人DEPDC1基因的用途及相关产品.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911272848.9 (22)申请日 2019.12.12 (71)申请人 中国人民解放军陆军军医大学第二 附属医院 地址 400037 重庆市沙坪坝区新桥正街183 号 (72)发明人 郭俊峰郭俊峰谭颖徽徐帅 周述作季艳丹 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 代理人 许亦琳余明伟 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 3。

2、1/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 人DEPDC1基因的用途及相关产品 (57)摘要 本发明属于生物医药研究领域， 具体涉及人 DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物或 者在制备舌鳞癌诊断药物中的用途。 本发明经过 广泛而深入的研究发现， 采用RNAi方法下调人 DEPDC1基因的表达后可有效地抑制舌鳞癌细胞 的增殖、 促进细胞凋亡， 可以有效地控制舌鳞癌 的生长进程。 本发明提供的siRNA或者包含该 siRNA序列的核酸构建体、 慢病毒能够特异性抑 制舌鳞癌细胞的增殖速率、 促进舌鳞癌细胞凋 亡、 抑制舌鳞癌细胞克隆、 影响舌鳞癌细。

3、胞周期、 抑制舌鳞癌生长， 从而治疗舌鳞癌， 为舌鳞癌治 疗开辟新的方向。 权利要求书2页 说明书13页 序列表3页 附图4页 CN 111269910 A 2020.06.12 CN 111269910 A 1.人DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物或者在制备舌鳞癌诊断药物中的用 途。 2.DEPDC1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途： 治疗舌鳞癌； 抑制舌鳞癌细胞的增殖速率； 促进舌鳞癌细胞凋亡； 抑制舌鳞癌细胞克隆； 影响舌鳞癌细胞周期； 抑制舌鳞癌生长。 3.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于， 还包括以下特征中的一项或多项： 1)所述DEPDC1抑制剂是指对。

4、DEPDC1具有抑制效果的分子； 2)所述DEPDC1抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一； 3)所述DEPDC1抑制剂选自双链RNA、 shRNA、 抗体或小分子化合物。 4.根据权利要求3所述的用途， 其特征在于， 还包括以下特征中的一项或多项： 1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO： 1所示； 2)所述双链RNA包含第一链和第二链， 所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚 体， 所述第一链的序列如SEQ ID NO： 2所示； 3)所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示。 5.一种降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的核酸分子， 所述核酸分。

5、子包含： a.双链RNA， 所述双链RNA中含有能够与DEPDC1基因杂交的核苷酸序列； 或者 b.shRNA， 所述shRNA中含有能够与DEPDC1基因杂交的核苷酸序列； 其中， 所述双链RNA包含第一链和第二链， 所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体， 并且所述第一链的序列与DEPDC1基因中的靶序列基本相同； 所述shRNA包括正义链 片段和反义链片段， 以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构， 所述正义链片段 和所述反义链片段的序列互补， 并且所述正义链片段的序列与DEPDC1基因中的靶序列基本 相同。 6.根据权利要求5所述的降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的。

6、核酸分子， 其特征在于， 还包括以下特征中的一项或多项： 1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO： 1所示； 2)所述双链RNA为siRNA， 所述siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO： 2所示； 3)所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示。 7.一种DEPDC1基因干扰核酸构建体， 含有编码权利要求5-6任一权利要求所述核酸分 子中的shRNA的基因片段， 能表达所述shRNA。 8.一种DEPDC1基因干扰慢病毒， 由权利要求7所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、 细胞系的辅助下， 经过病毒包装而成。 9.根据权利要求5-6任一权利要求所述的核酸。

7、分子， 或权利要求7所述DEPDC1基因干扰 核酸构建体， 或权利要求8所述的DEPDC1基因干扰慢病毒的用途， 为： 用于制备预防或治疗 舌鳞癌的药物， 或用于制备降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的试剂盒。 10.一种用于预防或治疗舌鳞癌的组合物， 其有效物质含有： 权利要求书 1/2 页 2 CN 111269910 A 2 权利要求5-6任一权利要求所述的核酸分子； 和/或， 权利要求7所述DEPDC1基因干扰核 酸构建体； 和/或， 权利要求8所述的DEPDC1基因干扰慢病毒， 以及药学上可接受的载体、 稀 释剂或赋形剂。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111269910 A 。

8、3 人DEPDC1基因的用途及相关产品 技术领域 0001 本发明属于生物医药研究领域， 具体涉及人DEPDC1基因的用途及相关产品。 背景技术 0002 DEPDC1(DEP domain containing 1)是一种编码基因， 可能作为转录辅助抑制因 子参与转录调控。 有研究发现DEPDC1在细胞周期过程中发挥重要的作用， 在同步化处理的 细胞中DEPDC1在细胞周期的有丝分裂期高度表达。 免疫荧光检测显示DEPDC1在分裂间期主 要定位于细胞核中， 在分裂中期核膜破裂后重新分布到整个细胞中。 此外敲低DEPDC1的表 达可引起显著的有丝分裂停滞。 总之， 该基因DEPDC1在调节细胞。

9、有丝分裂进程中起关键作 用(Mi Y,Zhang C,Bu Y,Zhang Y,He L,Li H,Zhu H,Li Y,Lei Y,Zhu J.DEPDC1 is a novel cell cycle related gene that regulates mitotic progression.BMB Rep.2015Jul； 48(7):413-8.)。 0003 口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤， 多起源于舌， 其次为口底、 颊部 及牙龈。 舌鳞状细胞癌是口腔鳞状细胞癌(TSCC)的一种典型亚类。 近年来， 针对TSCC的综合 治疗已经取得巨大进展， 然而TSCC患者的长期生。

10、存率并没有得到很好的改善， 舌鳞癌的临 床诊治依旧面临巨大的挑战。 发现和研究舌鳞癌更有意义的诊治标志物以及更有效的药物 靶点， 具有重要意义。 0004 目前还未有DEPDC1基因用于舌鳞癌治疗的相关报道。 发明内容 0005 为了克服现有技术中所存在的问题， 本发明的目的在于提供人DEPDC1基因的用途 及相关产品。 0006 为了实现上述目的以及其他相关目的， 本发明采用如下技术方案： 0007 本发明的第一方面， 提供人DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物或者在制 备舌鳞癌诊断药物中的用途。 0008 所述人DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物具体是指： 将DEPDC1。

11、基因作为 作用对象， 对药物或制剂进行筛选， 以找到可以抑制人DEPDC1基因表达的药物作为舌鳞癌 治疗备选药物。 如本发明所述的DEPDC1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人DEPDC1基因为 作用对象筛选获得的， 可用作具有抑制舌鳞癌细胞增殖作用的药物。 除此之外， 诸如抗体药 物， 小分子药物等也可将DEPDC1基因作为作用对象。 0009 所述将人DEPDC1基因作为靶标用于制备舌鳞癌诊断药物具体是指： 将DEPDC1基因 表达产物作为一项舌鳞癌诊断指标应用于舌鳞癌诊断药物的制备。 0010 所述舌鳞癌治疗药物为能够特异性抑制DEPDC1基因的转录或翻译， 或能够特异性 抑制D。

12、EPDC1蛋白的表达或活性的分子， 从而降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因的表达水平， 达 到抑制舌鳞癌细胞的增殖、 生长、 分化和/或存活的目的。 0011 所述通过DEPDC1基因制备获得的舌鳞癌治疗药物或者舌鳞癌诊断药物包括但不 说明书 1/13 页 4 CN 111269910 A 4 限于： 核酸分子、 碳水化合物、 脂类、 小分子化学药、 抗体药、 多肽、 蛋白或干扰慢病毒。 0012 所述核酸包括但不限于： 反义寡核苷酸、 双链RNA(dsRNA)、 核酶、 核糖核酸内切酶 III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。 0013 所述舌鳞癌治疗药物的施用量为足够降低人D。

13、EPDC1基因的转录或翻译， 或者足够 降低人DEPDC1蛋白的表达或活性的剂量。 以使人DEPDC1基因的表达至少被降低50、 80、 90、 95或99。 0014 采用前述舌鳞癌治疗药物治疗舌鳞癌的方法， 主要是通过降低人DEPDC1基因的表 达水平抑制舌鳞癌细胞的增殖来达到治疗的目的。 具体的， 治疗时， 将能有效降低人DEPDC1 基因表达水平的物质给药于患者。 0015 在一种实施方式中， 所述DEPDC1基因的靶标序列如SEQ ID NO： 1所示。 具体为： 5 - tatccagtaaggctatcat-3 。 0016 本发明的第二方面， 提供DEPDC1抑制剂在制备至少具。

14、备以下功效之一的产品中的 用途： 0017 治疗舌鳞癌； 0018 抑制舌鳞癌细胞的增殖速率； 0019 促进舌鳞癌细胞凋亡； 0020 抑制舌鳞癌细胞克隆； 0021 影响舌鳞癌细胞周期； 0022 抑制舌鳞癌生长。 0023 所述产品必然包括DEPDC1抑制剂， 并以DEPDC1抑制剂作为前述功效的有效成分。 0024 所述产品中， 发挥前述功用的有效成分可仅为DEPDC1抑制剂， 亦可包含其他可起 到前述功用的分子。 0025 亦即， DEPDC1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。 0026 所述产品可以为单成分物质， 亦可为多成分物质。 0027 所述产品的形式无特殊限制，。

15、 可以为固体、 液体、 凝胶、 半流质、 气雾等各种物质形 式。 0028 所述产品主要针对的对象为哺乳动物。 所述哺乳动物优选为啮齿目动物、 偶蹄目 动物、 奇蹄目动物、 兔形目动物、 灵长目动物等。 所述灵长目动物优选为猴、 猿或人。 0029 所述产品包括但不限于药物、 保健品、 食品等。 0030 所述DEPDC1抑制剂可以为核酸分子、 抗体、 小分子化合物。 0031 如本发明实施例列举的， 所述DEPDC1抑制剂可以为降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因 表达的核酸分子。 具体的， 可以是双链RNA或shRNA。 0032 本发明的第三方面， 提供了一种治疗舌鳞癌的方法， 为向对象施用。

16、DEPDC1抑制剂。 0033 所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的舌鳞癌细胞。 所述哺乳动物优选为啮齿 目动物、 偶蹄目动物、 奇蹄目动物、 兔形目动物、 灵长目动物等。 所述灵长目动物优选为猴、 猿或人。 所述舌鳞癌细胞可以为离体舌鳞癌细胞。 0034 所述对象可以是罹患舌鳞癌的患者或者期待治疗的舌鳞癌的个体。 或者所述对象 为舌鳞癌患者或者期待治疗舌鳞癌的个体的离体舌鳞癌细胞。 0035 所述DEPDC1抑制剂可以在接受舌鳞癌治疗前、 中、 后向对象施用。 说明书 2/13 页 5 CN 111269910 A 5 0036 本发明第四方面公开了一种降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的。

17、核酸分子， 所述 核酸分子包含双链RNA或shRNA。 0037 其中， 所述双链RNA中含有能够与DEPDC1基因杂交的核苷酸序列； 0038 所述shRNA中含有能够与DEPDC1基因杂交的核苷酸序列。 0039 进一步的， 所述双链RNA包含第一链和第二链， 所述第一链和所述第二链互补共同 形成RNA二聚体， 并且所述第一链的序列与DEPDC1基因中的靶序列基本相同。 0040 所述DEPDC1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默DEPDC1基因表达时， 被 所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的DEPDC1基因中的片段。 0041 进一步的 ， 所述双链RNA的 靶序列如SE。

18、Q ID NO ： 1所示。 具体为 ： 5- tatccagtaaggctatcat-3 。 更进一步的， 所述双链RNA第一链的序列如SEQ ID NO： 2所示。 具 体为5 -uauccaguaaggcuaucau-3 。 0042 进一步的， 所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。 0043 SEQ ID NO： 2为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、 针对人 DEPDC1基因的小干扰RNA的一条链， 另一条链即第二链的序列与第一链序列互补， 该siRNA 可以起到特异性沉默舌鳞癌细胞中内源DEPDC1基因表达的作用。 0044 所述shRNA包括正义。

19、链片段和反义链片段， 以及连接所述正义链片段和反义链片 段的茎环结构， 所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补， 并且所述正义链片段的序 列与DEPDC1基因中的靶序列基本相同。 0045 进一步的， 所述sh RNA的靶序列如SEQ ID NO： 1所示。 0046 所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默舌鳞癌细 胞中内源DEPDC1基因表达的作用。 0047 进一步的， 所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一： UUCAAGAGA、 AUG、 CCC、 UUCG、 CCACC、 CTCGAG、 AAGCUU和CCACACC。 0048 更进一步。

20、的， 所述shRNA的序列如SEQ ID NO： 3所示。 具体为5 -gcuauccaguaaggc uaucaucucgagaugauagccuuacuggauagc-3 。 0049 进一步的， 所述DEPDC1基因来源于人。 0050 本发明第五方面， 公开了一种DEPDC1基因干扰核酸构建体， 含有编码前述核酸分 子中的shRNA的基因片段， 能表达所述shRNA。 0051 所述的DEPDC1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人DEPDC1基因shRNA的基因 片段克隆入已知载体获得。 0052 进一步的， 所述DEPDC1基因干扰核酸构建体为DEPDC1基因干扰慢病毒载体。 00。

21、53 本发明公开的DEPDC1基因干扰慢病毒载体是将编码前述DEPDC1基因shRNA的DNA 片段克隆入已知载体获得， 所述已知载体多为慢病毒载体， 所述DEPDC1基因干扰慢病毒载 体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后， 感染舌鳞癌细胞， 进而转录出本发明所述 shRNA， 通过酶切加工等步骤， 最终获得所述siRNA， 用于特异性沉默DEPDC1基因的表达。 0054 进一步的， 所述DEPDC1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码舌鳞癌 细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列； 较优的， 所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白 (GFP)。 0055 进一步的， 所述慢病毒载体可以选。

22、自： pLKO.1-puro、 pLKO.1-CMV-tGFP、 pLKO.1- 说明书 3/13 页 6 CN 111269910 A 6 puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Neo、 pLKO.1-Neo、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV- TagCFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO.1-puro-CMV- TagFP635、 pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、 pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPT。

23、G- 1xLacO、 pLKO-puro-IPTG-3xLacO、 pLP1、 pLP2、 pLP/VSV-G、 pENTR/U6、 pLenti6/BLOCK-iT- DEST、 pLenti6-GW/U6-laminshrna、 pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、 pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、 pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。 0056 本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人DEPDC1基因干扰慢病毒 载体， 命名为pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA。 0057 本发明的D。

24、EPDC1基因siRNA可用于抑制舌鳞癌细胞的增殖， 进一步地可以用作治 疗舌鳞癌的药物或制剂。 DEPDC1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述DEPDC1基因siRNA。 当用作治疗舌鳞癌的药物或制剂时， 是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。 具 体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。 0058 本发明第六方面， 公开了一种DEPDC1基因干扰慢病毒， 由前述DEPDC1基因干扰核 酸构建体在慢病毒包装质粒、 细胞系的辅助下， 经过病毒包装而成。 该慢病毒可感染舌鳞癌 细胞并产生针对DEPDC1基因的小分子干扰RNA， 从而抑制舌鳞癌细胞的增。

25、殖。 该DEPDC1基因 干扰慢病毒可用于制备预防或治疗舌鳞癌的药物。 0059 本发明的第七方面， 提供前述核酸分子， 或前述DEPDC1基因干扰核酸构建体， 或前 述DEPDC1基因干扰慢病毒的用途， 为： 用于制备预防或治疗舌鳞癌的药物， 或用于制备降低 舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的试剂盒。 0060 所述预防或治疗舌鳞癌的药物的应用为舌鳞癌的治疗提供了一种方法， 具体为一 种预防或治疗对象体内舌鳞癌的方法， 包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。 0061 进一步的， 所述药物用于预防或治疗对象体内舌鳞癌时， 需要将有效剂量的所述 的药物施用于对象中。 采用该方法， 所述舌鳞癌。

26、的生长、 增殖、 复发和/或转移被抑制。 进一 步的， 所述舌鳞癌的生长、 增殖、 复发和/或转移的至少10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95或99的部分被抑制。 0062 所述方法的对象可以为人。 0063 本发明的第八方面， 提供一种用于预防或治疗舌鳞癌的组合物， 其有效物质含有： 0064 前述的核酸分子； 和/或， 前述DEPDC1基因干扰核酸构建体； 和/或， 前述DEPDC1基 因干扰慢病毒， 以及药学上可接受的载体、 稀释剂或赋形剂。 0065 所述组合物可以为药物组合物。 0066 当所述组合物用于预防或治疗对象体内舌鳞癌时， 需要将有效剂。

27、量的所述的组合 物施用于对象中。 采用该方法， 所述舌鳞癌的生长、 增殖、 复发和/或转移被抑制。 进一步的， 所述舌鳞癌的生长、 增殖、 复发和/或转移的至少10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95或99的部分被抑制。 0067 所述组合物的形式无特殊限制， 可以为固体、 液体、 凝胶、 半流质、 气雾等各种物质 形式。 0068 所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。 所述哺乳动物优选为啮齿目动物、 偶蹄 目动物、 奇蹄目动物、 兔形目动物、 灵长目动物等。 所述灵长目动物优选为猴、 猿或人。 0069 综上所述， 本发明设计了针对人DEPDC1基因的RN。

28、Ai靶点序列， 构建相应的 说明书 4/13 页 7 CN 111269910 A 7 DEPDC1RNAi载体， 其中RNAi载体pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA能够显著下调DEPDC1基因在 mRNA水平和蛋白水平的表达。 使用慢病毒(lentivirus， 简写为Lv)作为基因操作工具携带 RNAi载体pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA能够靶向地将针对DEPDC1基因的RNAi序列高效导入舌 鳞癌CAL27细胞， 降低DEPDC1基因的表达水平， 显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。 因此慢 病毒介导的DEPDC1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。 007。

29、0 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0071 本发明经过广泛而深入的研究发现， 采用RNAi方法下调人DEPDC1基因的表达后可 有效地抑制舌鳞癌细胞的增殖、 促进细胞凋亡， 可以有效地控制舌鳞癌的生长进程。 本发明 提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、 慢病毒能够特异性抑制舌鳞癌细胞的增 殖速率、 促进舌鳞癌细胞凋亡、 抑制舌鳞癌细胞克隆、 影响舌鳞癌细胞周期、 抑制舌鳞癌生 长， 从而治疗舌鳞癌， 为舌鳞癌治疗开辟新的方向。 附图说明 0072 图1： RT-PCR检测CAL27细胞mRNA水平靶基因消减效率。 0073 图2： Western Blot检测C。

30、AL27细胞靶点降低DEPDC1基因蛋白水平表达情况。 0074 图3： Cellomics细胞自动分析结果揭示DEPDC1基因的消减抑制舌鳞癌细胞的增 殖。 (细胞系为CAL27细胞， 病毒感染后1， 2， 3， 4以及5天分别对细胞数量进行统计) 0075 图4： MTT法检测DEPDC1基因的消减抑制舌鳞癌细胞的增殖。 0076 图5a： 流式细胞仪检测shDEPDC1对CAL27细胞周期的影响。 (为流式细胞周期图) 0077 图5b： 流式细胞仪检测shDEPDC1对CAL27细胞周期的影响。 (以细胞百分比平均值 标准差显示) 0078 图6： Annexin V-APC流式细胞凋。

31、亡检测shDEPDC1对CAL27细胞凋亡的影响。 0079 (为流式细胞凋亡示意图， 右侧柱状结果以细胞百分比平均值标准差显示。 ) 0080 柱形图代表三次实验的平均值， 误差线表示标准偏差(SD)。 0081 *,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比， P0.01。 0082 *,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比， 0.01P0.05。 具体实施方式 0083 本发明从细胞功能学角度出发证实DEPDC1基因在舌鳞癌发生中的作用。 通过构建 目的基因shRNA慢病毒后转染舌鳞癌细胞， 与转染对照慢病毒做对比， 检测两组舌鳞癌细胞 系内mRNA及蛋白质水平目的基因。

32、的表达情况； 随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、 凋 亡等检测， 结果显示shRNA组与对照组对比， shRNA组舌鳞癌细胞增殖抑制程度明显高于对 照组， 细胞凋亡率增加程度较对照组高。 0084 依据上述研究结果， 进一步探索， 开发针对该基因的诊断治疗新方法， 能给舌鳞癌 患者的诊断治疗提供更多选择。 0085 DEPDC1抑制剂 0086 指对于DEPDC1具有抑制效果的分子。 对于DEPDC1具有抑制效果包括但不限于： 抑 制DEPDC1的表达或活性。 0087 抑制DEPDC1活性是指使DEPDC1活力下降。 优选地， 相比抑制前， DEPDC1活力下降至 说明书 5/13 页 8。

33、 CN 111269910 A 8 少10， 较佳的降低至少30， 再佳的降低至少50， 更佳的降低至少70， 最佳的降低至 少90。 0088 抑制DEPDC1表达具体的可以是抑制DEPDC1基因的转录或翻译， 具体的， 可以是指： 使DEPDC1的基因不转录， 或降低DEPDC1的基因的转录活性， 或者使DEPDC1的基因不翻译， 或 降低DEPDC1的基因的翻译水平。 0089 本领域技术人员可以使用常规方法对DEPDC1的基因表达进行调节， 如基因敲除、 同源重组， 干扰RNA等。 0090 DEPDC1的基因表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。 0091。

34、 优选地， 与野生型相比， DEPDC1基因表达降低至少10， 较佳的降低至少30， 再 佳的降低至少50， 更佳的降低至少70， 又佳的降低至少90， 最佳地DEPDC1基因完全没 有表达。 0092 小分子化合物 0093 本发明中指由几个或几十个原子组成， 分子质量在1000以下的化合物。 0094 制备预防或治疗舌鳞癌的药物 0095 可以利用降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的核酸分子； 和/或， DEPDC1基因干扰 核酸构建体； 和/或， DEPDC1基因干扰慢病毒， 作为有效成分， 制备预防或治疗舌鳞癌的药 物。 通常， 所述药物中除了有效成分外， 根据不同剂型的需要， 还会。

35、包括一种或多种药学上 可接受的载体或辅料。 0096 “药学上可接受的” 是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时， 它们不会产 生不利的、 过敏的或其它不良反应。 0097 “药学上可接受的载体或辅料” 应当与所述有效成分相容， 即能与其共混而不会在 通常情况下大幅度降低药物的效果。 可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体 例子是糖类， 如乳糖、 葡萄糖和蔗糖； 淀粉， 如玉米淀粉和土豆淀粉； 纤维素及其衍生物， 如 甲基纤维素钠、 乙基纤维素和甲基纤维素； 西黄蓍胶粉末； 麦芽； 明胶； 滑石； 固体润滑剂， 如 硬脂酸和硬脂酸镁； 硫酸钙； 植物油， 如花生油、 棉籽油、 芝麻。

36、油、 橄榄油、 玉米油和可可油； 多元醇， 如丙二醇、 甘油、 山梨糖醇、 甘露糖醇和聚乙二醇； 海藻酸； 乳化剂， 如Tween； 润湿 剂， 如月桂基硫酸钠； 着色剂； 调味剂； 压片剂、 稳定剂； 抗氧化剂； 防腐剂； 无热原水； 等渗盐 溶液； 和磷酸盐缓冲液等。 这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或 它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。 0098 本发明中， 除非特别说明， 药物剂型并无特别限定， 可以被制成针剂、 口服液、 片 剂、 胶囊、 滴丸、 喷剂等剂型， 可通过常规方法进行制备。 药物剂型的选择应与给药方式相匹 配。 0099 在进一步描。

37、述本发明具体实施方式之前， 应理解， 本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围。 下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件， 或者按照各制造商所建议的条件。 0100 当实施例给出数值范围时， 应理解， 除非本发明另有说明， 每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。 除非另外定义， 本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。 除实施例中使用的具体方法、 设备、 说明书 6/13 页 9 CN 111269910 。

38、A 9 材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载， 还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来实 现本发明。 0101 除非另外说明， 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、 生物化学、 染色质结构和分析、 分析化学、 细胞培养、 重组DNA技术及 相关领域的常规技术。 0102 实施例1针对人DEPDC1基因RNAi慢病毒的制备 0103 1.筛选针对人DEPDC1基因的有效的siRNA靶点 0104 从Genbank调取DEPDC1(NM_017779)基因信息；。

39、 设计针对DEPDC1基因的有效的 siRNA靶点。 表1-1列出了筛选出的针对DEPDC1基因的有效siRNA靶点序列。 0105 表1-1靶向于人DEPDC1基因的siRNA靶点序列 0106 SEQ ID NOTargetSeq(5 -3 ) 1tatccagtaaggctatcat 0107 2.慢病毒载体的制备 0108 针对siRNA靶点(以SEQ ID NO： 1为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的 双链DNA Oligo序列(表1-2)； 以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海 吉凯基因化学技术有限公司提供)， 使其线性化，。

40、 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。 0109 表1-2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo 0110 5颈环颈3SEQ 正义链ccgggctatccagtaaggctatcatctcgagatgatagccttactggatagctttttg4 反义链aattcaaaaagctatccagtaaggctatcatctcgagatgatagccttactggatagc5 0111 通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-4所示， 37， 反应1h)的载体 DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接， 在适当的缓冲体系(连接体系如表1-5所示)中于16 连接。

41、过夜， 回收连接产物。 将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化 操作参考： 分子克隆实验指南第二版55-56页)。 在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下， 溶 于10 l LB培养基， 混匀取1 l作为模板； 在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游， 设计通用 PCR引物， 上游引物序列： 5 -cctatttcccatgattccttcata-3 (SEQ ID NO： 6)； 下游引物序 列： 5 -gtaatacggttatccacgcg-3 (SEQ ID NO： 7)， 进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表1- 6， 反应条件如表1-7)。 对PCR鉴定阳性的克隆进行。

42、测序和比对分析， 比对正确的克隆即为构 建成功的针对SEQ ID NO： 1的表达RNAi的载体， 命名为pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA。 0112 构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒， 阴性对照siRNA靶序列为5 - tatccagtaaggctatcat-3 (SEQ ID NO： 8)。 构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时， 针 对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表1-3)， 其余构建方法、 鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA。 。

43、0113 表1-3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo 说明书 7/13 页 10 CN 111269910 A 10 0114 0115 表1-4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系 0116 试剂体积( l) pGCSIL-GFP质粒(1 g/ l)2.0 10buffer5.0 100BSA0.5 Age I(10U/ l)1.0 EcoR I(10U/ l)1.0 dd H2O40.5 Total50.0 0117 表1-5载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系 0118 试剂阳性对照( l)自连对照( l)连接组( l) 线性化的载体DNA(1。

44、00ng/ l)1.01.01.0 退火的双链DNA Oligo(100ng/ l)1.0-1.0 10T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1.01.01.0 T4噬菌体DNA连接酶1.01.01.0 dd H2O16.017.016.0 Total20.020.020.0 0119 表1-6-1 PCR反应体系 0120 0121 0122 表1-7 PCR反应体系程序设定 说明书 8/13 页 11 CN 111269910 A 11 0123 0124 3.包装DEPDC1-siRNA慢病毒 0125 以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRN。

45、A的DNA， 配制成100ng/ l储存液。 0126 转染前24h， 用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞， 以含10胎牛血 清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5105细胞/ml， 接种于6孔板， 37， 5CO2培养箱 内培养。 待细胞密度达70-80时即可用于转染。 转染前2h， 吸出原有培养基， 加入1.5ml 新鲜的完全培养基。 按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂 盒的说明， 向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20 l， PEI 12 l， 无血清DMEM培养基 400 l， 取。

46、20 l上述抽提的质粒DNA， 加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。 0127 将上述转染混和物在室温下孵育15min， 转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中， 37， 5CO2培养箱内培养16h。 弃去含有转染混和物的培养介质， PBS溶液洗涤， 加入完全 培养基2ml， 继续培养48h。 收集细胞上清液， Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore) 纯化和浓缩慢病毒， 步骤如下： (1)4， 4000g离心10min， 除去细胞碎片； (2)0.45 m滤器过 滤上清液于40ml超速离心管中； (3)4000g离心， 10-15min， 至需要的病毒浓缩体积。

47、； (4)离心 结束后， 将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开， 将过滤杯倒扣在样品收集杯上， 离心2min离 心力不超过1000g； (5)把离心杯从样品收集杯上移开， 样品收集杯中的即为病毒浓缩液。 将 病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。 病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO:2所示。 对照慢病毒的包装过程同DEPDC1-siRNA慢病毒， 仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载 体代替pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA载体。 0128 实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测基因的沉默效率 0129 处于对数生长期的人舌鳞癌CAL27细胞进行胰酶。

48、消化， 制成细胞悬液(细胞数约为 5104/ml)接种于6孔板中， 培养至细胞融合度达到约30。 根据侵染复数值(MOI， CAL27： 10)， 加入适宜量的实施例1制备的慢病毒， 培养24h后更换培养基， 待侵染时间达到5天后， 收集细胞。 根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书， 抽提总RNA。 根据Promega公司的M- MLV操作说明书， 将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表2-1， 42反应1h， 然后在70 水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。 0130 采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。 DEPDC1基因。

49、的引物如 下： 上游引物5 -atgcgtatgatttcccgaatgag-3 (SEQ ID NO： 11)和下游引物5 - cacagcataacacacatcgagaa-3 (SEQ ID NO： 12)。 以管家基因GAPDH为内参， 引物序列如下： 上游引物5 -tgacttcaacagcgacaccca-3(SEQ ID NO ： 13) 和下游引物5 - caccctgttgctgtagccaaa-3 (SEQ ID NO： 14)。 按表2-2中的比例配置反应体系。 0131 表2-1逆转录反应体系 0132 试剂体积( l) 5RT buffer4.0 10mM dNTPs。

50、2.0 说明书 9/13 页 12 CN 111269910 A 12 RNasin0.5 M-MLV-RTase1.0 DEPC H2O3.5 Total11.0 0133 表2-2 Real-time PCR反应体系 0134 试剂体积( l) SYBR premix ex taq10.0 上游引物(2.5 M)0.5 下游引物(2.5 M)0.5 cDNA1.0 ddH2O8.0 Total20.0 0135 设定程序为两步法Real-time PCR： 预变性95， 15s； 之后每一步变性95， 5s； 退 火延伸60， 30s； 共进行45个循环。 每次在延伸阶段读取吸光值。 PC。