抗体的浓度为0.11.0 g/ml。 化学发。

23、光标记物标记的抗人IgG抗体， 抗人IgG抗体与化学发光标记物的标记的摩尔 比为1:(310)； 化学发光标记物为吖啶酯或三联吡啶钌， 优选为吖啶酯； 抗人IgG为鼠抗人 IgG或羊抗人IgG。 0047 上述技术方案， 项目稀释液中， 盐为50200mM的磷酸盐、 柠檬酸盐或Bistris丙 烷； 表面活性剂为0.020.05的吐温20或0.050.1氯化胆碱； 防腐剂为0.01 0.03的迭氮钠和0.010.03的PC300； 蛋白为0.13牛血清蛋白和0.010.2 牛球蛋白。 0048 本发明的单纯疱疹病毒抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒根据实际情况， 还可以 包括校准品、 化学发光激。

24、发液和清洗液中的一种或多种： 0049 校准品包括阳性校准品和阴性校准品。 阳性校准品为由单纯疱疹病毒IgG阳性血 清灭活、 过滤后， 经缓冲液稀释而成； 阴性校准品为多份阴性单纯疱疹病毒IgG浓度不同的 溶液， 由单纯疱疹病毒IgG阴性血清灭活、 过滤后， 经缓冲液稀释而成； 一般阳性校准品的S/ CO值为2.5， 阴性校准品S/CO值为0。 优选的， 灭活为0灭活1h， 过滤采用0.22 m滤膜进行过 滤。 缓冲液为含有20小牛血清的100mM PBS缓冲液。 0050 化学发光激发液包括A液和B液， A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液， B液为氢氧化钠 溶液。 0051 清洗液为PB缓冲液。 。

25、0052 上述的单纯疱疹病毒IgG的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 包括如下步骤： 0053 步骤一、 制备R1试剂 0054 将磁珠溶液混匀， 磁分离移除上清液， 清洗液清洗多次后重悬， 加入包被抗原， 混 匀， 并在持续旋转混匀下， 37孵育24h， 磁分离去上清液， 清洗液清洗多次后， 用赖氨酸 封闭液进行封闭， 磁分离去上清， 留取磁珠包被抗原， 用缓冲液重悬至所需浓度， 得到R1试 剂； 0055 步骤二、 制备R2试剂 0056 先将抗人IgG单克隆抗体放入离心管中， 保证抗人IgG单克隆抗体位于离心管底部 位置后加入碳酸缓冲液， 充分混匀， 混匀后加入化学发光标记物的N， N。

26、-二甲基甲酰胺(DMF) 溶液， 用离心机室温条件下离心2040s； 0057 然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中， 将暗盒放入气浴恒温振荡器中混 匀， 加入赖氨酸封闭液， 放入气浴恒温振荡器中混匀， 封闭0.52h； 0058 再将封闭好的抗人IgG单克隆抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化， 用磷酸缓冲液洗脱， 分别收集； 0059 最后将收集好的抗人IgG单克隆抗体溶液用缓冲液稀释， 即为R2试剂； 0060 步骤三、 根据项目稀释液的配方配制项目稀释液； 0061 步骤四、 将R1试剂、 R2试剂和项目稀释液分装， 完成单纯疱疹病毒IgG的化学发光 免疫检测试剂盒的制备； 0062 如。

27、果试剂盒中还包括校准品、 化学发光激发液和清洗液中的一种或多种， 那么再 相应的分别配制校准品、 化学发光激发液和清洗液中的一种或多种， 然后分装即可。 说明书 4/19 页 7 CN 111007249 A 7 0063 上述技术方案， 步骤一中， 混匀采用的设备均为涡旋混匀仪， 磁分离采用的设备均 为磁力分离架， 磁分离的时间一般为13min， 也可能更长， 以液体分层， 出现上清液为目 的。 磁珠溶液为Tosyl磁珠溶液。 磁珠溶液的浓度， 没有特殊限制， 优选为10mg/mL。 清洗液为 PB缓冲液， 浓度优选为0.02M， 清洗次数一般为三次。 赖氨酸溶液的浓度为20wt。 磁珠与包。

28、 被抗原的质量比为10mg:(50500) g。 重悬使用的缓冲液为25M的pH7.2的Tris缓冲液。 R1 试剂需在28保存。 0064 上述技术方案， 步骤二中， 保证抗人IgG单克隆抗体位于离心管底部采取的技术手 段一般是使离心机室温离心2040s； 抗人IgG单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比 优选为1:(310)； 吖啶酯的DMF溶液的浓度一般为2mg/mL； 气浴恒温振荡器的温度优选为 25， 气浴恒温振荡器中混匀一般需要24h， 速度一般采用中速； 赖氨酸封闭液的浓度为 20wt， 其加入量与抗人IgG单克隆抗体的配比为： 1mL:500 g； R2试剂需在28保存。 00。

29、65 本发明的单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒能够用于检测单纯疱疹 病毒IgG抗体。 在检测时， 先利用全自动化学发光免疫分析仪(CM180)对阴性校准品和阳性 校准品进行检测， 仪器根据测量的化学发光信号值自动计算cutoff； 然后根据需求测试待 测样本， 仪器将待测样本获得的化学发光信号值和定标获得的cutoff值比较， 自动计算检 测结果， 待测样本的结果以有反应性或无-反应性以及cutoff指数(样本信号值/cutoff值) 表示， 最后对单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒进行性能的评价。 每个待测物 的检测过程为： 将待测物(10 L)、 R1试剂(40 L)。

30、和项目稀释液(50 L)共同孵育18min， 清洗 5min， 再与R2试剂(50 L)反应， 形成磁微球-HSV抗原-HSV抗体-抗人IgG抗体-化学发光标记 物复合物， 通过磁分离器分离免疫复合物， 洗掉游离的成分， 通过化学发光激发液激发化学 发光标记物发光， 记录相对发光强度(RLU)。 0066 以下结合实施例进一步说明本发明。 0067 实施例1 0068 步骤一、 校准品的制备 0069 阳性校准品： 0070 将单纯疱疹病毒IgG阳性血清60灭活1h后， 过滤， 用缓冲液稀释至S/CO值为2.5； 缓冲液为含有20小牛血清的100mM PBS缓冲液。 0071 阴性校准品： 0。

31、072 将单纯疱疹病毒IgG阴性血清60灭活1h后， 过滤， 用缓冲液稀释至S/CO值为0； 缓 冲液为含有20小牛血清的100mM PBS缓冲液。 0073 步骤二、 R1试剂的制备 0074 使用涡旋混匀仪将1mL Tosyl磁珠(10mg/mL)溶液混匀， 置于磁力分离架上1min， 移除上清液， 用0.02M的PB缓冲液清洗三次后重悬， 加入0.05mg包被抗原， 混匀， 并在持续旋 转混匀下， 37孵育2h， 磁分离去上清液用0.02M的PB缓冲液清洗三次后用20wt的赖氨酸 封闭液进行封闭， 磁分离去上清， 留取磁珠包被抗原， 用25M的pH7.2的Tris缓冲液重悬至磁 珠包被抗。

32、原的浓度为0.05wt， 得到R1试剂， 保存于28。 0075 步骤三、 R2试剂的制备 0076 将500 g抗体放入离心管中， 保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s) 后加入碳酸缓冲溶液， 充分混匀， 混匀后加入0.75 L 2mg/mL吖啶酯的DMF溶液， 用离心机室 说明书 5/19 页 8 CN 111007249 A 8 温条件下离心20s。 将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中， 之后将暗盒放入气浴恒温振 荡器(25)， 混匀2h。 加入1mL 20赖氨酸封闭液， 放入气浴恒温振荡器(25)， 中速混匀， 封闭时间为0.5h。 将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯。

33、化， 用PB缓冲液洗脱， 收集， 用缓 冲液稀释至终浓度为0.1 g/mL， 28保存； 0077 缓冲液为含有50mM柠檬酸、 0.02的吐温20、 0.01的迭氮钠、 0.01的PC300、 0.1牛血清蛋白和0.01牛球蛋白的pH6.0的缓冲液。 0078 步骤四、 项目稀释液的制备 0079 根据项目稀释液的配方配制项目稀释液， 项目稀释液为含有50mM柠檬酸、 0.02 的吐温20、 0.01的迭氮钠、 0.01的PC300、 0.1牛血清蛋白和0.01牛球蛋白的 pH6.0的缓冲液。 0080 步骤五、 将校准品、 R1试剂、 R2试剂和项目稀释液分装， 完成单纯疱疹病毒IgG的化。

34、 学发光免疫检测试剂盒的制备。 0081 实施例2 0082 步骤一、 校准品的制备 0083 同实施例1。 0084 步骤二、 R1试剂的制备 0085 使用涡旋混匀仪将1mL Tosyl磁珠(10mg/mL)溶液混匀， 置于磁力分离架上2min， 移除上清液， 用0.02M的PB缓冲液清洗三次后重悬， 加入0.25mg包被抗原， 混匀， 并在持续旋 转混匀下， 37孵育3h， 磁分离去上清液用0.02M的PB缓冲液清洗三次后用20wt的赖氨酸 封闭液进行封闭， 磁分离去上清， 留取磁珠包被抗原， 用25M的pH7.2的Tris缓冲液重悬至磁 珠包被抗原的浓度为0.1wt， 得到R1试剂， 。

35、保存于28。 0086 步骤三、 R2试剂的制备 0087 将500 g抗体放入离心管中， 保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心30s) 后加入碳酸缓冲溶液， 充分混匀， 混匀后加入2.5 L 2mg/mL吖啶酯的DMF溶液， 用离心机室 温条件下离心30s。 将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中， 之后将暗盒放入气浴恒温振 荡器(25)， 混匀3h。 加入1mL20赖氨酸封闭液， 放入气浴恒温振荡器(25)， 中速混匀， 封闭时间为1h。 将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化， 用PB缓冲液洗脱， 收集， 用缓冲 液稀释至终浓度为0.5 g/mL， 28保存； 0088 缓冲液为含。

36、有100mM的Bistris丙烷、 0.05氯化胆碱、 0.02的迭氮钠、 0.02的 PC300、 1牛血清蛋白和0.1牛球蛋白的pH7.0的缓冲液。 0089 步骤四、 项目稀释液的制备 0090 根据项目稀释液的配方配制项目稀释液， 项目稀释液为含有100mM的Bistris丙 烷、 0.05氯化胆碱、 0.02的迭氮钠、 0.02的PC300、 1牛血清蛋白和0.1牛球蛋白 的pH7.0的缓冲液。 0091 步骤五、 将校准品、 R1试剂、 R2试剂和项目稀释液分装， 完成单纯疱疹病毒IgG的化 学发光免疫检测试剂盒的制备。 0092 实施例3 0093 步骤一、 校准品的制备 009。

37、4 同实施例1。 说明书 6/19 页 9 CN 111007249 A 9 0095 步骤二、 R1试剂的制备 0096 使用涡旋混匀仪将1mL Tosyl磁珠(10mg/mL)溶液混匀， 置于磁力分离架上3min， 移除上清液， 用0.02M的PB缓冲液清洗三次后重悬， 加入0.5mg包被抗原， 混匀， 并在持续旋 转混匀下， 37孵育4h， 磁分离去上清液用0.02M的PB缓冲液清洗三次后用20wt的赖氨酸 封闭液进行封闭， 磁分离去上清， 留取磁珠包被抗原， 用25M的pH7.2的Tris缓冲液重悬至磁 珠包被抗原的浓度为0.2wt， 得到R1试剂， 保存于28。 0097 步骤三、 。

38、R2试剂的制备 0098 将500 g抗体放入离心管中， 保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心40s) 后加入碳酸缓冲溶液， 充分混匀， 混匀后加入5 L 2mg/mL吖啶酯的DMF溶液， 用离心机室温 条件下离心40s。 将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中， 之后将暗盒放入气浴恒温振荡 器(25)， 混匀4h。 加入1mL 20赖氨酸封闭液， 放入气浴恒温振荡器(25)， 中速混匀， 封 闭时间为2h。 将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化， 用PB缓冲液洗脱， 收集， 用缓冲液 稀释至终浓度为1.0 g/mL， 28保存； 0099 缓冲液为含有200mM的磷酸盐、 0.05的。

39、吐温20、 0.03的迭氮钠、 0.03的 PC300、 3牛血清蛋白和0.2牛球蛋白的pH8.0的缓冲液。 0100 步骤四、 项目稀释液的制备 0101 根据项目稀释液的配方配制项目稀释液， 项目稀释液为含有200mM的磷酸盐、 0.05的吐温20、 0.03的迭氮钠、 0.03的PC300、 3牛血清蛋白和0.2牛球蛋白的 pH8.0的缓冲液。 0102 步骤五、 将校准品、 R1试剂、 R2试剂和项目稀释液分装， 完成单纯疱疹病毒IgG的化 学发光免疫检测试剂盒的制备。 0103 对实施例1的单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光检测试剂盒进行检测。 0104 用本发明的风疹病毒纯疱疹病毒Ig。

40、G抗体检测试剂盒分别对HSV-1IgG抗体检测试 剂盒国家参考品(采购自中检院， 批号： 370015-201801)和HSV-2IgG抗体检测试剂盒国家参 考品(采购自中检院， 批号： 批号： 370016-201801)进行检测， 结果如下： 0105 1.HSV-1IgG抗体检测试剂盒性能评估 0106 (1)阴性参考品符合率 0107 用试剂盒测定国家阴性参考品， 结果如表1： 测试结果均为阴性， 与国家阴性参考 品完全符合。 0108 表1阴性参考品测定结果 0109 0110 (2)阳性参考品符合率 说明书 7/19 页 10 CN 111007249 A 10 0111 用试剂盒。

41、测定国家阳性参考品， 结果如表2： 测试结果均为阳性， 与国家阳性参考 品完全符合。 0112 表2阳性参考品测定结果 0113 0114 (3)最低检出限 0115 用试剂盒测定国家最低检出限参考品， 结果如表3： 测试结果符合国家检测限参考 品要求。 0116 表3最低检出限考品测定结果 0117 0118 (4)重复性 0119 用试剂盒对国家重复性参考品进行检测， 重复测定10次， 计算10次测量结果的平 均值和标准差SD， 根据公式(1)计算变异系数(CV)不大于15， 测试结果如表4： 变异系数 为1.31。 0120 0121 式中： CV变异系数； 0122 SD测量结果的标准。

42、差； 0123测量结果的平均值。 0124 表4重复性测定结果 说明书 8/19 页 11 CN 111007249 A 11 0125 0126 0127 2.HSV-2IgG抗体检测试剂盒性能评估 0128 (1)阴性参考品符合率 0129 用试剂盒测定国家阴性参考品， 结果如表5： 测试结果均为阴性， 与国家阴性参考 品完全符合。 0130 表5阴性参考品测定结果 0131 0132 (2)阳性参考品符合率 0133 用试剂盒测定国家阳性参考品， 结果如表6： 测试结果均为阳性， 与国家阳性参考 品完全符合。 0134 表6阳性参考品测定结果 说明书 9/19 页 12 CN 11100。

43、7249 A 12 0135 0136 (3)最低检出限 0137 用试剂盒测定国家最低检出限参考品， 结果如表7： 测试结果符合国家检测限参考 品要求。 0138 表7最低检出限考品测定结果 0139 0140 (4)重复性 0141 用试剂盒对国家重复性参考品进行检测， 重复测定10次， 计算10次测量结果的平 均值和标准差SD， 根据公式(1)计算变异系数(CV)不大于15， 测试结果如表8： 变异系数 为2.21。 0142 0143 式中： CV变异系数； 0144 SD测量结果的标准差； 0145测量结果的平均值。 0146 表8重复性测定结果 说明书 10/19 页 13 CN 。

44、111007249 A 13 0147 0148 0149 对实施例2的单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光检测试剂盒进行检测。 0150 用本发明的风疹病毒纯疱疹病毒IgG抗体检测试剂盒分别对HSV-1IgG抗体检测试 剂盒国家参考品(采购自中检院， 批号： 370015-201801)和HSV-2IgG抗体检测试剂盒国家参 考品(采购自中检院， 批号： 批号： 370016-201801)进行检测， 结果如下： 0151 1.HSV-1IgG抗体检测试剂盒性能评估 0152 (1)阴性参考品符合率 0153 用试剂盒测定国家阴性参考品， 结果如表9： 测试结果均为阴性， 与国家阴性参考 品完全符。

45、合。 0154 表9阴性参考品测定结果 0155 0156 (2)阳性参考品符合率 0157 用试剂盒测定国家阳性参考品， 结果如表10： 测试结果均为阳性， 与国家阳性参考 品完全符合。 0158 表10阳性参考品测定结果 说明书 11/19 页 14 CN 111007249 A 14 0159 0160 0161 (3)最低检出限 0162 用试剂盒测定国家最低检出限参考品， 结果如表11： 测试结果符合国家检测限参 考品要求。 0163 表11最低检出限考品测定结果 0164 0165 (4)重复性 0166 用试剂盒对国家重复性参考品进行检测， 重复测定10次， 计算10次测量结果的。

46、平 均值和标准差SD， 根据公式(1)计算变异系数(CV)不大于15， 测试结果如表12： 变异系 数为2.05。 0167 0168 式中： CV变异系数； 0169 SD测量结果的标准差； 0170测量结果的平均值。 0171 表12重复性测定结果 0172 说明书 12/19 页 15 CN 111007249 A 15 0173 0174 2.HSV-2IgG抗体检测试剂盒性能评估 0175 (1)阴性参考品符合率 0176 用试剂盒测定国家阴性参考品， 结果如表13： 测试结果均为阴性， 与国家阴性参考 品完全符合。 0177 表13阴性参考品测定结果 0178 0179 (2)阳性。

47、参考品符合率 0180 用试剂盒测定国家阳性参考品， 结果如表14： 测试结果均为阳性， 与国家阳性参考 品完全符合。 0181 表14阳性参考品测定结果 说明书 13/19 页 16 CN 111007249 A 16 0182 0183 (3)最低检出限 0184 用试剂盒测定国家最低检出限参考品， 结果如表15： 测试结果符合国家检测限参 考品要求。 0185 表15最低检出限考品测定结果 0186 0187 (4)重复性 0188 用试剂盒对国家重复性参考品进行检测， 重复测定10次， 计算10次测量结果的平 均值和标准差SD， 根据公式(1)计算变异系数(CV)不大于15， 测试结果。

48、如表16： 变异系 数为1.87。 0189 0190 式中： CV变异系数； 0191 SD测量结果的标准差； 0192测量结果的平均值。 0193 表16重复性测定结果 说明书 14/19 页 17 CN 111007249 A 17 0194 0195 对实施例3的单纯疱疹病毒IgG抗体化学发光检测试剂盒进行检测。 0196 用本发明的风疹病毒纯疱疹病毒IgG抗体检测试剂盒分别对HSV-1IgG抗体检测试 剂盒国家参考品(采购自中检院， 批号： 370015-201801)和HSV-2IgG抗体检测试剂盒国家参 考品(采购自中检院， 批号： 批号： 370016-201801)进行检测，。

49、 结果如下： 0197 1.HSV-1IgG抗体检测试剂盒性能评估 0198 (1)阴性参考品符合率 0199 用试剂盒测定国家阴性参考品， 结果如表17： 测试结果均为阴性， 与国家阴性参考 品完全符合。 0200 表17阴性参考品测定结果 0201 0202 (2)阳性参考品符合率 0203 用试剂盒测定国家阳性参考品， 结果如表18： 测试结果均为阳性， 与国家阳性参考 品完全符合。 说明书 15/19 页 18 CN 111007249 A 18 0204 表18阳性参考品测定结果 0205 0206 (3)最低检出限 0207 用试剂盒测定国家最低检出限参考品， 结果如表19： 测试。

50、结果符合国家检测限参 考品要求。 0208 表19最低检出限考品测定结果 0209 0210 0211 (4)重复性 0212 用试剂盒对国家重复性参考品进行检测， 重复测定10次， 计算10次测量结果的平 均值和标准差SD， 根据公式(1)计算变异系数(CV)不大于15， 测试结果如表20： 变异系 数为5.1。 0213 0214 式中： CV变异系数； 0215 SD测量结果的标准差； 0216测量结果的平均值。 0217 表20重复性测定结果 说明书 16/19 页 19 CN 111007249 A 19 0218 0219 2.HSV-2IgG抗体检测试剂盒性能评估 0220 (1。