磁性固定化脂肪酶及其在拆分1-甲基-3-苯丙胺中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911408573.7 (22)申请日 2019.12.31 (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人 欧志敏代洪倩柳博卢媛 唐岚杜理华 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟李世玉 (51)Int.Cl. C12N 9/20(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C12P 41/00(2006.01) C12P 13/00(2006.01) (54)发明名。

2、称 一种磁性固定化脂肪酶及其在拆分1-甲基- 3-苯丙胺中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种磁性固定化脂肪酶及在 拆分1-甲基-3-苯丙胺制备(R)-(+)-N-乙酰基- 1-甲基-3-苯丙胺中的应用， 本发明采用二硫化 碳代替戊二醛， 在磁性颗粒表面引入了二硫代氨 基甲酸酯与脂肪酶进行共价结合， 本发明制备磁 性固定化脂肪酶的方法简单安全， 明显优于戊二 醛交联的酶固定化方法。 同时， 本发明将磁性固 定化脂肪酶应用于交变磁场中催化不对称酰化 反应实现连续化制备(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲 基-3-苯丙胺。 本发明方法简单、 安全有效、 易于 分离； 拆分1-甲基-3-苯丙胺获得R。

3、-构型产物的 对映体过剩值达到了98.5， 拆分效果优越。 权利要求书2页 说明书11页 附图1页 CN 111041014 A 2020.04.21 CN 111041014 A 1.一种磁性固定化脂肪酶， 其特征在于所述磁性固定化脂肪酶是以3-氨基丙基三乙氧 基硅烷和CS2改性的Fe3O4磁性纳米颗粒为载体， 加入待固定脂肪酶， 在pH7.0、 0.1mol/L的 磷酸缓冲液中， 35超声摇床固定制备而成。 2.如权利要求1所述磁性固定化脂肪酶， 其特征在于所述载体按如下方法制备： (1) APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒： 取干燥的Fe3O4磁性纳米颗粒， 分散在甲苯中并在超声波频率为。

4、 40KHz下超声分散， 然后向混合物中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷， 然后放到30振荡器中 振荡过夜， 通过外部磁场收集沉淀， 并用乙醇和去离子水冲洗以除去过量有机硅烷试剂， 水 洗8次之后， 将黑色沉淀物转移到防爆黑盖小瓶中， 然后放入-80冷冻7h， 再-65冷冻干 燥12h， 最终获得APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒； 所述甲苯体积用量以Fe3O4磁性纳米颗粒重量 计为100mL/g； 所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷体积用量以Fe3O4磁性纳米颗粒重量计为2mL/ g； (2)磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4-CS2： 称取APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒， 分散在CH3OH中， 。

5、在 频率为40KHz下超声处理10min， 然后加入CS2并在室温搅拌12h， 通过外部磁场收集沉淀， 然 后用乙醇和去离子水洗涤数次后转移到防爆黑盖小瓶中， 然后在-80冰箱冷冻7h， 最后- 65冷冻干燥12h， 获最终产物磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4-CS2； 所述CH3OH体积用量以 APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒重量计为100mL/g； 所述CS2体积用量以APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒 重量计为11mL/g。 3.如权利要求2所述磁性固定化脂肪酶， 其特征在于Fe3O4磁性纳米颗粒按如下方法制 备： 将FeSO47H2O和FeCl36H2O分别溶解于蒸馏水中， 混合后。

6、加入去离子水a， 在1000r/ min、 40条件下高速搅拌， 同时缓慢加入质量浓度25-28氨水， 当溶液变得黑亮且上清液 的pH10.0时， 调节温度为60， 继续搅拌30min， 然后再调节温度为70， 搅拌1h， 反应结 束后， 用无水乙醇和去离子水反复清洗10次至上清液为中性， 磁铁回收， 沉淀在超低温-80 冰箱冷冻7h， 然后-65冷冻干燥12h， 获得Fe3O4磁性纳米颗粒； 所述FeCl36H2O与 FeSO47H2O质量比为1:0.56； 所述蒸馏水体积用量以FeCl36H2O重量计为4mL/g； 所述去 离子水a体积用量以FeCl36H2O重量计为15mL/g； 所述氨。

7、水体积用量以FeCl36H2O重量计 为4mL/g。 4.如权利要求1所述磁性固定化脂肪酶， 其特征在于所述磁性固定化脂肪酶按如下方 法制备： 称取脂肪酶， 分散在pH7.0、 0.1mol/L的磷酸缓冲液中， 频率为40KHz下超声10min， 加 入APTES-Fe3O4-CS2磁性纳米颗粒， 放入35摇床固定4h， 经外加磁铁分离， 沉淀水洗， 得到 磁性固定化脂肪酶； 所述缓冲液体积用量以脂肪酶重量计为400mL/g； 所述APTES-Fe3O4-CS2 磁性纳米颗粒与脂肪酶重量比为1.5:1。 5.一种权利要求1所述磁性固定化脂肪酶在拆分1-甲基-3-苯丙胺制备(R)-(+)-N-乙。

8、 酰基-1-甲基-3-苯丙胺中的应用。 6.如权利要求5所述的应用， 其特征在于所述应用的方法为： 以甲苯为有机溶剂， 加入 酰化试剂、 底物1-甲基-3-苯丙胺和磁性固定化脂肪酶， 在25-50、 50-250rpm条件下拆分 反应1-6d， 反应结束后， 反应液分离纯化， 获得(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺； 所述 酰化试剂为乙酸乙酯、 乙酸乙烯酯、 乙酰乙酸乙酯、 碳酸二乙酯或邻苯二甲酸乙酯中的一 权利要求书 1/2 页 2 CN 111041014 A 2 种。 7.如权利要求6所述的应用， 其特征在于所述反应条件为40、 150rpm、 反应5d。 8.如权利要求6。

9、所述的应用， 其特征在于所述甲苯体积用量以磁性固定化脂肪酶重量 计为10-20mL/g； 所述酰化试剂体积用量以磁性固定化脂肪酶重量计为1-3mL/g； 所述底物 体积用量以磁性固定化脂肪酶重量计为0.2-2.0mL/g。 9.如权利要求6所述的应用， 其特征在于所述转化反应在交变磁场中进行， 反应条件为 在25-50、 磁场频率为500Hz、 磁场强度4-20Gs条件下拆分反应1-6h。 10.如权利要求6所述的应用， 其特征在于所述转化反应在连续流交变磁场中进行， 底 物流速25-500 L/min， 反应条件为在25-50、 磁场频率为500Hz、 磁场强度4-20Gs条件下拆 分反应1。

10、-6h。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111041014 A 3 一种磁性固定化脂肪酶及其在拆分1-甲基-3-苯丙胺中的 应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及一种(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的制备方法。 特别涉及一种 磁性固定化酶在非水相中拆分外消旋1-甲基-3-苯丙胺制备(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3- 苯丙胺的方法。 (二)背景技术 0002 (R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺(N-(2R)-4-phenylbutan-2-yl acetamide)， CAS22148-79-4， 分子式C12H16NO， 分子量191.27， 熔点。

11、55， 沸点360.521。 它是合成抗高血压药物拉贝洛尔的关键手性中间体。 拉贝洛尔别名柳胺苄心定， 是一种治 疗原发性高血压和继发性高血压， 妊娠期高血压和其他类型的高血压紧急理想的抗高血压 药物。 采用脂肪酶拆分1-甲基-3-苯丙胺可以制备拉贝洛尔关键手性中间体(R)-(+)-N-乙 酰基-1-甲基-3-苯丙胺。 0003 (R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺可以通过重结晶法、 催化氢化法、 化学拆分 法、 化学不对称合成法制备， 但是化学法制备需要昂贵的催化剂， 反应操作复杂， 反应条件 苛刻， 产物收率和产物对映过量体ee值不高， 容易造成环境的严重污染。 0004 随着。

12、生活水平提高和生活节奏的加快， 高血压患病人数直线上升， 呈现年轻化和 普遍化的趋势。 拉贝洛尔是治疗各类高血压紧急降压的理想药物， 光学纯(R)-(+)-N-乙酰 基-1-甲基-3-苯丙胺是合成拉贝洛尔的关键中间体， 脂肪酶拆分法制备(R)-(+)-N-乙酰 基-1-甲基-3-苯丙胺对于合成拉贝洛尔具有重要的意义。 在非水相中应用磁性固定化脂肪 酶拆分l-甲基-3-苯丙胺制备光学纯(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的研究工作未见 报道。 酶法拆分手性化合物具有重要的应用前景， 但在生物转化过程中经常会碰到底物水 溶性差的问题致使转化效率降低， 限制了酶的应用。 自然界中， 酶的。

13、天然反应介质为水， 随 着酶学研究的发展， 人们发现只要条件合适， 酶在有机溶剂中也能起到催化作用。 与传统的 水相酶催化反应相比， 有机相酶催化反应有很多优点， 可以增加非极性底物的溶解度， 有利 于高浓度底物实现连续生物转化； 可进行酶水解的逆反应； 减少底物或产物对酶的抑制； 可 以抑制由水引起的副反应， 如水解反应等； 有利于酶和产物的分离及酶的重复利用； 酶的热 稳定性大大提高； 反应器不容易被微生物污染； 根据需要可采用不同种类的有机介质， 酶可 以直接应用于催化化学反应。 0005 磁性固定化脂肪酶稳定性好、 与样品分离容易、 酶容易回收。 磁性固定化脂肪酶是 脂肪酶与磁性载体颗。

14、粒通过氢键、 范德华力、 疏水作用力、 物理吸附、 包埋、 共价结合等方式 结合在一起。 磁性载体具有颗粒小、 表面积大、 矫顽力高、 吸附能力强、 超顺磁性、 低毒性和 易于在外加磁场条件下分离和回收。 0006 本发明采用脂肪酶催化拆分法制备(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺， 通过脂 肪酶催化拆分1-甲基-3-苯丙胺， 以乙酸乙酯为酰化试剂， (R)-1-甲基-3-苯丙胺与乙酸乙 酯反应生成(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺， (S)-1-甲基-3-苯丙胺不参与酰化反应 说明书 1/11 页 4 CN 111041014 A 4 从而实现外消旋体1-甲基-3-。

15、苯丙胺的拆分获得(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺。 酶 拆分法制备手性药物中间体具有催化效率高、 立体选择性强、 反应条件温和、 环境友好等特 点， 符合绿色合成的大趋势。 因此， 使用生物催化法拆分制备手性胺类化合物比传统化学催 化方法更具有吸引力和竞争力。 0007 本发明采用磁性纳米颗粒四氧化三铁固定脂肪酶制备磁性固定化酶颗粒， 四氧化 三铁固定化脂肪酶具有超顺磁性和低毒性， 在外加磁场的条件下容易实现固定化酶的高效 分离。 采用磁性固定化酶将有助于提高酶的稳定性， 可以通过外加磁场将脂肪酶从胶体物 质或者不溶物的反应液中分离出来并实现重复利用。 因此， 磁性固定化酶与游。

16、离酶相比， 在 保持其酶催化高效专一及反应条件温和的特性的同时， 克服了游离酶必须离心操作、 样品 不得不稀释及载体回收损失大等问题。 除此之外还具有酶与载体结合牢固、 不会因底物浓 度高或因有盐离子存在而轻易脱落以及操作连续可控、 工艺简单等优点。 在交变磁场作用 下， 磁性固定化脂肪酶可以实现充分的传质， 磁场对磁性固定化颗粒的作用代替了传统的 生物反应器的搅拌作用， 使磁性固定化酶与底物充分接触， 减少传质阻力， 提高酶促反应速 率。 合适强度的磁场有利于提高固定化酶的催化活力， 进一步提高催化反应效率。 (三)发明内容 0008 本发明目的是提供一种新型的磁性固定化脂肪酶， 采用所述磁。

17、性固定化脂肪酶在 有机相中拆分外消旋体1-甲基-3-苯丙胺制备(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺， 为抗 高血压药物拉贝洛尔的关键手性中间体(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的高效合成 提供了新方法， 有利于酶和产物的分离及酶的重复利用， 增加脂肪酶的稳定性。 0009 本发明采用的技术方案是： 0010 本发明提供一种新型的磁性固定化脂肪酶， 所述磁性固定化脂肪酶是以3-氨基丙 基三乙氧基硅烷(APTES)和CS2改性的Fe3O4磁性纳米颗粒为载体， 加入待固定脂肪酶， 在pH 7.0、 0.1mol/L的磷酸缓冲液中， 35超声摇床固定制备而成。 0011 进一。

18、步， 所述脂肪酶包括各种来源的脂肪酶， 优选购自旺鑫生物科技有限公司。 0012 进一步， 所述载体按如下方法制备： (1)APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒： 取干燥的Fe3O4 磁性纳米颗粒， 分散在甲苯中并在超声波频率为40KHz下超声分散， 然后向混合物中加入3- 氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)， 然后放到30振荡器中振荡过夜， 通过外部磁场收集沉 淀， 并用乙醇和去离子水冲洗以除去过量有机硅烷试剂， 水洗8次之后， 将黑色沉淀物转移 到防爆黑盖小瓶中， 然后放入-80冷冻7h， 再-65冷冻干燥12h， 最终获得APTES-Fe3O4磁 性纳米颗粒； 所述甲苯体积用量以Fe3O4。

19、磁性纳米颗粒重量计为100mL/g； 所述3-氨基丙基三 乙氧基硅烷体积用量以Fe3O4磁性纳米颗粒重量计为2mL/g； 0013 (2)磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4-CS2： 称取APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒， 分散在CH3OH 中， 在频率为40KHz下超声处理10min， 然后加入CS2并在室温(28)搅拌12h， 通过外部磁场 收集沉淀， 然后用乙醇和去离子水洗涤数次后转移到防爆黑盖小瓶中， 然后在-80冰箱冷 冻7h， 最后-65冷冻干燥12h， 获最终产物磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4-CS2； 所述CH3OH体积 用量以APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒重量计为1。

20、00mL/g； 所述CS2体积用量以APTES-Fe3O4磁性纳 米颗粒重量计为11mL/g。 0014 进一步， 所述Fe3O4磁性纳米颗粒按如下方法制备： 将FeSO47H2O和FeCl36H2O分 说明书 2/11 页 5 CN 111041014 A 5 别溶解于蒸馏水中， 混合放入三口烧瓶中， 加入去离子水a， 在1000r/min、 40条件下高速 搅拌， 同时缓慢加入质量浓度25-28氨水(NH3H2O溶液)， 当溶液变得黑亮且上清液的pH 10.0时， 调节温度为60， 继续搅拌30min， 然后再调节温度为70， 搅拌1h， 反应结束后， 用无水乙醇和去离子水反复清洗10次至。

21、上清液为中性(即pH为7.0)， 磁铁回收， 沉淀在超低 温-80冰箱冷冻7h， 然后-65冷冻干燥12h， 获得Fe3O4磁性纳米颗粒； 所述FeCl36H2O与 FeSO47H2O质量比为1:0.56； 所述蒸馏水体积用量以FeCl36H2O重量计为4mL/g； 所述去 离子水a体积用量以FeCl36H2O重量计为15mL/g； 所述氨水体积用量以FeCl36H2O重量计 为4mL/g。 0015 进一步， 所述磁性固定化脂肪酶按如下方法制备： 称取脂肪酶， 放在锥形瓶中分散 在pH7.0、 0.1mol/L的磷酸缓冲液中， 频率为40KHz下超声10min， 加入APTES-Fe3O4-。

22、CS2磁 性纳米颗粒， 放入35摇床固定4h， 经外加磁铁分离， 沉淀水洗， 得到磁性固定化脂肪酶； 所 述缓冲液体积用量以脂肪酶重量计为400mL/g； 所述APTES-Fe3O4-CS2磁性纳米颗粒与脂肪 酶重量比为1.5:1。 0016 本发明还提供一种所述磁性固定化脂肪酶在拆分1-甲基-3-苯丙胺制备(R)-(+)- N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺中的应用， 所述应用的方法为： 以甲苯为有机溶剂， 加入酰化试 剂、 底物1-甲基-3-苯丙胺和磁性固定化脂肪酶， 在25-50、 50-250rpm条件下拆分反应1- 6d(优选40、 150rpm、 反应5d)， 反应结束后， 反应液分。

23、离纯化， 获得(R)-(+)-N-乙酰基-1- 甲基-3-苯丙胺； 所述酰化试剂为乙酸乙酯、 乙酸乙烯酯、 乙酰乙酸乙酯、 碳酸二乙酯或邻苯 二甲酸乙酯中的一种， 优选乙酸乙酯。 0017 进一步， 所述甲苯体积用量以磁性固定化脂肪酶重量计为10-20mL/g(优选18mL/ g)； 所述酰化试剂体积用量以磁性固定化脂肪酶重量计为1-3mL/g(优选2mL/g)； 所述底物 体积用量以磁性固定化脂肪酶重量计为0.2-2.0mL/g(优选0.6mL/g)。 0018 进一步， 所述转化反应在交变磁场中进行， 反应条件为在25-50、 磁场频率为 500Hz、 磁场强度4-20Gs条件下拆分反应1。

24、-6h(优选40、 500Hz、 12Gs、 反应4h)。 0019 进一步， 所述转化反应在连续流交变磁场中进行， 底物流速25-500 L/min(优选25 L/min)， 反应条件为在25-50、 磁场频率为500Hz、 磁场强度4-20Gs条件下拆分反应1-6h (优选40、 500Hz、 12Gs、 反应4h)。 所述连续流反应器包括交流电源1、 反应罐2、 亥姆霍兹线 圈3、 恒流泵4、 底物罐5和产物罐6， 将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3形成 的交变磁场中； 所述反应罐2通过恒流泵4与底物罐5连通， 所述底物罐5通过恒流泵4与产物 罐6连通， 所述产物罐与反应罐连。

25、通。 0020 本发明采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)改性磁性Fe3O4纳米颗粒使颗粒表面 产生胺官能团， 然后采用CS2对磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4进行修饰， 将磁性颗粒表面胺官能 团转化为二硫代氨基甲酸酯， 脂肪酶通过共价键和的方式与具有该纳米颗粒进行固定结 合。 将得到的磁性固定化脂肪酶在有机相中选择性酰化(R)-1-甲基-3-苯丙胺得到高光学 纯度的(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺。 光学纯(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺 是合成拉贝洛尔的关键手性中间体， 具有重要应用价值。 通过固定化脂肪酶进一步提高酶 催化反应的立体选择性和拆分效率。

26、， 在磁场作用下实现连续化生产。 首先， 在有机相中筛选 出转化率高、 拆分能力强的游离脂肪酶。 采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和CS2改性 的四氧化三铁固定化此游离脂肪酶获得磁性固定化脂肪酶， 优化了酶的固定化条件。 优化 说明书 3/11 页 6 CN 111041014 A 6 了磁性固定化脂肪酶催化酰化反应的条件。 在最优的拆分条件下， 建立脂肪酶在有机相中 拆分外消旋体1-甲基-3-苯丙胺的工艺条件。 0021 与现有技术相比， 本发明有益效果主要体现在： 0022 通常共价键合的脂肪酶固定化方法常采用戊二醛做为双功能试剂， 戊二醛是一种 有毒化合物， 在空气和水中不稳定。

27、， 本发明采用二硫化碳代替戊二醛， 在磁性颗粒表面引入 了二硫代氨基甲酸酯与脂肪酶进行共价结合， 本发明制备磁性固定化脂肪酶的方法简单安 全， 明显优于戊二醛交联的酶固定化方法。 0023 同时， 本发明将磁性固定化脂肪酶应用于交变磁场中催化不对称酰化反应实现连 续化制备(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺。 本发明方法简单、 安全有效、 易于分离； 拆 分1-甲基-3-苯丙胺获得R-构型产物的对映体过剩值达到了98.5， 拆分效果优越。 (四)附图说明 0024 图1为本发明脂肪酶选择性酰化(R)-1-甲基-3-苯丙胺生成(R)-(+)-N-乙酰基-1- 甲基-3-苯丙胺反应机理。

28、示意图。 0025 图2为磁性固定化脂肪酶在交变磁场中催化反应的示意图； 1.交流电源， 2.反应 罐， 3.亥姆霍兹线圈。 0026 图3为连续流反应示意图， 1.交流电源， 2.反应器， 3.亥姆霍兹线圈， 4.恒流泵， 5. 底物罐， 6.产物罐。 (五)具体实施方式 0027 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此： 0028 实施例1： 游离脂肪酶的筛选 0029 分别取来自不同厂家的12种脂肪酶(为了便于区分不同厂家而进行了编号)各 100mg于相同规格的10mL反应瓶中， 分别加入溶剂无水甲苯1800 L、 酰化试剂乙酸乙酯200 L、 底物。

29、1-甲基-3-苯丙胺60 L， 于40、 150rpm摇床中反应5d， 反应结束后使酶与反应液离 心分离， 采用旋转蒸发仪去除有机溶剂后获得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇溶解， 用孔径 0.45 m的有机滤头过滤， 采用HPLC分析样品中(S)-1-甲基-3-苯丙胺和(R)-(+)-N-乙酰基- 1-甲基-3-苯丙胺的含量， 确定底物转化率和(R)-(+)-N-乙酰-1-甲基-3-苯丙胺的对映体 过剩值。 结果见表1所示， 结果显示脂肪酶LIP10的对映体选择性最好， 底物的转化率最高， 因此选用购自旺鑫生物科技有限公司的脂肪酶(记为LIP10)来进行后续研究。 0030 表1游离脂肪酶种类。

30、对酰化反应的影响 说明书 4/11 页 7 CN 111041014 A 7 0031 0032 实施例2： 磁性固定化脂肪酶的制备 0033 (1)Fe3O4磁性纳米颗粒： 将5.6g FeSO47H2O和10g FeCl36H2O分别溶解于40mL 蒸馏水中， 混合放入250mL三口烧瓶中， 加入150mL去离子水， 在1000r/min、 40条件下高速 搅拌， 同时缓慢加入40mL质量浓度25-28的氨水(NH3H2O溶液)， 当溶液变得黑亮且上清 液的pH10.0时， 调节温度为60， 继续搅拌30min， 然后再调节温度为70， 搅拌1h， 反应 结束后， 用无水乙醇和去离子水反复。

31、清洗10次至上清液为中性(即pH为7.0)， 磁铁回收， 在 超低温-80冰箱冷冻7h， 然后-60冷冻干燥12h， 获得Fe3O4磁性纳米颗粒2.8g， 粒径12- 30nm。 0034 (2)APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒： 称取干燥的Fe3O4磁性纳米颗粒0.5g， 分散在50mL 甲苯中并在超声波40KHz下超声分散， 然后向混合物中加入1mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)， 然后放到30振荡器中振荡过夜， 通过外部磁场收集沉淀， 并用乙醇和去离子水 冲洗以除去过量有机硅烷试剂。 水洗8次之后， 将黑色沉淀物转移到防爆黑盖小瓶中， 然后 放入-80冷冻7h， 再-60冷。

32、冻干燥12h， 最终获得APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒0.41g， 粒径 15-50nm。 0035 (3)磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4-CS2： 称取APTES-Fe3O4磁性纳米颗粒0.2g， 分散在 20mL的CH3OH中， 在40KHz下超声处理10min， 然后加入CS2 2.2mL并在室温(28)搅拌12h， 通 过外部磁场收集沉淀， 然后用乙醇和去离子水洗涤数次后转移到防爆黑盖小瓶中， 然后在- 80冰箱冷冻7h， 最后-60冷冻干燥12h， 获最终产物磁性纳米颗粒APTES-Fe3O4-CS2 0.15g， 粒径20-80nm。 0036 (4)磁性固定化脂肪酶： 称。

33、取LIP10脂肪酶100mg， 放在锥形瓶中分散在40mL的pH 7.0、 浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液中， 40KHz下超声10min， 加入APTES-Fe3O4-CS2磁性纳米 颗粒150mg， 放入35摇床固定4h， 经外加磁铁分离， 沉淀水洗8次， 得到磁性固定化脂肪酶 0.2g。 采用Bradford方法， 以牛血清白蛋白做为标准蛋白质， 测定磁性固定化脂肪酶蛋白含 量， 固定化之前游离脂肪酶浓度为2.5mg/mL， 固定化之后通过酶标仪对上清液进行测定得 到酶蛋白浓度为0.85mg/mL， 证明大部分的脂肪酶成功固定在磁性纳米颗粒载体上。 0037 实施例3： 反应时间对1。

34、-甲基-3-苯丙胺选择性酰化的影响 0038 在6个10ml反应瓶中， 分别加入溶剂无水甲苯1800 L、 酰化试剂乙酸乙酯200 L、 底 物1-甲基-3-苯丙胺60 L、 实施例2方法制备的磁性固定化脂肪酶100mg， 于40、 150rpm摇 说明书 5/11 页 8 CN 111041014 A 8 床中， 分别反应1d、 2d、 3d、 4d、 5d、 6d。 反应结束后使用外加磁场回收沉淀， 使酶与反应液分 离， 采用旋转蒸发仪去除有机溶剂后获得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇， 用孔径0.45 m的 有机滤头过滤， 采用HPLC分析样品中(S)-1-甲基-3-苯丙胺和(R)-(+。

35、)-N-乙酰基-1-甲基- 3-苯丙胺的含量， 确定底物转化率和(R)-(+)-N-乙酰-1-甲基-3-苯丙胺的对映体过剩值， 结果见表2。 0039高效液相色谱仪为岛津LC-10A， 色谱柱为Amy-D(4.6250mm， 5 m)， 底 物的HPLC的检测条件： 流动相为正己烷/异丙醇/三氟乙酸/二乙胺96/4/0.1/0.1； 检测波 长： 215nm； 柱温： 25； 流速： 1.0mL/min； 进样量： 5 L； 供试品溶液： 取供试品适量， 用流动相 溶解稀释制成3mg/mL的溶液。 0040 产物的HPLC的检测条件： 流动相： 正己烷/异丙醇100/5； 检测波长： 215n。

36、m； 柱温： 25； 流速： 1.0mL/min； 进样量： 10 L； 供试品溶液： 取供试品适量， 加入2mL流动相溶解稀 释。 0041 转化产物的ee值通过样品HPLC图谱上两个异构体的峰面积来计算， 计算公式为： eeR(CR-Cs)/(CR+Cs)100， eeS(Cs-CR)/(CR+Cs)100 0042 其中， eeR为R-构型产物的对映体过剩值， eeS为S-构型产物的对映体过剩值。 CR为 R-构型产物的浓度， CS为S-构型产物的浓度。 0043 转化率(X)计算公式为： 0044 转化率(X)(初始底物浓度-底物剩余浓度)/初始底物浓度100 0045 表2反应时间对。

37、酰化反应的影响 0046 0047 0048 在有机相中， 酰化反应时间影响着底物的转化率和产物的对映体过剩值。 表2表明 随着反应时间的增加， 底物的转化率逐渐提高最后趋于稳定， 可能是由于产物会在一定程 度上对酰化反应的转化存在抑制作用。 (R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺对映体过剩值 随着反应时间的延长逐渐增加最后趋于稳定， 因此根据表中的数据得到最优的酰化时间为 5d， 转化率和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺对映体过剩值分别为36.8和98.5。 0049 实施例4： 反应温度对1-甲基-3-苯丙胺选择性酰化的影响 0050 在6个10ml反应瓶中， 分。

38、别加入溶剂无水甲苯1800 L、 酰化试剂乙酸乙酯200 L、 底 物1-甲基-3-苯丙胺60 L、 实施例2方法制备的磁性固定化脂肪酶100mg， 分别在转速为 150rpm， 温度为25、 30、 35、 40、 45和50条件下反应5d， 反应结束后采用外加磁 场回收磁性固定化酶， 使酶与反应液分离， 采用旋转蒸发仪去除有机溶剂后获得透明的晶 状物， 加入2mL异丙醇， 用孔径0.45 m的有机滤头过滤， 采用实施例3所述HPLC分析样品中 (S)-1-甲基-3-苯丙胺和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的含量， 确定转化率和(R)- (+)-N-乙酰-1-甲基-3-苯丙胺。

39、的对映体过剩值， 结果见表3所示。 0051 表3反应温度对酰化反应的影响 说明书 6/11 页 9 CN 111041014 A 9 0052 0053 表3表明， 随着温度的升高底物的转化率和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺 对映体过剩值呈现出上升的趋势， 而当温度达到40时， 底物转化率达到了最高值， 之后随 着温度的上升转化率逐渐下降， 这是因为温度对酶的活性有着双重的影响， 一方面， 在一定 范围内提高温度可以提高反应速度从而提高单位时间内的底物转化率， 但另一方面， 由于 酶的本质是一种蛋白质， 随着温度的进一步升高， 酶会逐渐地变性失活， 酶活性因此丧失或 被抑制。

40、会降低反应速率而导致单位时间内的底物的转化率下降， 因此最佳反应温度为40 。 0054 实施例5： 酰化试剂对1-甲基-3-苯丙胺的选择性酰化的影响 0055 在5个10ml反应瓶中， 分别加入溶剂无水甲苯1800 L、 底物1-甲基-3-苯丙胺60 L、 实施例2方法制备的磁性固定化脂肪酶100mg， 分别加入酰化试剂乙酸乙烯酯、 乙酸乙酯、 邻 苯二甲酸乙酯、 碳酸二乙酯、 乙酰乙酸乙酯各200 L， 分别在温度为40、 转速为150rpm条件 下反应5d， 反应结束后使用外加磁场回收磁性固定化酶， 使酶与反应液分离， 采用旋转蒸发 仪去除有机溶剂后获得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇，。

41、 用孔径0.45 m的有机滤头过滤， 采 用实施例3所述HPLC分析样品中(S)-1-甲基-3-苯丙胺和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯 丙胺的含量， 确定转化率和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的对映体过剩值， 结果见 表4所示。 0056 表4酰化剂种类对酰化反应的影响 0057 0058 表4表明， 以乙酸乙酯和乙酸乙烯酯为酰化剂获得的转化率明显比乙酰乙酸乙酯 和碳酸二乙酯、 邻苯二甲酸乙酯为酰化试剂获得的转化率高很多。 以乙酸乙烯酯为酰化试 剂获得的转化率是最高的， 可能是由于酰基侧链取代基的空间位阻性较低， 乙酸乙烯酯的 酰化活性远高于其他试剂， 但是反应。

42、速率太快导致拆分效果不理想。 以乙酰乙酸乙酯、 碳酸 二乙酯和邻苯二甲酸乙酯作为酰化剂时产生的副产物对酰化反应有抑制作用导致转化率 低。 表4数据表明最佳的酰化试剂是乙酸乙酯。 以乙酸乙酯作为酰化试剂时转化率达到 36.8， (R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺对映体过剩值达到98.5。 0059 实施例6： 底物量对1-甲基-3-苯丙胺的选择性酰化的影响 0060 在5个10ml反应瓶中， 分别加入溶剂无水甲苯1800 L、 酰化试剂乙酸乙酯加入200 L、 实施例2方法制备的磁性固定化脂肪酶100mg、 底物1-甲基-3-苯丙胺分别加入50 L、 60 L、 70 L、 80 。

43、L、 90 L， 分别在温度为40、 摇床转速为150rpm条件下酰化反应5d， 反应结束后 说明书 7/11 页 10 CN 111041014 A 10 使用外加磁场回收磁性固定化酶， 使酶与反应液分离， 采用旋转蒸发仪去除有机溶剂后获 得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇， 用孔径0.45 m的有机滤头过滤， 采用实施例3所述HPLC分 析样品中(S)-1-甲基-3-苯丙胺和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的含量， 确定转化 率和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的对映体过剩值， 结果见表5所示。 0061 表5不同底物量对酰化反应的影响 0062 0063 。

44、表5表明， 随着底物量的增加转化率逐渐下降， 产物的对映体过剩值基本保持不 变， 这是由于底物浓度高会抑制脂肪酶的活性， 使底物转化率降低， 在底物浓度较低时脂肪 酶的活性位点不完全饱和， 之后酶的活性位点会随着底物浓度的增加逐渐趋于饱和， (R)- 1-甲基-3-苯丙胺转化率会降低。 最佳底物量为60 L， (R)-1-甲基-3-苯丙胺转化率为 36.8， 产物(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的对映体过剩值达到98.5。 0064 实施例7： 脂肪酶量对1-甲基-3-苯丙胺的选择性酰化的影响 0065 在5个10ml反应瓶中， 分别加入溶剂无水甲苯1800 L、 酰化试剂乙酸。

45、乙酯200 L、 底 物1-甲基-3-苯丙胺60 L， 分别加入实施例2方法制备的磁性固定化脂肪酶90mg、 100mg、 110mg、 120mg、 130mg， 分别在温度为40、 摇床转速为150rpm条件下酰化反应5d， 反应结束 后使用外加磁场回收磁性固定化酶， 使酶与反应液分离， 采用旋转蒸发仪去除有机溶剂后 获得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇， 用孔径0.45 m的有机滤头过滤， 采用实施例3所述HPLC 分析样品中(S)-1-甲基-3-苯丙胺和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的含量， 确定底 物的转化率和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的对映体。

46、过剩值， 结果见表6所示。 0066 表6不同酶量对酰化反应的影响 0067 0068 表6表明当酶量为90mg时， 底物的转化率略低， 随着酶量的增加反应速率逐渐加 快， 底物转化率逐渐增加， 产物的对映体过剩值基本处于稳定状态。 根据成本来确定酶的用 量， 最佳的脂肪酶用量为100mg， (R)-1-甲基-3-苯丙胺转化率达到36.8， 产物(R)-(+)-N- 乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺对映体过剩值达到98.5。 0069 实施例8： 磁场强度对1-甲基-3-苯丙胺的选择性酰化的影响 0070 参见图2， 将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3形成的交变磁场中， 可以调节磁场的。

47、强度和频率。 在5个10ml反应瓶中分别加入溶剂无水甲苯1800 L、 酰化试剂 乙酸乙酯200 L、 底物1-甲基-3-苯丙胺60 L， 实施例2方法制备的磁性固定化脂肪酶100mg， 在40、 磁场频率为500Hz的交变磁场下反应4h。 施加的磁场强度为4Gs、 8Gs、 12Gs、 16Gs、 20Gs。 反应结束后使用外加磁场回收磁性固定化脂肪酶， 使酶与反应液分离， 采用旋转蒸发 说明书 8/11 页 11 CN 111041014 A 11 仪去除有机溶剂后获得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇， 用孔径0.45 m的有机滤头过滤， 采 用实施例3所述HPLC分析样品中(S)-1-甲。

48、基-3-苯丙胺和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯 丙胺的含量， 确定底物转化率和(R)-(+)-N-乙酰基-1-甲基-3-苯丙胺的对映体过剩值， 结 果见表7所示。 0071 表7不同磁场强度对酰化反应的影响 0072 0073 表7表明， 磁场强度对产物的对映体过剩值影响不大， 底物1-甲基-3-苯丙胺的转 化率呈现出先上升后下降的趋势。 当磁场强度小于12Gs时， 磁性固定化脂肪酶APTES-Fe3O4- CS2-LIP10处于活化状态， 转化率会随着磁场强度的增加而升高。 当磁场强度大于12Gs时， 底物的转化率就会开始下降， 因为磁性固定化脂肪酶APTES-Fe3O4-CS。

49、2-LIP10在外部磁场的 作用下会产生感应磁场， 磁场之间的相互作用会影响酶的空间构象， 从而引起酶活性的变 化。 当磁场强度为12Gs， 磁场频率为500Hz时， 底物1-甲基-3-苯丙胺的转化率达到40.3， 产物的对映体过剩值达到98.5， 结果高于在非磁场中的转化率。 0074 实施例9： 在连续流反应器中底物流速对1-甲基-3-苯丙胺的选择性酰化的影响 0075 参照图3连续流反应器， 将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3形成的 交变磁场中； 所述反应罐2通过恒流泵4与底物罐5连通， 所述底物罐5通过恒流泵4与产物罐 6连通， 所述产物罐6与反应罐2连通。 0076 向反。

50、应罐中加入100mg实施例2方法制备的磁性固定化酶， 分别加入溶剂无水甲苯 1800 L、 酰化试剂乙酸乙酯200 L、 底物1-甲基-3-苯丙胺12 L于底物罐， 通过恒流泵将底物 泵入反应罐中， 底物流速分别为25、 30、 40、 50、 100、 200、 300、 400、 500 L/min， 以底物流速相 同的速度将反应产物泵入底物罐中。 反应在40、 磁场频率为500Hz， 磁场强度为12Gs的交 变磁场下进行， 连续反应4h， 反应结束后使用外加磁场回收沉淀， 使酶与反应液分离， 采用 旋转蒸发仪去除有机溶剂后获得透明的晶状物， 加入2mL异丙醇， 用孔径0.45 m的有机滤。