抑制HMBOX1基因表达的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910268414.5 (22)申请日 2019.04.04 (71)申请人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上大路99号 (72)发明人 肖俊杰贝毅桦梁绪春朱玉娇 (74)专利代理机构 上海上大专利事务所(普通 合伙) 31205 代理人 顾勇华 (51)Int.Cl. A61K 31/711(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 抑制HMBOX1基因表达的应用 (57)摘要 本发明涉及一。

2、种抑制HMBOX1基因表达在制 备治疗病理性心脏重构药物中的应用。 本发明通 过蛋白免疫印记法发现HMBOX1在游泳组织中表 达降低， 在心肌缺血再灌注组织中表达异常升 高， 进一步的功能学实验表明下调HMBOX1发挥保 护心肌缺血再灌注后病理性心脏重构的作用。 据 此， 可将HMBOX1应用于病理性心脏重构的诊断或 开发抑制病理性心脏重构的药物。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图4页 CN 111184736 A 2020.05.22 CN 111184736 A 1.一种抑制HMBOX1基因表达在制备治疗病理性心脏重构药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 所述的病理性。

3、心脏重构为： 缺血再灌注损伤、 高血压、 瓣 膜反流和心肌梗死等心血管疾病导致的病理性心脏重构。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111184736 A 2 抑制HMBOX1基因表达的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种抑制HMBOX1基因表达在制备治疗病理性心脏重构药物中的应用。 背景技术 0002 病理性心脏重构是在心脏遭受缺血、 缺氧、 负荷增加等病理性刺激后所发生的一 种适应性改变， 是许多心血管疾病发生发展的重要阶段， 将导致心功能下降、 心脏纤维化， 并最终发展为心力衰竭。 临床上针对急性心肌梗死患者最关键也最有效的方法就是在缺血 早期的再灌注治疗， 这虽然有效地改善了急性心。

4、肌梗死的死亡率， 但是心肌组织缺血后再 重新恢复血流的过程也会造成大量的心肌细胞坏死和凋亡， 这种现象被称为心肌缺血再灌 注损伤。 临床上常见的病理性心脏重构可发生于心肌缺血再灌注损伤后的重构期， 也可发 生于高血压、 瓣膜反流、 心肌梗死等其它心血管疾病。 0003 运动训练是防治多种心血管疾病的辅助治疗方法。 与病理性心脏重构不同， 生理 性心脏重构可以促进心肌细胞体积增大和数目增多， 而不会导致心肌细胞的丢失、 心脏纤 维化及心功能下降。 国内外的相关研究表明持久有规律的运动可以促进心脏的生理性肥大 和心脏再生， 从而保护心肌缺血再灌注损伤及主动脉弓缩窄所致的病理性心脏重构。 综上， 从。

5、分子水平寻找病理性心脏重构的诊断指标与干预靶点具有重要的临床意义。 0004 转录因子是一大类能与基因5 端上游特定序列专一性结合， 从而保证目的基因以 特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。 可能的作用方式有三种： 1)与启动子 的调控位点结合， 阻止其它转录因子的结合； 2)作用于其它转录因子， 抑制其它因子的作 用； 3)通过改变DNA的高级结构阻止转录的发生。 靶基因可以和转录因子的DNA结合域实现 共价结合， 从而对基因的表达起抑制或增强的作用。 既往研究表明， 转录因子参与广泛的生 理学过程， 包括发育、 免疫和身体对应激的反应。 对转录因子表达、 活性、 调控和基因序列的。

6、 分析有助于研究人员确定它们在生理和病理过程中所起作用的意义。 在2011年， C颜等 (用于治疗或预防病理性心脏重构和心力衰竭的方法及组合物， 公布号CN102099030A)在有 效防治病理性心脏重构及其所致心力衰竭的前提下给患者使用PDE1抑制剂。 除此之外， 目 前尚无其他抑制剂对病理性心脏重构诊断与治疗的发明。 发明内容 0005 本发明的目的之一在于提供一种抑制HMBOX1基因表达在制备治疗病理性心脏重 构药物中的应用。 0006 所述的病理性心脏重构为： 心肌缺血再灌注损伤、 高血压、 瓣膜反流及心肌梗死等 心血管疾病所致的病理性心脏重构。 0007 本发明中HMBOX1是一种对。

7、病理性心脏重构有调控作用的转录因子， HMBOX1是在人 的胰腺cDNA中首次克隆得到的， 但迄今为止对其功能的研究还较少。 HMBOX1已被发现可以 定位在细胞核内作为转录因子抑制基因的表达， 同时也可作为端粒结合蛋白调控细胞衰 老。 除了定位于细胞核， HMBOX1也被发现可以定位于血管内皮细胞的细胞质中， 通过与MT2A 说明书 1/4 页 3 CN 111184736 A 3 的相互作用， 抑制细胞凋亡并促进细胞自噬。 0008 该发明中用于抑制HMBOX1基因表达是一段保守的核苷酸序列， 其核苷酸序列为： 0009 Forward： ccgggcctagctgtcatggaaagtt。

8、ctcgagaactttccatgacagctaggctttttg 0010 Reverse： aattcaaaaagcctagctgtcatggaaagttctcgagaactttccatgacagctaggc 0011 制备具有治疗病理性心脏重构的靶向药物， 其靶向药物的特征在于： 该药物的主 要成分为HMBOX1的抑制剂， 其靶标不限于HMBOX1本身， 还包括HMBOX1下游分子， 如ETS1等。 其来源包括天然的或是人工合成的， 或者使用可以过表达该药物的载体转染细胞获得； 所 述抑制剂能够抑制细胞和组织中HMBOX1的表达、 或能够破坏细胞和组织中HMBOX1的稳定 性、 或能够降。

9、低细胞和组织中HMBOX1的活性、 或能够降低细胞或者组织中HMBOX1的有效作 用时间； 抑制剂可以选自： 蛋白、 小分子化合物、 寡核苷酸表达载体； 药物载体包括但不限于 稀释剂、 缓冲剂、 混悬剂、 乳剂、 颗粒剂、 包囊剂、 赋形剂或吸附载体， 最终药物疗效为能抑制 细胞或组织内的HMBOX1的表达量。 0012 研究发现HMBOX1在小鼠游泳的心脏组织中表达降低， 在心肌缺血再灌注组织中表 达异常升高， 进一步的功能学实验表明下调HMBOX1能够抵抗心肌缺血再灌注损伤后的病理 性心脏重构， 并筛选出ETS1是其作用的下游分子。 在2009年， 张建等(重组人HMBOX1表达载 体以及。

10、该载体表达产物及其抗体与应用， 公布号CN101555484)发现重组人HMBOX1表达载体 以及该载体表达产物及其抗体与应用。 在2009年,田志刚等(人转录因子HMBOX1基因的应 用， 公布号CN101555486)发现HMBOX1基因过表达后对自然杀伤细胞调控的应用。 此次基于 HMBOX1这个创新性的发现， 拟开发针对病理性心脏重构的HMBOX1相关的诊断工具和靶向药 物。 0013 本发明通过蛋白免疫印记法发现HMBOX1在游泳组织中表达降低， 在心肌缺血再灌 注组织中表达异常升高， 进一步的功能学实验表明下调HMBOX1发挥保护心肌缺血再灌注后 病理性心脏重构的作用。 据此， 可。

11、将HMBOX1应用于病理性心脏重构的诊断或开发抑制病理 性心脏重构的药物。 附图说明 0014 图1为HMBOX1在游泳训练后的心脏中表达下调， 在心肌缺血再灌注损伤3周后的心 肌梗死区表达上调。 (A)C57BL/6成年公鼠进行3周游泳训练， 免疫印迹法显示HIPK1在游泳 心脏组织中的表达下调(n5:6)。 (B)选取成年公鼠施行冠状动脉左前降支结扎， 30分钟后 松开， 开放结扎后3周收集心脏组织样品。 免疫印迹法显示HIPK1在心肌缺血再灌注损伤的 心肌梗死区表达上调(n3)。 *， P0.05； *， P0.01。 0015 图2为抑制HMBOX1促进新生大鼠心肌细胞的肥大， 但不影。

12、响心肌细胞的增殖。 (A) EdU与心肌细胞特异性标志基因 -actinin双色免疫荧光染色。 比例尺100 m。 (B)敲低 HMBOX1不影响心肌细胞的增殖(n4)。 (C)敲低HMBOX1促进心肌细胞的肥大(n4)。 *， P 0.01。 0016 图3为抑制HMBOX1可以抵抗氧葡萄糖剥夺恢复(OGDR)诱导的新生大鼠心肌细胞凋 亡。 (A)Tunel与心肌细胞特异性标志基因 -actinin双色免疫荧光染色。 比例尺100 m。 (B)敲低HMBOX1可以减少OGDR诱导的新生大鼠心肌细胞的凋亡率(n4)。 *， P0.05； *， P 0.01。 说明书 2/4 页 4 CN 11。

13、1184736 A 4 0017 图4为HMBOX1在心肌细胞中富集表达。 (A)qPCR鉴定分选的原代心肌细胞(NRCM)和 成纤维细胞(NRCF)的标志基因表达(n4-6)。 (B)qPCR显示HMBOX1在心肌细胞中的表达量 显著高于成纤维细胞(n4-6)。 (C)生物信息学软件(Genomatix Software Suite)筛选出 ETS1是HMBOX1的一个下游分子。 *， P0.01； *， P0.001。 0018 图5为抑制HMBOX1能够保护心肌缺血再灌注损伤引起的病理性心脏重构。 (A)蛋白 免疫印记法验证心肌组织中敲低HMBOX1病毒的效率(n3)。 (B)选取C57。

14、BL/6成年公鼠施行 冠状动脉左前降支(LAD)结扎， 结扎30分钟后松开， 开放结扎后3周运用小动物心脏超声检 测左室射血分数(EF， )和左室短轴缩短率(FS， )， 抑制HMBOX1能够显著改善小鼠的心功 能(n6-7)。 *， P0.05； *， P0.01。 具体实施方式 0019 参见图1图5， 以下结合具体实施例， 来进一步说明本发明的技术方案。 应理解， 以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。 0020 1.新生大鼠心肌细胞(NRCM)和成纤维细胞(NRCF)的分离与培养： 称取27.2g的 NaCl， 19.04g的HEPES， 0.552g的NaH2PO4， 。

15、2.4g的Glucose， 1.6g的KCl， 0.82g的MgSO4 7H2O， 调节溶液pH值为7.4， 加灭菌的ddH2O至400mL从而配成10ADS备用。 称取胶原酶粉末 0.016g和胰酶粉末0.024g， 用1xADS配成40mL胰酶胶原酶混合液， 后用0.22 m的滤头过滤后 使用。 用75乙醇消毒刚出生大鼠胸腹部， 取心脏， 用镊子轻柔挤压净心脏中血液， 在玻璃 瓶中将心脏充分剪碎， 加入适量的胰酶胶原酶混合液与心脏组织块充分混合， 后将玻璃瓶 放入摇床(提前设定37)中120rpm震荡消化， 20min后将消化液收集到离心管里， 加入马血 清终止消化。 然后将混合液1200。

16、rpm， 5min离心， 弃上清， 用培养基进行重悬， 反复重复上述 步骤， 直到组织块被充分消化为止， 用滤网将细胞悬液过滤到培养皿中， 差速贴壁60分钟获 得成纤维细胞(成纤维细胞贴壁较心肌细胞快)。 将未贴壁的细胞收集起来， 用密度梯度离 心方法得到心肌细胞。 按照实验所需细胞数目进行铺板， 用心肌细胞培养基培养， 待细胞铺 展开后， 方可进行实验。 0021 2.免疫荧光染色(EDU与 -actinin共染)： 弃去培养基， 用PBS洗3次， 每次5min。 常 温固定细胞30min(4PFA)， PBS洗3次， 每次5min。 破膜20min(0.5TritonX-100)， PBS。

17、洗3 次， 每次5min。 室温封闭2h(5BSA)， 4孵育一抗12h( -actinin： 5BSA1： 200)。 第二天 弃去一抗， PBS洗3次， 每次5min， 室温避光孵育二抗2h(二抗： 5BSA1： 200)。 PBS洗3次， 每 次5min， 按照凯基的EDU试剂盒避光染EDU， DAPI染细胞核20min。 PBS洗3次， 每次5min， 对样 品进行拍照采集。 0022 3.氧葡萄糖剥夺恢复(OGDR)模型诱导心肌细胞凋亡： 对照组转染sh-Scramble和 sh-HMBOX1病毒之后全程正常培养， 实验组转染sh-Scramble和sh-HMBOX1病毒36h后将细。

18、胞 的培养基换成无糖培养基， 并将细胞培养板放置在缺氧盒中孵育8h， 从缺氧盒中取出细胞 培养板进行复氧操作， 并将无糖培养基换回正常心肌细胞培养基， 孵育12h后收细胞进行 Tunel染色。 0023 4.TUNEL染色(TUNEL染色与 -actinin共染)： 弃去培养基， 用PBS洗3次， 每次5min， 每孔加100 l 4多聚甲醛室温固定30min。 PBS洗3次， 每次5min。 每孔加100 l甘氨酸， PBS 洗5min， 每孔加100 l 0.5Triton冰浴破膜20min， PBS洗3次， 每次5min， 每孔加100 l 说明书 3/4 页 5 CN 11118473。

19、6 A 5 0.01M PBS配制成的5的BSA封闭处理1h。 用5BSA: -actinin200:1的比例配制 - actinin一抗， 每孔加入100 l 4冰箱内孵育过夜。 第二天弃去一抗， PBS洗3次， 每次5min， 用5BSA:二抗200:1的比例配制二抗， 常温孵育2h后。 PBS洗3次， 每次5min。 每孔加100 l 1Equilibration Buffer(用双蒸水将5Equilibration Buffer稀释成1 Equilibration Buffer)室温孵育20min， PBS洗3次， 每次5min， 每孔分别加入50 l的TdT孵 育缓冲液， 在避光的条。

20、件下37水浴1h， PBS洗3次， 每次5min。 最后用DAPI染细胞核， PBS洗3 次， 每次5min， 避光保存。 0024 5.蛋白免疫印迹法检测HMBOX1： 运用RIPA裂解液添加1PMSF裂解细胞和组织蛋 白， 运用BCA Protein Assay Kit测定总蛋白浓度。 将蛋白上清液和5Loading buffer(4: 1)混匀后， 用100水浴5min， 待温度冷却后放置20储存。 配制所需浓度的SDS凝胶， 将等 量总蛋白上样， 经凝胶电泳后转移至PVDF膜。 用5脱脂奶粉封闭2hr。 用5脱脂奶粉按1: 1000比例配置一抗HMBOX1， 于4摇床孵育一抗过夜。 次。

21、日， 用TBST清洗(每次10min， 洗3 次)， 用5脱脂奶粉按1:10000比例配置相应二抗， 室温孵育2hr。 用TBST清洗， 最后使用ECL 发光试剂盒在显色仪中曝光显影， 蛋白条带使用Image J软件进行灰度值测量， 用GAPDH作 为内参。 0025 6.细胞RNA提取及HMBOX1、 cTnT、 cTnl、 Col3a1、 Col1a1的检测： 利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取细胞中的总RNA。 利用SYBR法检测HMBOX1、 cTnT、 cTnl、 Col3a1、 Col1a1的相 对表达量， 以18S作为内参引物， 采用2- Ct法进行统计。 0。

22、026 7.小鼠心肌缺血再灌注损伤模型(IRI)诱导病理性心脏重构模型： 首先， 用腹腔注 射麻药方式对小鼠进行麻醉， 待小鼠完全麻醉后， 用医用胶带将小鼠四肢固定在热毯上， 脱 毛膏脱毛。 然后用75酒精消毒手术区域， 显微剪剪开小鼠颈部皮肤， 钝性分离颈部肌肉和 组织， 暴漏出气管， 与呼吸机连接， 观察小鼠呼吸频率与呼吸机频率相同后开始手术。 借助 体视镜， 在镜下用小剪刀在小鼠左胸口第四肋间和第五肋间处剪开一个开口， 露出心脏， 轻 轻分离心包膜， 找到心脏左前降支位置， 用带线缝合线进行结扎， 30s后观察到结扎位点以 下的区域变白了， 说明结扎成功， 开始计时。 左前降支动脉结扎缺。

23、血时间30min后剪开结扎 线， 然后缝合肋骨， 再缝合肌肉， 最后缝合皮肤。 观察小鼠呼吸情况， 当小鼠恢复自主呼吸 后， 拔掉气管插管， 把小鼠放回鼠笼饲养， 术后3周运用小动物心脏超声测定小鼠心功能。 0027 8.小动物心脏超声测定小鼠心功能： 用脱毛膏给小鼠胸部脱毛， 用异氟烷吸入麻 醉法将小鼠麻醉， 固定好小鼠四肢， 并将适量螯合剂涂抹于小鼠心脏部位， 用探头找到小鼠 心脏， 待心率稳定， 取胸骨旁左心室长轴及左心室短轴进行检查， 测量并计算心功能， 获得 左室射血分数EF和左心室短轴缩短率FS。 说明书 4/4 页 6 CN 111184736 A 6 序列表 抑制HMBOX1基。

24、因表达的应用 2019102684145 2019-04-04 2 SIPOSequenceListing 1.0 1 58 DNA HMBOX1基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 1 ccgggcctag ctgtcatgga aagttctcga gaactttcca tgacagctag gctttttg 58 2 58 DNA HMBOX1基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 2 aattcaaaaa gcctagctgt catggaaagt tctcgagaac tttccatgac agctaggc 58 序列表 1/1 页 7 CN 111184736 A 7 图 1 图 2 说明书附图 1/4 页 8 CN 111184736 A 8 图 3 说明书附图 2/4 页 9 CN 111184736 A 9 图 4 说明书附图 3/4 页 10 CN 111184736 A 10 图 5 说明书附图 4/4 页 11 CN 111184736 A 11 。