鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911316759.X (22)申请日 2019.12.19 (71)申请人 广州渔跃生物技术有限公司 地址 510535 广东省广州市黄埔区瑞和路 79号203房 (72)发明人 张毓金严悌昆谢秉超黄淑芬 张桂平 (74)专利代理机构 广州科沃园专利代理有限公 司 44416 代理人 张帅 (51)Int.Cl. A61K 39/15(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61K 39/235(2006.01) A61P 31/14(2006.01)。

2、 A61P 31/20(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病 毒三联灭活疫苗及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及灭活疫苗领域， 针对鸭体免疫效 果较差的问题， 提供了一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦 布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗及其制备方 法， 该技术方案如下： 由鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦 布苏病毒抗原、 鸭腺病毒抗原以及含有浓度为 8mmol/L-11mmol/L酪蛋白的佐剂组成， 其中鸭呼 肠 孤 病 毒 抗 原 含 量 为 1 0 8 . 0 T C I D5 0/ m L。

3、 - 108 .5TCID50/mL， 鸭坦布苏病毒抗原含量为 108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL， 鸭腺病毒抗原含 量为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL； 通过提供一 种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联 灭活疫苗， 使得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病 毒抗原和鸭腺病毒抗原不会相互干扰， 增强了鸭 体免疫功能。 权利要求书1页 说明书13页 CN 111000992 A 2020.04.14 CN 111000992 A 1.一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 其特征是： 由鸭呼肠孤 病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原。

4、、 鸭腺病毒抗原以及含有浓度为8mmol/L-11mmol/L酪蛋白的 佐剂组成， 其中鸭呼肠孤病毒抗原含量为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL， 鸭坦布苏病毒抗 原含量为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL， 鸭腺病毒抗原含量为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/ mL。 2.根据权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 其特征是： 所述鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原及鸭腺病毒抗原体积比4:4:2。 3.根据权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 其特征是：。

5、 所述鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原及鸭腺病毒抗原与佐剂的质量比为 1:1-2.5。 4.根据权利要求3所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 其特征是： 所述佐剂包括油包水乳剂、 水包油乳剂、 水包油包水乳剂、 脂多糖、 卡波姆中的一 种或多种。 5.根据权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 其特征是： 所述佐剂还包括质量份数为1-2.5的头孢羟氨苄。 6.根据权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗 的制备方法， 其特征是： 包括以下步骤： S1.在长满致密单层LMH细胞， 将鸭呼肠孤病毒抗原、。

6、 鸭坦布苏病毒抗原、 鸭腺病毒抗原 接种至LMH细胞上， 在37条件下， 加入维持液培养； S2.细胞病变达80收获病毒， 反复冻融， 离心、 浓缩以形成制苗病毒液； S3.对病毒液进行病毒含量检验； S4.病毒含量检验合格的病毒用于配苗。 7.根据权利要求6述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的 制备方法， 其特征是： 所述细胞维持液中为无血清的DMEM/F12培养液。 8.根据权利要求6的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的制 备方法， 其特征是： 所述细胞维持液中还含有谷氨酰胺。 9.根据权利要求6所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒。

7、三联灭活疫苗 的制备方法， 其特征是： 所述步骤S2中， 冻融次数为3次， 并将病毒保存在-25下条件下。 10.根据权利要求1-5任意一项所述的一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三 联灭活疫苗在制备预防和治疗番鸭呼肠病毒病、 鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111000992 A 2 一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗 及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及多联灭活疫苗领域， 尤其是涉及一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和 鸭腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法。 背景技术 0002 番鸭呼肠病毒病是由鸭呼肠孤病毒(MD。

8、RV)引起的一种急性、 烈性传染病。 该病因 其肝脾等脏器出现白色坏死点， 又称番鸭肝白点病或者花肝病， 具有较高的发病率和致死 率， 该病多发生于7-35日龄， 以10-25日龄的雏番鸭最易发生， 发病率30-90， 病死率 60-80。 鸭呼肠孤病毒(MDRV)呈球形， 无囊膜， 有可见的双层衣壳结构， 鸭呼肠孤病毒对 紫外线、 温度和PH敏感， 对有机溶剂不敏感。 0003 鸭坦布苏病毒病是由黄病毒属中的鸭坦布苏病毒所引起的一种急性传染病， 主要 临床症状为高热、 食欲不振， 产蛋量严重下降， 部分病鸭还表现出神经症状， 该病发病率 80以上， 死亡率在2-10， 其病理特征为卵巢的充血。

9、、 出血、 变形和淋巴细胞浸润， 肝门 管区间隙炎症， 该病自爆发以来， 迅速传播至东南各省份， 包扩浙江， 江苏， 福建， 安徽， 并继 续蔓延至山东， 河南， 湖南， 湖北， 江西等省份。 0004 I群2型腺病毒病主要是由鸭腺病毒引起的一类疾病， 主要临床症状是心包积液和 肝坏死， 唯有发展疫苗是预防这三种病毒的关键， 但是多种抗原做成疫苗很容易产生相互 干扰， 多种抗原之间相互竞争， 降低了免疫效果， 因此， 还有改善的空间。 发明内容 0005 针对现有技术存在的不足， 本发明的第一目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦 布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 具有较高免疫效果的优点。 00。

10、06 为实现上述目的， 本发明提供了如下技术方案： 0007 一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 由鸭呼肠孤病毒抗 原、 鸭坦布苏病毒抗原、 鸭腺病毒抗原以及含有浓度为8mmol/L-11mmol/L酪蛋白的佐剂组 成， 其中鸭呼肠孤病毒抗原含量为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL， 鸭坦布苏病毒抗原含量 为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL， 鸭腺病毒抗原含量为108.0TCID50/mL-108.5TCID50/mL。 0008 通过采用上述技术方案， 利用鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原、 鸭腺病毒抗 原以及佐剂制。

11、备形成三联疫苗， 使得注射了疫苗的鸭体能够产生较佳的保护性免疫应答， 增强鸭体免疫功能， 对特异性或非特异性免疫有促进作用， 还意外的发现了鸭腺病毒抗原 与鸭坦布苏病毒抗原结合的情况下， 增强了鸭呼肠孤病毒抗原的免疫效果， 使得鸭体具有 较佳的免疫功能， 进而使得注射了该三联灭活疫苗的鸭子能够同时具备抵抗番鸭呼肠病毒 病、 鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病三种疾病。 0009 意外发现在佐剂中加入酪蛋白， 使得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭腺病毒抗原与鸭坦布 苏病毒抗原三种抗原不会相互干扰， 且三种抗原不产生相互竞争的情况， 并且使得鸭腺病 说明书 1/13 页 3 CN 111000992 A 3 。

12、毒抗原与鸭坦布苏病毒抗原结合， 促进了鸭呼肠孤病毒抗原在鸭体内的免疫效果， 使得鸭 体具有较佳的免疫应答， 进而增加了鸭体的免疫功能， 使得鸭体可同时抵抗鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒。 0010 本发明进一步设置为： 所述鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原及鸭腺病毒抗 原体积比为4:4:2。 0011 通过采用上述技术方案， 通过鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原及鸭腺病毒 抗原按体积比为4:4:2接种细胞制备病毒液， 较好的保护三种病毒抗原， 使得制备的病毒液 质量较佳。 0012 本发明进一步设置为： 所述鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原及鸭腺病毒抗 原与佐剂的质量比为1。

13、:1-2.5。 0013 通过采用上述技术方案， 通过三种抗原与佐剂的质量比为1:1-2.5， 使得佐剂能够 更好的促进鸭腺病毒抗原与鸭坦布苏病毒抗原结合， 进而使得鸭呼肠孤病毒抗原效价含量 较高， 增强鸭体抗鸭呼肠孤病毒的能力， 同时由于三种抗原之间不发生相互干扰， 使得鸭体 抵抗鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒效果也较为稳定。 0014 本发明进一步设置为： 所述佐剂包括油包水乳剂、 水包油乳剂、 水包油包水乳剂、 脂多糖、 卡波姆中的一种或多种。 0015 通过采用上述技术方案， 通过佐剂为油包水乳剂、 水包油乳剂、 水包油包水乳剂、 脂多糖、 卡波姆中的一种或多种， 能够非特异性的改变或增强鸭体。

14、对抗原的特异性应答， 诱 发鸭体产生长期、 高效的特异性免疫反应， 提高了鸭体保护能力， 减少免疫物质的用量， 从 而使得降低了三联灭活疫苗的生产成本。 0016 本发明进一步设置为： 所述佐剂还包括质量份数为1-2.5的头孢羟氨苄。 0017 通过采用上述技术方案， 通过在佐剂中加入头孢羟氨苄， 使得鸭体具有较强的特 异性免疫反应， 提高了鸭体的保护能力， 减少由于佐剂中含有脂多糖带来的毒副作用， 使得 增加佐剂与抗原结合的稳定性。 0018 针对现有技术存在的不足， 本发明的第二目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦 布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的制备方法， 使得三联灭活疫苗具有较高的产量。

15、。 0019 一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的制备方法， 包括以 下步骤： 0020 S1.在长满致密单层LMH细胞， 将鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原、 鸭腺病毒 抗原接种至LMH细胞上， 在37条件下， 加入维持液培养； 0021 S2.细胞病变达80收获病毒， 反复冻融， 离心、 浓缩以形成制苗病毒液； 0022 S3.对病毒液进行病毒含量和纯净性检验； 0023 S4.纯净性检验合格的病毒用于配苗。 0024 通过采用上述技术方案， 通过用LMH传代细胞作为宿主细胞， 并且制备疫苗， 半抗 原高度澄清， 浓缩较为简单的处理， 非常适合进行高抗原滴度的优质灭。

16、活疫苗的生产。 0025 通过对病毒液进行病毒含量和纯净性的检查， 使得得到的病毒较为稳定且病毒的 质量较高， 减少杂质的存在于病毒中影响配置疫苗的情况。 0026 本发明进一步设置为： 所述细胞维持液中为无血清的DMEM/F12培养液。 0027 通过采用上述技术方案， 通过细胞维持液中无血清的DMEM/F12培养液， 避免血清 说明书 2/13 页 4 CN 111000992 A 4 对细胞的毒性作用和血清源性污染， 并且易于纯化。 0028 本发明进一步设置为： 所述细胞维持液中还含有谷氨酰胺。 0029 通过采用上述技术方案， 通过在细胞维持液中加入谷氨酰胺， 使得在细胞生长中 有比。

17、较重要的能源和氮源， 维持细胞正常的生理功能和生长代谢。 0030 本发明进一步设置为： 所述步骤S2中， 冻融次数为3次， 并将病毒保存在-25下条 件下。 0031 通过采用上述技术方案， 通过对病毒冻融3次， 使得病毒获得更高的效价， 减少由 于冻融次数过少使得病毒不能彻底释放的情况和由于冻融次数过多影响细胞生长活性的 情况。 0032 针对现有技术存在的不足， 本发明的第三目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦 布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗在制备预防和治疗番鸭呼肠病毒病、 鸭坦布苏病毒病和 I群2型腺病毒病种的应用， 使得三联灭活疫苗具有较佳的预防和治疗番鸭呼肠病毒病、 鸭 坦布苏病毒。

18、病和I群2型腺病毒病的效果。 0033 一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗在制备预防和治疗番 鸭呼肠病毒病、 鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病的应用。 0034 通过采用上述技术方案， 通过将制备的三联灭活疫苗用于预防和治疗番鸭呼肠病 毒病、 鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病， 使得鸭体能够同时抵抗番鸭呼肠病毒病、 鸭坦布 苏病毒病和I群2型腺病毒病， 降低了免疫成本， 具有商业应用价值。 0035 综上所述， 本发明具有以下有益效果： 0036 1.通过提供一种鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗， 使得鸭 呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原和鸭腺病毒抗原不。

19、会相互干扰， 增强了鸭体免疫功能； 0037 2.发明人意外地发现鸭腺病毒抗原与鸭坦布苏病毒抗原结合的情况下， 增强了鸭 呼肠孤病毒抗原的免疫效果， 使得鸭体具有较佳的免疫功能； 0038 3.本发明预防和治疗番鸭呼肠病毒病、 鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病的三联 灭活疫苗， 制备方法简单， 与分次免疫相比， 降低了免疫成本。 具体实施方式 0039 以下实施例， 对本发明作进一步详细说明。 0040 本发明中的鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒,均是国内市场常见的商品 化毒种。 0041 以下实施例中， 佐剂中的酪蛋白采用武汉信之德生物科技有限公司出售的酪蛋 白。 0042 以下实施例。

20、中， 白油采用广州特韵贸易有限公司出售的白矿油。 0043 以下实施例中， 硬脂酸铝采用天津金汇太亚化学试剂有限公司出售的硬脂酸铝。 0044 以下实施例中， 司盘-80采用江苏省海安石油化工厂出售的司盘-80， CAS:1338- 43-8。 0045 以下实施例中， 头孢羟氨苄采用上海萌桠生物科技有限公司出售的头孢羟氨苄。 0046 以下实施例中， 脂多糖采用北京索莱宝科技有限公司出售的脂多糖， 货号为 L8880。 说明书 3/13 页 5 CN 111000992 A 5 0047 以下实施例中， 卡波姆采用博峰化工科技有限公司出售的卡波姆934. 0048 以下实施例中， 谷氨酰胺采。

21、用武汉泰利浦生物科技有限公司出售的L-谷氨酰胺。 0049 以下实施例中， N-N-二乙基-1-4-苯二胺采用天津振泰化工有限公司出售的N-N- 二乙基-1-4-苯二胺。 0050 实施例1 0051 S1.细胞载体的制备： 将LMH细胞用浓度为0.25的胰酶进行消化分散， 加入5新 生牛血清的DMEM/F12培养液在转瓶内37、 5CO2培养至细胞单层后， 弃去5新生牛血清 的DMEM/F12培养液， 接种细胞维持液， 用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次， 得细胞载体； 0052 细胞维持液包含无血清DMEM/F12培养液、 2mM/ML谷氨酰胺、 0.2mM/ML N-N-二乙 基。

22、-1-4-苯二胺； 0053 S2.病毒的接种： 将鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的病毒液分别按体积 为4:4:2接种至步骤S1得到的细胞载体中， 放置37条件下吸附30min后吸弃病毒液， 然后 加入含1新生牛血清的DMEM/F12培养液于37、 5CO2条件下培养48h， 当细胞病变达 80收获病变细胞； 0054 S3.病毒液收集： 将步骤S2得到的病变细胞在-25下条件下， 反复冻融3次后， 然 后在5、 5000rpm离心15min， 分别收集鸭呼肠孤病毒上清液、 鸭坦布苏病毒上清液和鸭腺 病毒上清液， 将离心后的上清液分别用于超滤浓缩， 将离心后的上清液分别用30K中空纤维。

23、 柱将其浓缩10倍后， 取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液作10倍递进稀释10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9及10-10。 0055 S4.病毒液病毒含量检测： 分别取(10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9)五个稀释度的三种病 毒液接种48孔铺满单层LMH细胞培养板， 每个稀释度重复5孔， 同时设立阴性对照细胞， 每孔 放入0.2mL病毒液， 在5CO2、 37培养120小时， 观察细胞病变(CPE)， 计算TCID50， 三种病 毒含量达到108.0TCID50/mL， 可用于制苗； 0056。

24、 S5.病毒灭活： 用0.1福尔马林灭活步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒液、 鸭坦布苏病 毒液及鸭腺病毒液， 即得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原和鸭腺病毒抗原； 0057 S6.疫苗制剂配置： 0058 S61.在搅拌釜中加入检测合格的三种抗原、 4g灭菌后的吐温-80， 搅拌速率100r/ min， 搅拌10min， 使得吐温-80完全溶解， 即形成预混液； 0059 S62.在步骤S61基础上， 向搅拌釜中加入浓度为76g白油、 5g硬脂酸铝、 6g司盘-80、 8g酪蛋白、 1g头孢羟氨苄、 3g脂多糖、 1g卡波姆， 搅拌速率120r/min， 搅拌20min， 边搅拌边升 温， 直至。

25、硬脂酸铝充分溶解至透明为至， 高温灭菌备用； 0060 S63.乳化、 分装： 利用IKA乳化机进行乳化， 16000rpm， 乳化5分钟即形成疫苗， 将制 备的疫苗按照每瓶250mL进行分装； 0061 在本实施例中， 三种抗原与佐剂的质量比为1:1。 0062 实施例2 0063 S1.细胞载体的制备： 将LMH细胞用浓度为0.25的胰酶进行消化分散， 加入7新 生牛血清的DMEM/F12培养液在转瓶内37、 5CO2培养至细胞单层后， 弃去7新生牛血清 的DMEM/F12培养液， 接种细胞维持液， 用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次， 得细胞载体； 0064 细胞维持液包含无血清。

26、DMEM/F12培养液、 2mM/ML谷氨酰胺、 0.2mM/ML N-N-二乙 说明书 4/13 页 6 CN 111000992 A 6 基-1-4-苯二胺； 0065 S2.病毒的接种： 将鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的病毒液分别按体积 为4:4:2接种至步骤S1得到的细胞载体中， 放置37条件下吸附35min后吸弃病毒液， 然后 加入含1.5新生牛血清的DMEM/F12培养液于37、 5CO2条件下培养48h， 当细胞病变达 80收获病变细胞； 0066 S3.病毒液收集： 将步骤S2得到的病变细胞在-25下条件下， 反复冻融3次后， 然 后在5、 5000rpm离心15mi。

27、n， 分别收集鸭呼肠孤病毒上清液、 鸭坦布苏病毒上清液和鸭腺 病毒上清液， 将离心后的上清液分别用于超滤浓缩， 将离心后的上清液分别用30K中空纤维 柱将其浓缩10倍后， 取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液作10倍递进稀释10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9及10-10。 0067 S4.病毒液病毒含量检测： 分别取(10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9)五个稀释度的三种病 毒液接种48孔铺满单层LMH细胞培养板， 每个稀释度重复5孔， 同时设立阴性对照细胞， 每孔 放入0.2mL病毒液， 在5C。

28、O2、 37培养120小时， 观察细胞病变(CPE)， 计算TCID50， 三种病 毒含量达到108.2TCID50/mL， 可用于制苗； 0068 S5.病毒灭活： 用0.1福尔马林灭活步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒液、 鸭坦布苏病 毒液及鸭腺病毒液， 即得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原和鸭腺病毒抗原； 0069 S6.疫苗制剂配置： 0070 S61.在搅拌釜中加入检测合格的三种抗原、 5g灭菌后的吐温-80， 搅拌速率100r/ min， 搅拌10min， 使得吐温-80完全溶解， 即形成预混液； 0071 S62.在步骤S61基础上， 向搅拌釜中加入浓度为70.8g白油、 6g硬脂酸。

29、铝、 7g司盘- 80、 9g酪蛋白、 1.2g头孢羟氨苄、 4g脂多糖、 2g卡波姆， 搅拌速率120r/min， 搅拌20min， 边搅 拌边升温， 直至硬脂酸铝充分溶解至透明为至， 高温灭菌备用； 0072 S63.乳化、 分装： 利用IKA乳化机进行乳化， 16000rpm， 乳化5分钟即形成疫苗， 将制 备的疫苗按照每瓶250mL进行分装； 0073 在本实施例中， 三种抗原与佐剂的质量比为1:1.5。 0074 实施例3 0075 S1.细胞载体的制备： 将LMH细胞用浓度为0.25的胰酶进行消化分散， 加入9新 生牛血清的DMEM/F12培养液在转瓶内37、 5CO2培养至细胞单。

30、层后， 弃去9新生牛血清 的DMEM/F12培养液， 接种细胞维持液， 用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次， 得细胞载体； 0076 细胞维持液包含无血清DMEM/F12培养液、 2mM/ML谷氨酰胺、 0.2mM/ML N-N-二乙 基-1-4-苯二胺； 0077 S2.病毒的接种： 将鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的病毒液分别按体积 为4:4:2接种至步骤S1得到的细胞载体中， 放置37条件下吸附40min后吸弃病毒液， 然后 加入含2新生牛血清的DMEM/F12培养液于37、 5CO2条件下培养48h， 当细胞病变达 80收获病变细胞； 0078 S3.病毒液收集： 将步。

31、骤S2得到的病变细胞在-25下条件下， 反复冻融3次后， 然 后在5、 5000rpm离心15min， 分别收集鸭呼肠孤病毒上清液、 鸭坦布苏病毒上清液和鸭腺 病毒上清液， 将离心后的上清液分别用于超滤浓缩， 将离心后的上清液分别用30K中空纤维 柱将其浓缩10倍后， 取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液作10倍递进稀释10-1、 10-2、 说明书 5/13 页 7 CN 111000992 A 7 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9及10-10。 0079 S4.病毒液病毒含量检测： 分别取(10-5、 10-6、 10-7、 10-8。

32、、 10-9)五个稀释度的三种病 毒液接种48孔铺满单层LMH细胞培养板， 每个稀释度重复5孔， 同时设立阴性对照细胞， 每孔 放入0.2mL病毒液， 在5CO2、 37培养120小时， 观察细胞病变(CPE)， 计算TCID50， 三种病 毒含量达到108.4TCID50/mL， 可用于制苗； 0080 S5.病毒灭活： 用0.1福尔马林灭活步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒液、 鸭坦布苏病 毒液及鸭腺病毒液， 即得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原和鸭腺病毒抗原； 0081 S6.疫苗制剂配置： 0082 S61.在搅拌釜中加入检测合格的三种抗原、 6g灭菌后的吐温-80， 搅拌速率100r/ 。

33、min， 搅拌10min， 使得吐温-80完全溶解， 即形成预混液； 0083 S62.在步骤S61基础上， 向搅拌釜中加入浓度为65.6g白油、 7g硬脂酸铝、 8g司盘- 80、 10g酪蛋白、 1.4g头孢羟氨苄、 5g脂多糖、 3g卡波姆， 搅拌速率120r/min， 搅拌20min， 边搅 拌边升温， 直至硬脂酸铝充分溶解至透明为至， 高温灭菌备用； 0084 S63.乳化、 分装： 利用IKA乳化机进行乳化， 16000rpm， 乳化5分钟即形成疫苗， 将制 备的疫苗按照每瓶250mL进行分装； 0085 在本实施例中， 三种抗原与佐剂的质量比为1:2。 0086 实施例4 008。

34、7 S1.细胞载体的制备： 将LMH细胞用浓度为0.25的胰酶进行消化分散， 加入10 新生牛血清的DMEM/F12培养液在转瓶内37、 5CO2培养至细胞单层后， 弃去10新生牛 血清的DMEM/F12培养液， 接种细胞维持液， 用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次， 得细胞 载体； 0088 细胞维持液包含无血清DMEM/F12培养液、 2mM/ML谷氨酰胺、 0.2mM/ML N-N-二乙 基-1-4-苯二胺； 0089 S2.病毒的接种： 将鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的病毒液分别按体积 为4:4:2接种至步骤S1得到的细胞载体中， 放置37条件下吸附45min后吸弃病。

35、毒液， 然后 加入含2.5新生牛血清的DMEM/F12培养液于37、 5CO2条件下培养48h， 当细胞病变达 80收获病变细胞； 0090 S3.病毒液收集： 将步骤S2得到的病变细胞在-25下条件下， 反复冻融3次后， 然 后在5、 5000rpm离心15min， 分别收集鸭呼肠孤病毒上清液、 鸭坦布苏病毒上清液和鸭腺 病毒上清液， 将离心后的上清液分别用于超滤浓缩， 将离心后的上清液分别用30K中空纤维 柱将其浓缩10倍后， 取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液作10倍递进稀释10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9。

36、及10-10。 0091 S4.病毒液病毒含量检测： 分别取(10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9)五个稀释度的三种病 毒液接种48孔铺满单层LMH细胞培养板， 每个稀释度重复5孔， 同时设立阴性对照细胞， 每孔 放入0.2mL病毒液， 在5CO2、 37培养120小时， 观察细胞病变(CPE)， 计算TCID50， 三种病 毒含量达到108.5TCID50/mL， 可用于制苗； 0092 S5.病毒灭活： 用0.1福尔马林灭活步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒液、 鸭坦布苏病 毒液及鸭腺病毒液， 即得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原和鸭腺病毒抗原； 0093 S6.疫苗制剂配。

37、置： 说明书 6/13 页 8 CN 111000992 A 8 0094 S61.在搅拌釜中加入检测合格的三种抗原、 7g灭菌后的吐温-80， 搅拌速率100r/ min， 搅拌10min， 使得吐温-80完全溶解， 即形成预混液； 0095 S62.在步骤S61基础上， 向搅拌釜中加入浓度为60.5g白油、 8g硬脂酸铝、 9g司盘- 80、 11g酪蛋白、 1.5g头孢羟氨苄、 6g脂多糖、 4g卡波姆， 搅拌速率120r/min， 搅拌20min， 边搅 拌边升温， 直至硬脂酸铝充分溶解至透明为至， 高温灭菌备用； 0096 S63.乳化、 分装： 利用IKA乳化机进行乳化， 1600。

38、0rpm， 乳化5分钟即形成疫苗， 将制 备的疫苗按照每瓶250mL进行分装； 0097 在本实施例中， 三种抗原与佐剂的质量比为1:2.5。 0098 实施例5 0099 S1.细胞载体的制备： 将LMH细胞用浓度为0.25的胰酶进行消化分散， 加入6新 生牛血清的DMEM/F12培养液在转瓶内37、 5CO2培养至细胞单层后， 弃去6新生牛血清 的DMEM/F12培养液， 接种细胞维持液， 用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次， 得细胞载体； 0100 细胞维持液包含无血清DMEM/F12培养液、 2mM/ML谷氨酰胺、 0.2mM/ML N-N-二乙 基-1-4-苯二胺； 0101。

39、 S2.病毒的接种： 将鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的病毒液分别按体积 为4:4:2接种至步骤S1得到的细胞载体中， 放置37条件下吸附40min后吸弃病毒液， 然后 加入含1.5新生牛血清的DMEM/F12培养液于37、 5CO2条件下培养48h， 当细胞病变达 80收获病变细胞； 0102 S3.病毒液收集： 将步骤S2得到的病变细胞在-25下条件下， 反复冻融3次后， 然 后在5、 5000rpm离心15min， 分别收集鸭呼肠孤病毒上清液、 鸭坦布苏病毒上清液和鸭腺 病毒上清液， 将离心后的上清液分别用于超滤浓缩， 将离心后的上清液分别用30K中空纤维 柱将其浓缩10倍后， 。

40、取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液作10倍递进稀释10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9及10-10。 0103 S4.病毒液病毒含量检测： 分别取(10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9)五个稀释度的三种病 毒液接种48孔铺满单层LMH细胞培养板， 每个稀释度重复5孔， 同时设立阴性对照细胞， 每孔 放入0.2mL病毒液， 在5CO2、 37培养120小时， 观察细胞病变(CPE)， 计算TCID50， 三种病 毒含量达到108.5TCID50/mL， 可用于制苗； 0104 S5.病毒灭活： 用0。

41、.1福尔马林灭活步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒液、 鸭坦布苏病 毒液及鸭腺病毒液， 即得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏病毒抗原和鸭腺病毒抗原； 0105 S6.疫苗制剂配置： 0106 S61.在搅拌釜中加入检测合格的三种抗原、 5g灭菌后的吐温-80， 搅拌速率100r/ min， 搅拌10min， 使得吐温-80完全溶解， 即形成预混液； 0107 S62.在步骤S61基础上， 向搅拌釜中加入浓度为76.7g白油、 3g硬脂酸铝、 5g司盘- 80、 9g酪蛋白、 1.3g头孢羟氨苄、 3g脂多糖、 2g卡波姆， 搅拌速率120r/min， 搅拌20min， 边搅 拌边升温， 直至硬脂酸铝充分溶。

42、解至透明为至， 高温灭菌备用； 0108 S63.乳化、 分装： 利用IKA乳化机进行乳化， 16000rpm， 乳化5分钟即形成疫苗， 将制 备的疫苗按照每瓶250mL进行分装； 0109 在本实施例中， 三种抗原与佐剂的质量比为1:2.2。 0110 对比例1 说明书 7/13 页 9 CN 111000992 A 9 0111 对比例1与实施例5的区别在于步骤S62中不添加酪蛋白。 0112 对比例2 0113 对比例2与实施例5的区别在于步骤S1中的细胞维持液不添加N-N-二乙基-1-4-苯 二胺。 0114 对比例3 0115 对比例3与实施例5的区别在于鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭坦布苏。

43、病毒抗原及鸭腺病毒 抗原体积比1:1:1。 0116 实验1： 所制备的鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的灭活检 验。 0117 取实施例1-5制备的三联灭活疫苗， 分别用DMEM/F12营养液以以10-1、 10-2、 10-3三 个比例稀释待检样品， 同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照， 分别接种 于48孔LMH细胞单层细胞， 每组重复接种5孔， 每孔0.4mL， 37、 5CO2培养96小时， 结果显 示， 灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变， 阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均 明显， 达80以上， 实施例1-5灭活检验合格。 0118 实验2： 所。

44、制备的鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的安全性 试验。 0119 选用7日龄健康易感鸭将其分为6组， 每组10只， 分别每只肌肉或颈部皮下注射实 施例1-5疫苗1mL， 剩余一组作为空白对照组， 观察14日， 结果试验鸭均健活， 无任何局部和 全身不良反应； 在第15天进行解剖观察， 内脏组织无明显的病变。 表明本发明实施例1-5制 备的鸭呼肠孤病毒疫苗安全。 0120 实验3： 所制备的鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的效力试 验。 0121 取7日龄健康易感鸭90只， 每组10只， 将实施例1-5、 对比例1-3所制备的鸭呼肠孤 病毒疫苗分别以0.3mL。

45、/只胸肌注射， 剩余一组作为空白对照组， 免疫后14、 28、 42和56天， 分 别采血， 测定三种抗原的血清中和抗体效价， 其结果如表1及表3。 0122 表1鸭呼肠孤病毒中和抗体测定结果 说明书 8/13 页 10 CN 111000992 A 10 0123 0124 表2鸭坦布苏病毒中和抗体测定结果 说明书 9/13 页 11 CN 111000992 A 11 0125 0126 表3鸭腺病毒中和抗体测定结果 0127 说明书 10/13 页 12 CN 111000992 A 12 0128 0129 根据表1至表3的数据可知， 实施例1-5制备的鸭呼肠孤病毒、 黄病毒和腺病毒三。

46、联 灭活疫苗均能产生高水平血清中和抗体， 且以实施例5制备的鸭呼肠孤病毒、 黄病毒和腺病 毒三联灭活疫苗所产生的血清中和抗体最高。 0130 实施例5与对比例1相比， 佐剂中存在酪蛋白， 可使得鸭呼肠孤病毒抗原、 鸭腺病毒 抗原与鸭坦布苏病毒抗原三种抗原不会相互干扰， 使得鸭腺病毒抗原与鸭坦布苏病毒抗原 结合， 促进了鸭呼肠孤病毒抗原在鸭体内的免疫效果， 使得鸭体具有较佳的免疫应答， 进而 增加了鸭体的免疫功能。 0131 实验4： 所制备的鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗的免疫保 护试验。 0132 取鸭子180只， 分为9组， 每组20只， 将实施例1-5、 对比例1-3。

47、所制备得到的鸭呼肠 孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗分别注射每组鸭子， 注射相同体积的三联 灭活疫苗， 剩余一组作为空白对照组注射同体积生理盐水。 各组同步进行强毒攻击， 分别用 鸭呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒进行攻毒， 攻毒剂量各为1.0107TCID50/只， 连 续观察14天， 统计各组鸭呼肠孤病毒、 黄病毒和腺病毒三联灭活疫苗的保护率， 具体见表4、 表5和表6： 0133 表4鸭呼肠孤病毒攻毒保护结果 0134 0135 说明书 11/13 页 13 CN 111000992 A 13 0136 表5鸭坦布苏病毒攻毒保护结果 0137 0138 表6鸭腺病毒攻毒保护结果 说明书 12/13 页 14 CN 111000992 A 14 0139 0140 根据表4至表6的数据可知， 实施例1-5制备的鸭呼肠孤病毒、 黄病毒和腺病毒三联 灭活疫苗免疫保护效果较好， 实施例5组鸭100保护， 观察未见任何异常现象， 剖检未见相 关组织病变。 0141 本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例， 并非依此限制本发明的保护 范围， 故： 凡依本发明的结构、 形状、 原理所做的等效变化， 均应涵盖于本发明的保护范围之 内。 说明书 13/13 页 15 CN 111000992 A 15 。