副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911342111.X (22)申请日 2019.12.24 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: M2016667 2016.11.23 (71)申请人 顾容铖 地址 310011 浙江省杭州市西湖区政苑小 区D区75幢1单元401室 (72)发明人 顾容铖顾青 (74)专利代理机构 宁波理文知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 33244 代理人 李高峰孟湘明 (51)Int.Cl. C07K 14/335(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C。

2、07K 1/16(2006.01) (54)发明名称 副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法 (57)摘要 本发明公开一种副干酪乳杆菌ZMF54细菌素 的分离纯化方法， 其包括步骤： (A)获取副干酪乳 杆菌ZFM54； (B)细菌素效价的测定； (C)副干酪乳 杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定； (D) 发酵上清液的制备； (E)大孔树脂吸附层析； (F) 离子交换色谱； (G)凝胶过滤层析； 以及(H)制备 型HPLC纯化， 通过多步分离纯化方法得到副干酪 乳杆菌ZMF54细菌素。 权利要求书2页 说明书24页 附图17页 CN 111285925 A 2020.06.16 。

3、CN 111285925 A 1.一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其特征在于， 包括步骤： (A)获取副干酪乳杆菌ZFM54； (B)细菌素效价的测定； (C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定； (D)发酵上清液的制备； (E)大孔树脂吸附层析； (F)离子交换色谱； (G)凝胶过滤层析； 以及 (H)制备型HPLC纯化。 2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其进一步包括步 骤： 反相HPLC分析。 3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其进一步包括步 骤： Tricine-SDS-PAGE方法。

4、检测细菌素的分子量。 4.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其进一步包括步 骤： BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。 5.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步骤 (C)包括： 确定发酵时间对对ZFM54产抑菌物质的影响。 6.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步骤 (C)包括： 确定发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响。 7.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步骤 (C)包括： 确定接种量对ZFM54产抑菌物质的影响。 8.根据权利要求1所述的。

5、副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步骤 (F)中： 选择pH范围广的HiPrep XL SP阳离子柱进行分离。 9.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步骤 (G)中： 选择分辨率是10005000Da的Sephadex G-25凝胶柱对阳离子交换得到的活性组分 进一步分离纯化。 10.根据权利要求9所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步骤 (H)中： 将经Sephadex G-25凝胶柱层析分离纯化得到的活性成分在37旋转蒸发浓缩， 用 制备型C18反相高效液相色谱进一步分离纯化。 11.根据权利要求1-10任。

6、一所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所 述步骤(A)中， 通过钙溶圈、 菌落形态学观察和革兰氏染色实验从初生婴儿粪便中分离到乳 酸菌， 利用牛津杯琼脂扩散法分别测试抑菌活性对乳酸菌进行了初筛， 从中筛选到一株对 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性最强的优势菌株ZFM54。 12.根据权利要求1-10任一所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所 述步骤(A)副干酪乳杆菌ZFM54的获取方法为： 从婴儿粪便中分离乳酸菌； 菌种的活化和保 藏； 指示菌的培养； 乳酸菌初筛； 产细菌素乳酸菌复筛。 13.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54。

7、细菌素的分离纯化方法， 从婴儿粪便中 分离乳酸菌的方法为： 在无菌条件下， 取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释， 振荡使其 充分混匀后静置， 取100 L上清涂布到添加有2碳酸钙的MRS固体培养基平板上， 倒置于37 权利要求书 1/2 页 2 CN 111285925 A 2 培养箱中厌氧培养3648h。 14.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 所述步骤(A) 菌种的活化和保藏方法为： 初步判定为乳酸菌的单菌落， 接种到10mL MRS液体培养基中于 37条件下培养24h， 再以1(v/v)的接种量进行两次传代培养， 活化后编号保种， 取700 L 菌液。

8、加上300 L灭菌甘油于-80保藏菌株。 15.根据权利要求14所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 指示菌的培养 方法为： 将保藏在-80甘油管中的各指示菌菌种， 分别划线于LB固体培养基平板上， 在各 自的最适温度下培养至出现明显单菌落， 挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养 至对数期。 16.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中乳酸菌初 筛方法为： 将活化好的乳酸菌菌株按照1比例分别接种于10mL MRS液体培养基中， 在37 条件下静置培养24h后， 4下8000r/min离心20min获得上清液， 发酵上清液采用牛津杯琼 脂扩。

9、散法测试抑菌活性。 17.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中产细菌素 乳酸菌复筛方法为： 排除有机酸的干扰， 首先测定ZFM54发酵上清液的pH， 然后用1M氢氧化 钠溶液将发酵上清液调至pH5.0， 以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照， 对 藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验， 测量抑菌圈直径大小， 比较抑菌活性区 别。 18.根据权利要求17所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中产细菌素 乳酸菌复筛方法为： 排除过氧化氢的干扰， 将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发 酵上清pH值， 配制浓度为5mg。

10、/mL的过氧化氢酶工作液， 按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工 作液体积比为1:1进行混合， 在37水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性； 同时用以 1:1混合的发酵上清浓缩液和pH7.0的PBS缓冲液作为空白对照， 分别测量抑菌圈直径大小 并比较区别。 19.根据权利要求17所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中包括步骤 菌种鉴定： 细菌素类物质的确定， 配制胃蛋白酶、 胰蛋白酶和蛋白酶K的酶溶液5mg/mL， 将发 酵上清液分别调到各蛋白酶的最适pH值， 然后加入对应酶溶液使其终浓度为1mg/mL， 在37 水浴锅中处理2h， 再调回发酵上清液初始pH值， 以未经蛋白酶处。

11、理的发酵上清液为空白 对照， 采用牛津杯法进行抑菌试验， 测量抑菌圈直径大小并比较区别。 20.根据权利要求19所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中菌种鉴定 包括： 形态学鉴定， 在MRS固体平板上划线分离乳酸菌， 根据平板上长出的单菌落的菌落形 状、 颜色、 透明度、 边缘是否整齐、 表面是否光滑等特征来初步判断该菌株类型， 然后挑取符 合乳酸菌菌落形态且有抑菌活性的菌落进行革兰氏染色， 再用显微镜观察菌体的形态特 征， 并从颜色判断属于革兰氏阳性菌还是阴性菌。 21.根据权利要求19所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中菌种鉴定 包括： 生理生化鉴定，。

12、 分别进行七叶苷水解实验， 淀粉分解实验， 糖醇发酵实验， 过氧化氢酶 实验， 硫化氢实验， 明胶水解实验， 细菌V-P实验。 22.根据权利要求19所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中菌种鉴定 包括： 基于16S rDNA的分子生物学鉴定。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111285925 A 3 副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及菌种培养领域， 更进一步， 涉及一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯 化方法。 背景技术 0002 目前商业化的乳酸菌素Nisin由于对热不稳定， 抑菌谱较窄， 能有效抑制革兰氏阳 性菌但对大多数革。

13、兰氏阴性菌和霉菌等的生长没有抑制作用等原因， 在食品工业中的应用 受到限制。 因此， 开发广谱、 高效的乳酸菌细菌素作为天然防腐剂已成为研究热点而备受关 注。 0003 副干酪乳杆菌常被用作牛奶、 酸奶、 奶油和干酪等乳制品的发酵剂及辅助发酵剂。 细菌素一般定义为某些细菌在代谢过程中由核糖体合成的一类小分子蛋白质或多肽， 这些 物质在一定浓度下对其他微生物具有显著抑菌或杀菌活性。 0004 揭示乳酸菌细菌素的生化特性、 结构及作用机制对开发乳酸菌素资源与应用具有 重要意义， 这些都必须建立在获得乳酸菌纯品的基础上。 迄今科研学者通过大量的产细菌 素乳酸菌的筛选与研究已经发现了百余种乳酸菌素， 。

14、但除了乳酸链球菌素Nisin第一个作 为食品防腐剂应用于食品中外， 真正商业化应用的乳酸菌素却很少， 这是因为乳酸菌素的 分离纯化难度较大， 限制了乳酸菌素纯品的获得， 使其难以深入研究和推广应用。 因此， 建 立一个高效、 快速的纯化流程是推动乳酸菌素研究及其在食品工业中应用的关键所在。 由 于乳酸菌细菌素是一类蛋白质或小分子多肽类物质， 具有蛋白质的基本特性， 所以一般蛋 白质的纯化方法也可以为纯化乳酸菌素借鉴。 而细菌素本身也有独特的理化特性如大多数 带正电荷、 疏水性较强等， 因此需要结合其特异性选择合适的纯化方法。 乳酸菌细菌素属于 胞外分泌型代谢产物， 但是由于发酵上清液中细菌素的。

15、浓度较低， 直接分离纯化的难度较 大， 在检测阶段可能无法准确检出， 因此一般先对发酵上清液进行粗提使其浓缩， 再进行后 续分离纯化。 目前乳酸菌素的纯化流程已经比较成熟， 主要分为粗提、 中度纯化和精细纯化 三个阶段。 发明内容 0005 本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其通 过多步分离纯化方法， 结合形态学鉴定、 生理生化鉴定和16S rDNA同源性分析， 鉴定筛选副 干酪乳杆菌ZMF54。 0006 本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法， 其经 过初筛获得了一株具有较广泛抑菌谱的乳酸菌菌株ZFM54， 为了避免乳酸菌。

16、代谢产生的一 些有机酸、 过氧化氢等物质对抑菌效果产生的干扰， 确定是细菌素类物质发挥的抑菌作用， 并且进一步复筛对这些干扰因素做了逐一排除。 0007 本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其包 括步骤： 说明书 1/24 页 4 CN 111285925 A 4 0008 (A)获取副干酪乳杆菌ZFM54； 0009 (B)细菌素效价的测定； 0010 (C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定； 0011 (D)发酵上清液的制备； 0012 (E)大孔树脂吸附层析； 0013 (F)离子交换色谱； 0014 (G)凝胶过滤层析； 以及 00。

17、15 (H)制备型HPLC纯化。 0016 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其进一步包 括步骤： 反相HPLC分析。 0017 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其进一步包 括步骤： Tricine-SDS-PAGE方法检测细菌素的分子量。 0018 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其进一步包 括步骤： BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。 0019 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(C)包括： 确定发酵时间对对ZFM54产抑菌物质的影响。 0020。

18、 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(C)包括： 确定发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响。 0021 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(C)包括： 确定接种量对ZFM54产抑菌物质的影响 0022 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(F)中： 选择pH范围广的HiPrep XL SP阳离子柱进行分离。 0023 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(G)中： 选择分辨率是10005000Da的Sephadex 。

19、G-25凝胶柱对阳离子交换得到的活性组 分进一步分离纯化。 0024 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(H)中： 将经Sephadex G-25凝胶柱层析分离纯化得到的活性成分在 37旋转蒸发浓缩， 用制备型C18反相高效液相色谱进一步分离纯化。 0025 根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法， 其中所述步 骤(A)中， 通过钙溶圈、 菌落形态学观察和革兰氏染色实验从初生婴儿粪便中分离到乳酸 菌， 利用牛津杯琼脂扩散法分别测试抑菌活性对乳酸菌进行了初筛， 从中筛选到一株对革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性。

20、最强的优势菌株ZFM54。 附图说明 0026 图1是根据本发明的一个优选实施例的菌种ZFM54的获取方法框图。 0027 图2是根据本发明的实施例的乳酸菌分离培养基菌株生长状态。 0028 图3是根据本发明的实施例的抑菌活性测试图， 排除有机酸对抑菌活性的影响。 0029 图4A示意菌株ZFM54的菌落形态。 0030 图4B示意革兰氏染色检验结果。 说明书 2/24 页 5 CN 111285925 A 5 0031 图5示意ZFM54的16S rDNA扩增产物电泳图。 0032 图6示意菌株ZFM54的16S rDNA基因序列系统进化树。 0033 图7示意细菌素效价标准曲线。 0034。

21、 图8示意副干酪乳杆菌ZFM54生长曲线与抑菌活性曲线。 0035 图9示意培养温度对副干酪乳杆菌ZFM54抑菌活性的影响。 0036 图10示意不同接种量对副干酪乳杆菌ZFM54抑菌活性的影响。 0037 图11示XAD-16大孔树脂洗脱组分对指示菌的抑菌活性。 0038 图12示意SP-Sepharose纯化色谱图。 0039 图13示意阳离子交换色谱组分抑菌活性。 0040 图14示意凝胶过滤层析出峰图。 0041 图15示意凝胶过滤层析洗脱组分抑菌活性。 0042 图16示意制备型HPLC纯化色谱图。 0043 图17示意HPLC梯度洗脱组分的抑菌活性。 0044 图18示意分析型高效。

22、液相色谱图。 0045 图19示意ZFM54副干酪乳杆菌素的Tricine-SDS-PAGE图谱。 0046 图20示意BCA法测蛋白浓度标准曲线。 0047 菌种副干酪乳杆菌ZFM54保藏信息： 0048 保藏日期： 2016年11月23日 0049 保藏单位： 中国典型培养物保藏中心 0050 地址： 中国武汉武汉大学 0051 保藏编号： CCTCC NO:M2016667 具体实施方式 0052 以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。 以下描述中的优 选实施例只作为举例， 本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。 在以下描述中界定 的本发明的基本原理可以应用于其他实。

23、施方案、 变形方案、 改进方案、 等同方案以及没有背 离本发明的精神和范围的其他技术方案。 0053 本领域技术人员应理解的是， 在本发明的揭露中， 术语 “纵向” 、“横向” 、“上” 、 “下” 、“前” 、“后” 、“左” 、“右” 、“竖直” 、“水平” 、“顶” 、“底” 、“内” 、“外” 等指示的方位或位置 关系是基于附图所示的方位或位置关系， 其仅是为了便于描述本发明和简化描述， 而不是 指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、 以特定的方位构造和操作， 因此上述 术语不能理解为对本发明的限制。 0054 可以理解的是， 术语 “一” 应理解为 “至少一” 或 “一个或多。

24、个” ， 即在一个实施例中， 一个元件的数量可以为一个， 而在另外的实施例中， 该元件的数量可以为多个， 术语 “一” 不 能理解为对数量的限制。 0055 对 “一个实施例” 、“实施例” 、“示例实施例” 、“各种实施例” 、“一些实施例” 等的引 用指示这样的描述本发明的实施例可包括特定特征、 结构或特性， 但是不是每个实施例必 须包括该特征、 结构或特性。 此外， 一些实施例可具有对其它实施例的描述的特征中的一 些、 全部或没有这样的特征。 说明书 3/24 页 6 CN 111285925 A 6 0056 本发明提供一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法， 其用于分离纯化副干。

25、 酪乳杆菌ZMF54细菌素， 以获得副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的纯品。 0057 进一步， 本发明的副干酪乳杆菌ZMF54通过以下方法获取。 0058 参考图1， 是根据本发明的实施例的副干酪乳杆菌ZMF54的获取及分离纯化方法的 框图示意图。 本发明提供一副干酪乳杆菌ZMF54的获取方法， 所述菌种ZFM54是保藏菌种， 分 类命名： 副干酪乳杆菌ZFM54(Lactobacillus casei ZFM54)。 0059 保藏信息： 0060 保藏日期： 2016年11月23日 0061 保藏单位： 中国典型培养物保藏中心CCTCC 0062 地址： 中国湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号。

26、武汉大学 0063 保藏编号： CCTCC NO:M2016667分类命名： 副干酪乳杆菌ZFM54(Lactobacillus casei ZFM54)。 0064 所述菌种ZFM54的获取方法包括以下步骤： 0065 (S0)： 原材料准备； 主要包括以下几个方面： 0066 (a)确定菌种来源 0067 本实施例中所筛菌种来源于浙江大学医学院附属妇产科医院初生婴儿粪便。 抑菌 实验所用指示菌为本实验室保藏的藤黄微球菌10209(Micrococcus luteus 10209)、 金黄 色葡萄球菌D48(Staphylococcus aureus D48)、 单增李斯特氏菌LM1(Lis。

27、teria monocytogenes LM1)、 大肠杆菌DH5(Escherichia coli DH5 )、 鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015(Salmonella typhimurium CMCC 50015)。 0068 (b)培养基 0069 (1)MRS培养基： 牛肉膏10g， 葡萄糖20g， 蛋白胨10g， 酵母提取物5g， 柠檬酸三铵3g， 磷酸氢二钾2g， 无水乙酸钠5g， 七水硫酸镁0.2g， 硫酸锰0.05 g， 吐温80 1mL， 溶于超纯水并 定容至1L。 调节培养基pH为6.5， 121高压灭菌15min。 固体培养基在此基础上加入1.5 2(W/V)琼脂。 筛。

28、选乳酸菌所用的培养基在此基础上额外添加2的碳酸钙。 0070 (2)LB培养基： 氯化钠10g， 蛋白胨10g， 酵母提取物5g， 超纯水溶解并定容至1L， 调 节培养基pH为7， 121高压灭菌15min。 固体培养基在此基础上加入1.52(W/V)琼脂， 半固体培养基在此基础上加入11.2(W/V) 琼脂。 0071 (c)主要试剂 0072 细菌微量生化鉴定管购于青岛海博生物技术有限公司； 草酸铵结晶紫、 加路哥式 碘液、 碳酸钙、 琼脂糖、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 无水乙醇、 盐酸、 氢氧化钠、 过氧化氢酶、 胰 蛋白酶、 胃蛋白酶、 蛋白酶K、 细菌基因组提取试剂盒购于生工生物工。

29、程(上海)股份有限公 司。 0073 (d)主要仪器 0074 表1实验主要仪器设备 说明书 4/24 页 7 CN 111285925 A 7 0075 0076 进一步， 所述菌种ZMF54的获取方法包括步骤： 0077 (S11):婴儿粪便中乳酸菌的分离 0078 在无菌条件下， 取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释， 振荡使其充分混匀后静 置， 取100 L上清涂布到添加有2碳酸钙的MRS固体培养基平板上， 倒置于37培养箱中厌 氧培养3648h。 选取长势良好且有明显钙溶圈的单菌落分别接种于MRS液体培养基中培养 并编号。 菌液经过反复几次平板划线分离， 挑取单菌落， 进行革兰氏染。

30、色及过氧化氢酶测 试， 革兰氏染色阳性， 过氧化氢酶阴性的菌落初步判定为乳酸菌。 0079 (S12)： 菌种的活化及保藏 0080 初步判定为乳酸菌的单菌落， 接种到10mL MRS液体培养基中于37条件下培养 24h， 再以1(v/v)的接种量进行两次传代培养。 活化后编号保种， 取 700 L菌液加上300 L 灭菌甘油于-80保藏菌株。 0081 (S13)： 指示菌的培养 0082 将保藏在-80甘油管中的各指示菌菌种， 分别划线于LB固体培养基平板上， 在各 自的最适温度下培养至出现明显单菌落， 挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养 至对数期(约12h)。 用无菌生理盐水调。

31、整菌体浓度至OD6000.6， 4保存备用。 0083 (S14)： 乳酸菌初筛 0084 将活化好的乳酸菌菌株按照1(v/v)比例分别接种于10mL MRS液体培养基中， 在 37条件下静置培养24h后， 4下8000r/min离心20min获得上清液， 发酵上清液采用牛津 杯琼脂扩散法测试抑菌活性。 选择抑菌效果最好的菌株， 进行分类鉴定作后续研究。 牛津杯 法抑菌试验具体方法如下： 0085 (1)将灭过菌的LB半固体培养基加热使其充分融化， 轻轻振荡混匀， 并置于55水 浴锅中恒温防止琼脂凝固； 说明书 5/24 页 8 CN 111285925 A 8 0086 (2)将灭过菌的牛津。

32、杯间隔均匀地放置在一次性培养皿上； 0087 (3)将指示菌在漩涡振荡器中振荡混匀， 待LB半固体培养基冷却到45左右后按 1(v/v)的接种量将指示菌菌悬液加入到15mL半固体培养基中， 充分混匀后倒入培养皿 中， 轻轻旋转平皿使其均匀覆盖平皿表面， 注意不要将培养基倒入牛津杯中； 0088 (4)待半固体培养基完全冷却凝固后， 用灭菌的镊子将牛津杯小心拔出， 制成带圆 柱形孔洞的含菌平板； 0089 (5)在每个孔洞中加入100 L待测样品后， 将平板置于4冰箱使样品充分扩散4h， 然后按照不同指示菌各自的最适培养条件培养12h； 0090 (6)用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。 抑菌试。

33、验均做三组平行。 0091 (S15)： 产细菌素乳酸菌复筛 0092 除了细菌素外， 乳酸菌代谢产生的抗菌活性物质还包括一些有机酸和过氧化氢等 物质， 牛津杯法初筛只能筛选出能产生抑菌物质的乳酸菌， 无法确定发挥抑菌作用的是哪 种物质， 因此需要排除有机酸、 过氧化氢对指示菌的抑菌干扰作用。 0093 其具体包括： 0094 (S151):排除有机酸的干扰 0095 首先测定ZFM54发酵上清液的pH， 然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至 pH5.0， 以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照， 对藤黄微球菌10209进行牛津 杯琼脂扩散法抑菌试验， 测量抑菌圈直径大小， 比较。

34、抑菌活性区别。 0096 (S152)： 排除过氧化氢的干扰 0097 将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发酵上清pH值， 配制浓度为 5mg/mL 的过氧化氢酶工作液(溶剂为pH7.0的PBS缓冲液)。 按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工作液 体积比为1 1进行混合， 在37水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性； 同时用以1 1 混合的发酵上清浓缩液和pH7.0的PBS 缓冲液作为空白对照， 分别测量抑菌圈直径大小并 比较区别。 0098 (S153)： 细菌素类物质(多肽)的确定 0099 配制胃蛋白酶、 胰蛋白酶和蛋白酶K的酶溶液5mg/mL， 将发酵上清液分别调到各蛋 白酶的最适。

35、pH值(胃蛋白酶pH2.0、 胰蛋白酶pH5.4、 蛋白酶K pH7.6)， 然后加入对应酶溶液 使其终浓度为1mg/mL， 在37水浴锅中处理2h， 再调回发酵上清液初始pH值。 以未经蛋白酶 处理的发酵上清液为空白对照， 采用牛津杯法进行抑菌试验， 测量抑菌圈直径大小并比较 区别。 0100 所述副干酪乳杆菌ZMF54的获取方法进一步包括步骤： 0101 (S16)： 菌种鉴定 0102 根据 乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法 和 伯杰氏系统细菌学手册 ， 对筛选得到 的抗菌活性最优的菌株进行菌落菌体形态学鉴定和生理生化鉴定。 同时基于16S rDNA基因 进行分子生物学鉴定。 0103 (S。

36、161)： 形态学鉴定 0104 在MRS固体平板上划线分离乳酸菌， 根据平板上长出的单菌落的菌落形状、 颜色、 透明度、 边缘是否整齐、 表面是否光滑等特征来初步判断该菌株类型， 然后挑取符合乳酸菌 菌落形态且有抑菌活性的菌落进行革兰氏染色， 再用显微镜观察菌体的形态特征， 并从颜 说明书 6/24 页 9 CN 111285925 A 9 色判断属于革兰氏阳性菌还是阴性菌。 0105 革兰氏染色及镜检步骤： 0106 (1)制片： 在干净的载玻片上滴一滴生理盐水， 用接种环挑取单菌落与生理盐水混 合均匀后进行涂片， 涂抹成直径约为1cm的薄层； 0107 (2)固定： 将载玻片在酒精灯火焰。

37、上方快速来回通过一至两次进行加热固定； 0108 (3)染色： 在涂片区域上滴一滴草酸铵结晶紫， 染色1min后用无菌水小心冲洗； 0109 (4)媒染： 加路哥式碘液一滴， 作用1min后用无菌水冲洗， 用擦镜纸吸干； 0110 (5)脱色： 倾斜载玻片， 用滴管流加95乙醇进行脱色， 直至无紫色脱落， 再用无菌 水冲洗； 0111 (6)复染： 滴加0.5的番红染色一滴， 染色30s后， 水洗； 0112 (7)镜检： 用擦镜纸吸干水， 用油镜观察。 0113 (S62)： 生理生化鉴定 0114 (1)七叶苷水解实验 0115 有些细菌可以分解利用七叶苷产生七叶素， 七叶素能够与培养基中。

38、的二价铁离子 反应形成黑色的化合物。 用细菌微量生化反应管来进行本实验， 用接种环从平板上挑取已 纯化培养的同一菌落接种于七叶苷试验的生化管。 接种后静置于 37恒温箱中培养24h (用封口膜封口， 封口膜用75酒精擦拭灭菌)， 若出现黑色说明七叶苷被水解， 为阳性反 应， 否则为阴性反应。 0116 (2)淀粉分解实验 0117 将菌株从-80取出并在MRS固体培养基平板上划线活化， 用接种环挑取单菌落接 种于含有0.5淀粉的MRS液体培养基中， 静置于37恒温箱中培养24h。 然后向培养液中加 入几滴碘液摇匀， 观察是否变色。 若不变色表示淀粉完全水解， 为阳性反应， 如变成蓝色或 蓝紫色。

39、则表明淀粉未完全水解， 为阴性反应。 0118 (3)糖醇发酵实验 0119 该实验用各种糖的微量生化反应管来进行。 用接种环从平板上挑取单菌落接种于 葡萄糖微量生化反应管、 果糖微量生化反应管、 纤维二糖微量生化反应管、 麦芽糖微量生化 反应管、 蔗糖微量生化反应管、 蜜二糖微量生化反应管、 棉籽糖微量生化反应管、 乳糖微量 生化反应管、 甘露醇微量生化反应管和山梨醇微量生化反应管中， 静置于37恒温箱中培 养24h(用封口膜封口， 封口膜用75酒精擦拭灭菌)后观察结果。 若反应管显色为黄色则说 明产酸， 为阳性反应， 否则为阴性反应。 0120 (4)过氧化氢酶实验 0121 将菌株从-8。

40、0取出并在MRS固体培养基平板上划线活化， 置于37静置培养24h。 然后挑取单菌落涂抹在载玻片上， 在涂片区域上滴加几滴5的过氧化氢溶液。 若细菌可以 产生过氧化氢酶， 则过氧化氢被酶分解产生气泡， 为阳性反应， 否则为阴性反应。 0122 (5)硫化氢实验 0123 有些细菌能分解含硫的氨基酸如胱氨酸、 半胱氨酸等并产生硫化氢。 硫化氢能与 培养基中的铁盐反应， 生成黑色的硫化铁沉淀。 用接种环从平板上挑取单菌落接种于硫化 氢试验的微量生化反应管中， 静置于37恒温箱中培养24h(用封口膜封口， 封口膜用75 酒精擦拭灭菌)后观察结果， 若显出黑色为阳性反应， 否则为阴性反应。 说明书 7。

41、/24 页 10 CN 111285925 A 10 0124 (6)明胶水解实验 0125 该实验用于检测细菌是否可以产生明胶酶将明胶水解成多肽。 用微量生化反应管 来进行本实验。 用接种环从平板上挑取单菌落接种于明胶水解试验的微量生化反应管中， 静置于37恒温箱中培养24h(用封口膜封口， 封口膜用75酒精擦拭灭菌)， 观察明胶水解 情况。 0126 (7)细菌V-P实验 0127 该实验用于检测细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。 某些细菌能够分解葡萄糖最终产 生乙酰甲基甲醇。 在碱性条件下， 乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰， 进而与培养基中的精氨酸 等含胍基的物质结合形成红色化合物， 即V-P试验。

42、阳性。 用微量生化反应管来进行本实验， 用接种环从平板上挑取单菌落接种于微量生化反应管。 接种后静置于37恒温箱中培养 24h(用封口膜封口， 封口膜用75酒精擦拭灭菌)， 然后滴加VP甲液和乙液， 显出红色为阳 性反应， 否则为阴性反应。 0128 (S163)： 基于16S rDNA的分子生物学鉴定 0129 (1)乳酸菌基因组DNA的提取 0130 用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行细菌全基因组的提取。 实验开始前， 按 要求在PW Solution中加入相应量的异丙醇混合均匀， Wash Solution 中加入相应量的无 水乙醇混合均匀， 并在瓶身上做好标签， 在室温下密封。

43、保存。 使用前检查Buffer Digestion 是否出现沉淀， 如有则在56下溶解后使用。 0131 1)将保存在-80中的菌株取出于MRS固体培养基平板上划线活化， 待长出菌落后 挑取单菌落接种至10mL MRS液体培养基中并置于37恒温培养箱中培养24h； 0132 2)将培养后的菌液于漩涡振荡器上震荡使细菌充分混匀， 吸取1mL菌液于1.5mL EP管中， 在8000r/min离心1min， 弃上清。 加入180 L溶菌酶溶液 (使用前将相应的溶解酶加 入到Enzymatic lysis buffer中， 配置成20mg/mL的溶解酶溶液)重悬菌液， 并在37下水 浴一小时。 加入2。

44、0 L Proteinase K溶液， 震荡混匀。 56水浴30min直至细胞完全裂解； 0133 3)加入200 L Buffer BD， 充分颠倒混匀； 0134 4)加入200 L无水乙醇， 充分颠倒混匀； 0135 5)先将吸附柱放入收集管中， 用移液器将溶液全部吸取到吸附柱中， 并静置2min， 12000r/min离心1min， 倒掉收集管中废液； 0136 6)将吸附柱放回收集管中， 加入500 L PW Solution， 10000r/min离心30s， 倒掉收 集管中的滤液； 0137 7)将吸附柱放回收集管中， 加入500 L Wash Solution， 10000r/。

45、min离心 30s， 倒 掉收集管中的滤液。 0138 8)将吸附柱放回收集管中， 于12000r/min中离心2min， 离去残留的Wash Solution。 打开吸附柱的盖子在室温下放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残留的Wash Solution， 以免影响基因组DNA的产量和后续实验； 0139 9)取出吸附柱放入新的1.5mL EP管中， 加入100 L CE Buffer静置3min， 12000r/ min离心2min， 收集DNA溶液， 并于-20保存以备进一步实验。 0140 (2)琼脂糖凝胶电泳 0141 1)制胶： 称取0.2g琼脂糖， 加入40mL 1TAE溶液混合，。

46、 并加热40s至琼脂糖完全溶 说明书 8/24 页 11 CN 111285925 A 11 解， 室温下冷却至60左右加入1uL溴化乙锭充分混匀， 倒入制胶槽中插入梳子， 待其完全 冷却凝固， 小心将梳子拔出。 0142 2)上样： 将制好的胶放入电泳槽内， 使得槽中的1TAE溶液没过整块胶。 取1uL 10 Loading buffer在塑料薄膜上， 再取5uL提取好的DNA样品与 10Loading buffer混合 均匀， 将样品小心打入凝胶孔中， 再在边上的槽孔中加入 3uL 10000bp的DNA Marker。 上样 时小心枪头将胶戳破， 注意不要有气泡。 0143 3)电泳、 。

47、成像： 在80V恒压下电泳45min左右， 待蓝色条带跑至整块凝胶的三分之二 处即可结束电泳。 取出凝胶并在凝胶成像仪中拍照查看结果。 0144 (3)PCR扩增 0145 PCR扩增采用乳酸菌16S rDNA的通用引物101， 由生工生物工程(上海) 有限公 司合成。 0146 27F(5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 0147 1492R(5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ) 0148 PCR扩增反应体系如下表2所示： 0149 表2PCR扩增反应体系 0150 0151 表3PCR循环条件 0152 0153 PCR扩增后的产物使用SanPrep柱式。

48、DNA胶回收试剂盒进行回收， 乳酸菌16S rDNA 通用引物的合成以及PCR产物序列的测序都由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。 0154 (4)16S rDNA同源性分析及系统发育树的构建 0155 测序得到的序列提交到NCBI的GenBank数据库进行BLAST分析， 筛选与所测菌株 说明书 9/24 页 12 CN 111285925 A 12 16S rDNA序列同源性最高的菌株， 提取它们的序列并用生物信息学软件MEGA 6.0构建系统 发育树， 进行系统发育分析从而确定分离到的乳酸菌菌株的种属关系。 0156 (S17)： 结果分析 0157 产细菌素乳酸菌的分离及初筛 01。

49、58 以浙江省杭州市省妇幼保健医院初生婴儿的粪便为样品， 筛选得到能产生钙溶圈 的乳酸菌， 如图2所示。 挑选4株钙溶圈明显、 菌落形态单一的单菌落接种于MRS液体培养基 中， 分别编号为S1、 S2、 S3、 S4。 0159 通过牛津杯琼脂扩散法检测这4株乳酸菌对大肠杆菌DH5、 藤黄微球菌 10209等指 示菌的抑菌活性， 结果如表4所示。 经试验发现菌株S4的发酵上清液抑菌活性最强， 因此选 定其作为后续实验的优势菌株， 命名为ZFM54。 0160 表4乳酸菌发酵液对指示菌的抑菌作用 0161 0162 注： 牛津杯直径为8.0mm；“-” 表示无抑菌圈 0163 产细菌素乳酸菌的复。

50、筛 0164 经过初筛获得了一株具有较广泛抑菌谱的乳酸菌菌株ZFM54， 为了避免乳酸菌代 谢产生的一些有机酸、 过氧化氢等物质对抑菌效果产生的干扰， 确定是细菌素类物质发挥 的抑菌作用， 复筛实验对这些干扰因素做了逐一排除。 0165 排除有机酸对抑菌活性的干扰 0166 用1M氢氧化钠溶液将乳酸菌ZFM54发酵上清液的pH调至5.0， 用乳酸、 醋酸将未接 种的MRS液体培养基调节成pH5.0， 以未调pH的发酵上清液(pH3.78) 为对照进行抑菌活性 测试， 指示菌为藤黄微球菌10209， 结果如图3， 图3中的 1是ZFM54发酵上清液； 2是pH5.0的 发酵上清液； 3是pH5.。