血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911143651.5 (22)申请日 2019.11.20 (71)申请人 中山大学附属第一医院 地址 510062 广东省广州市越秀区中山二 路58号 (72)发明人 刘晨董吁钢赵静静何昕 张冲宇 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 段卉 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中 的应用 (57)摘要 本发明公开了血管生成素样蛋白7在心力衰 竭预后评估中。

2、的应用， 利用酶联免疫吸附测定法 检测心力衰竭患者的血清样本时， 当样本中血管 生成素样蛋白7的含量大于等于869pg/mL时， 患 者大概率预后不良， 即大概率会发生30天死亡和 90天死亡事件。 本发明利用血管生成素样蛋白7 作为心力衰竭预后评估的标志物， 可以通过检测 血清中ANGPTL7的浓度来判断心力衰竭患者的预 后情况。 利用此标志物对于心力衰竭患者的预后 情况进行预测， 简单易行， 结果准确， 对临床治疗 方案有的指导作用， 有很好的应用前进和价值， 值得大力推广和保护。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 CN 111122872 A 2020.05.08 CN 11112。

3、2872 A 1.血管生成素样蛋白7在作为心力衰竭预后评估的标志物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述心力衰竭为慢性心力衰竭急性加重期 和/或急性心力衰竭。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 酶联免疫吸附测定法检测血清中血管生成 素样蛋白7含量869pg/mL， 患者预后不良。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述患者预后不良为发生30天死亡和/或 90天死亡事件。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111122872 A 2 血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用 技术领域 0001 本发明涉及心脏病检测技术领域， 更具体地， 涉及血。

4、管生成素样蛋白7在心 力衰 竭预后评估中的应用。 背景技术 0002 心血管疾病是目前全球范围内死亡率最高的疾病， 严重威胁着人类的生命 健康。 有研究显示， 心血管疾病的死亡人数每年都在大幅度的增长。 心血管疾病 发病率高、 致死 率高， 并且随着人口老龄化、 生活环境恶化、 生活方式不健康化， 其带来的危害更是日益显 著。 各种心血管疾病如： 高血压病、 心肌梗死、 缺血性 心肌病、 心肌炎、 扩张型心肌病、 肥厚 型心肌病等发展的共同终点是心力衰竭。 心力衰竭为各种心脏结构或功能性疾病导致的 心室充盈和/或射血功能受损、 心 排出量下降不能满足机体代谢所需而引起的一组复杂的 临床综合征，。

5、 其主要的临 床表现是呼吸困难、 乏力(活动耐量下降)， 以及液体潴留(肺淤血 和外周水肿)。 心力衰竭是各种心血管疾病发展的严重和终末阶段， 各种基础的心脏疾病 不断进 展， 导致血流动力学负荷增加及心肌、 冠状动脉功能不全， 最终引发心力衰竭。 0003 心力衰竭的显著特点是高患病率、 高花费和高致死率。 2010年来自美国的 流行病 学统计资料显示， 在美国有超过580万的成年人患有心力衰竭， 进入老 年期后患病率有明 显的升高。 2003年我国开展的一项心力衰竭流行病学调查结 果也显示我国当时成年人中 有约400万心力衰竭患者。 心力衰竭一旦发生， 患 者甚至整个家庭就面临着长期治疗、。

6、 反复 住院、 多种药物及非药物治疗产生的高 额医疗费用， 带给社会和医疗卫生体系沉重的卫生 负担和经济负担。 心力衰竭的 死亡率高， 严重心力衰竭患者可因泵衰竭导致死亡， 并且可 因心律失常的发生率 升高而导致猝死。 据国外报道， 心力衰竭患者1年的全因死亡率达 30。 国内 也有研究数据显示， 重症心力衰竭患者在确诊后1年内全因死亡率超过20。 心力衰竭的高致死率， 与其诊断干扰多、 治疗难度高、 预后差异大密切相关。 0004 目前临床上主要以NYHA心功能分级、 左室射血分数、 B型利钠肽(BNP)、 氨基末端B 型利钠肽(NT-proBNP)等判断急性心力衰竭患者的预后。 然而， 在。

7、急性心力衰竭的治疗过 程中， 患者的上述指标可因心功能的改善而发生改变， BNP和NT-proBNP还会受到除心功能 外多种因素的影响， 上述指标并不能准 确的代表病情发展的阶段， 在一定程度上无法准确 指导疾病的治疗及预后判断。 因此， 寻找新的的心力衰竭预后评估手段， 对于制定合理有 效的干预策略具有重 要意义。 0005 血管生成素样蛋白家族(Angiopoietin-related proteins， ANGPTLs)包括了 与 血管生成素(ANG)家族成员具有相似结构的一组分泌蛋白， 目前共发现了A NGPTL1-8八个 家族成员。 它们在结构上共有N末端卷曲螺旋结构域和C末 端纤维。

8、蛋白原样结构域。 ANGPTLs蛋白不结合血管生成素细胞表面受体Tie-1 和Tie-2， 即不通过TIE酪氨酸激酶受 体通路进行信号传导， 提示其可能与AN G蛋白具有不同的生物学功能。 ANGPTLs通过整合相 关的信号传导参与多种生 理和病理过程， 包括介导脂质、 葡萄糖代谢、 血管生成、 癌症、 炎 症等过程。 ANGPTL3， ANGPTL4和ANGPTL6可直接参与调控脂质和葡萄糖等能量代 谢过程。 说明书 1/5 页 3 CN 111122872 A 3 ANGPTL2和ANGPTL6与肥胖症等代谢相关疾病和心血管疾病有关。 ANGPTL8可调节血清甘油 三酯水平。 ANGPTL。

9、4同时具有促血管生成和抗血 管生成作用。 ANGPTL3和ANGPTL6具有刺激 造血干细胞和促进血管生成的 活性。 卵巢癌、 肺癌等肿瘤中报道了ANGPTL2表达， 表明其可 能是癌症发展的 关键因素。 ANGPTL4被认为是肺癌和乳腺癌中癌症转移的预测因子。 最近 有 研究显示， ANGPTL6参与结肠直肠癌细胞在肝脏的定居。 现有技术并没有关 于ANGPTLs 家族成员与心血管疾病特别是心力衰竭发生发展的相关报道。 0006 目前缺乏一种能够准确代表心力衰竭病情发展的阶段， 并在一定程度上准确 指 导疾病的治疗及预后判断的标志物。 发明内容 0007 本发明的目的是为了克服现有技术缺乏一。

10、种能够准确代表心力衰竭病情发 展的 阶段， 并在一定程度上准确指导疾病的治疗及预后判断的标志物的不足， 提 供血管生成素 样蛋白7在急性心力衰竭预后评估中的应用。 0008 本发明的第一个目的是提供血管生成素样蛋白7在作为心力衰竭预后评估的 标 志物中的应用、 0009 本发明的第二个目的是提供一种心力衰竭预后评估试剂盒。 0010 为了实现上述目的， 本发明是通过以下技术方案予以实现的： 0011 血管生成素样蛋白7(Angiopoietin-related protein 7， ANGPTL7)是目前 探索 最少的ANGPTL家族成员， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 发明人 。

11、经过探索性的研究发 现， 当用利用酶联免疫吸附测定法检测心力衰竭患者的血清 样本时， 当样本中血管生成素 样蛋白7的含量大于等于869pg/mL时， 患者大概 率预后不良， 即大概率会发生30天死亡和 90天死亡事件。 0012 0013 因此， 本发明要求保护血管生成素样蛋白7在作为心力衰竭预后评估的标志 物中 的应用。 0014 优选地， 所述心力衰竭为慢性心力衰竭急性加重期和/或急性心力衰竭。 0015 优选地， 酶联免疫吸附测定法检测血清中血管生成素样蛋白7含量 869pg/mL， 患者预后不良。 0016 更优选地， 所述患者预后不良为发生30天死亡和/或90天死亡事件。 0017 。

12、与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0018 本发明利用血管生成素样蛋白7作为心力衰竭预后评估的标志物， 可以通 过检测 血清中ANGPTL7的浓度来判断心力衰竭患者的预后情况。 利用此标志 物对于心力衰竭患者 的预后情况进行预测， 简单易行， 结果准确， 对临床治疗方 案有的指导作用， 有很好的应用 说明书 2/5 页 4 CN 111122872 A 4 前进和价值， 值得大力推广和保护。 具体实施方式 0019 下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述， 所述实施例 只 用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。 下述实施例中所使用的试验方 法如无特殊 说明， 均。

13、为常规方法； 所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 为可 从商业途径得到的试剂 和材料。 0020 实施例1 0021 一、 实验方法 0022 (1)病人入组 0023 本研究选取2015年8月至2017年2月期间于中山大学附属第一医院心 血管医学部 住院治疗的心力衰竭患者。 每名患者均在入院当天由2名主治医师 或以上级别的心血管专 科医师确诊慢性心力衰竭急性加重期或急性心力衰竭(诊 断符合 2014年中国心力衰竭诊 断和治疗指南 )， 并进一步评估其是否满足入 选标准及排除标准， 依据排除标准剔除不符 合要求或临床资料不全的病人。 所有 试验对象均已详细地告知其研究目的、 研究内容、 。

14、研 究方法、 随访方式， 患 者及其家属自愿签署知情同意书后视为正式入组。 0024 心力衰竭的诊断： 0025 主要根据病史、 症状、 体征、 心电图、 心脏彩超、 胸部X线片、 实验室检 查、 生物学标 志物等证据。 了解既往的心脏疾病史， 了解有无夜间阵发性呼吸困 难、 端坐呼吸、 下肢水肿 等临床表现， 监测生命体征、 评估容量状态， 收集心脏 彩超提供的心脏扩大及收缩功能降 低、 胸部X线片提供的心脏扩大、 肺淤血、 肺水肿、 肺部疾病等信息， 检测NT-proBNP、 心肌损 伤标志物等标记物的水平， 都可为心力衰竭的诊断提供有效的证据。 0026 (2)标本采集 0027 所有入。

15、组患者均在入院后24小时内心力衰竭急性期抽取清晨空腹静脉血 5ml置 于一次性非抗凝无菌采血管中， 标本采集后摇匀置入4冰箱内静置2 小时自然凝固。 研究 者将血标本送至中山大学附属第一医院辅助循环实验室进行 离心处理(低速冷冻离心机， 参数设置为温度4， 转速2000转/分钟， 离心 时间10分钟)， 离心后取上层血清， 使用微量 移液器按200 l每管分装至EP 管中并标记， 最后将血清标本放入-80超低温冰箱保存， 3 至6个月内进行检 测。 0028 (3)血清ANGPTL7浓度检测 0029 使用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，。

16、 ELISA) 检测 心力衰竭组患者和对照组患者血清中ANGPTL7的浓度， 由研究者严格按 照试剂盒使用说明 书在中山大学附属第一医院辅助循环实验室进行操作。 具体步 骤如下： 0030 准备全部实验用试剂(-20保存)及待测样本(-80保存)， 提前60min 将其从冰 箱中取出， 缓慢复温至室温； 0031 配制标准液： 取1支冻干标准品重组人ANGPTL7， 加入1.0ml标准品稀 释液配成 5000pg/ml标准液， 轻轻混匀并在室温下静置10min溶解； 0032 配制构成标准曲线8个浓度梯度的标准液： 依次将5000pg/ml标准液成倍 稀释至7 个浓度梯度， 再加空白管构成标准。

17、曲线的8个浓度梯度； 1号EP管 加入500 l5000pg/ml的标 说明书 3/5 页 5 CN 111122872 A 5 准液， 2-8号EP管中分别提前加入250 l标准 品稀释液； 使用移液器从1号EP管吸出250 l液 体， 移至2号EP管充 分混匀后使用移液器从2号EP管吸出250 l液体， 移至3号EP管， 如此 反 复进行成倍稀释至7号EP管， 8号EP管中仅有250 l标准品稀释液， 为空白对照； 0033 加样： 在ELISA试剂盒的96孔酶标板中加入100 l不同浓度的标准液、 标准品稀释 液(空白)、 待测样本液， 每个标本设置2个复孔； 全部加样操作结 束后， 用。

18、封板胶纸覆盖酶 标板； 0034 第一次孵育： 酶标板置入震荡摇床上， 以50次/分钟的震荡速度在37中 孵育2小 时； 0035 配制实验用检测试剂A： 依据当次试验所需用量， 将检测试剂A与试剂A 稀释液按 1:100的比例稀释， 配成实验用检测试剂A， 备用； 0036 加实验用检测试剂A： 停止孵育， 并弃去96孔酶标板中的液体， 酶标板 各孔中加入 100 l实验用检测试剂A； 全部加样操作结束后， 用封板胶纸覆盖 酶标板； 0037 第二次孵育： 酶标板置入震荡摇床上， 以50次/分钟的震荡速度在37中 孵育1小 时； 0038 配制1洗涤液： 使用双蒸去离子水将25洗涤液稀释至1。

19、洗涤液， 备 用； 0039 洗涤： 停止孵育， 并弃去96孔酶标板中的液体， 在酶标板各孔中加入400ul 配置好 的1洗涤液， 轻轻晃动酶标板使得充分接触， 浸泡1-2分钟后， 弃去 酶标板内的洗涤液并 拍净洗涤液； 重复此洗涤过程； 共洗涤3次， 最后一次洗 涤后， 充分拍干酶标板内的液体； 0040 配制实验用检测试剂B： 依据当次试验所需用量， 将检测试剂B与试剂B 稀释液按 1:100的比例稀释， 配成实验用检测试剂B， 备用； 0041 加实验用检测试剂B： 在洗涤并充分拍干的96孔酶标板各孔中加入100 l实验用 检测试剂B； 全部加样操作结束后， 用封板胶纸覆盖酶标板； 00。

20、42 第三次孵育： 酶标板置入震荡摇床上， 以50次/分钟的震荡速度在37中 孵育1小 时； 0043 再次洗涤： 停止孵育， 并弃去96孔酶标板中的液体， 在酶标板各孔中加入 400ul配 置好的1洗涤液， 轻轻晃动酶标板使得充分接触， 浸泡1-2分钟后， 弃去酶标板内的洗涤 液并拍净洗涤液； 重复此洗涤过程； 共洗涤5次， 最后一 次洗涤后， 充分拍干酶标板内的液 体； 0044 显色： 在避光条件下， 迅速向洗涤并充分拍干的96孔酶标板各孔中加入90 l四甲 基联苯胺基质； 全部加样操作结束后， 用封板胶纸覆盖酶标板； 并置入 37恒温箱中避光 反应1530分钟； 0045 终止： 向显。

21、色后的96孔酶标板各孔中加入反应终止液50ul， 轻轻地晃动 酶标板使 得充分接触， 终止显色反应； 可看到96孔酶标板中呈蓝色的小孔迅速 变成黄色； 0046 检测样本吸光度值： 打开Tecan Sunrise光吸收酶标分析仪并连接电脑， 用 镜头 纸拭去酶标板底部的水渍后置入Sunrise光吸收酶标分析仪样本盒内， 设置 检测波长为 450nm， 开始检测各孔的吸光度值(OD值)； 0047 计算样本浓度： 通过标准液浓度(pg/ml)与相应的OD值画出标准曲线， 并得到回 归方程， 据此计算各血清样本的ANGPTL7浓度； 0048 将实验数据刻录至光盘中； 整理实验用品； 结束实验。 。

22、说明书 4/5 页 6 CN 111122872 A 6 0049 (4)统计学分析 0050 将所有心衰患者按照ANGPTL7三分位数分成三组(545pg/mL, 545-869pg/mL， 869pg/mL)。 通过卡方检验评估ANGPTL7与30天、 90天死 亡的关系。 通过构建多因素 Logistic回归模型校正潜在的混杂因素。 这些因素包 括年龄、 性别、 冠心病、 糖尿病、 心率、 收缩压、 左室射血分数、 肾小球滤过率、 NT-proBNP、 肌钙蛋白T。 0051 二、 实验结果 0052 结果如表1所示， 共有20为患者在出院30天内死亡， 共有37位患者在出 院90天死 。

23、亡。 ANGPTL7低、 中、 高三分位组30天粗死亡率分别为4.6、 14.6、 22.9(p0.035)， 90 天粗死亡率分别为15.2、 25.0、 37.5(p0.047)。 在 校正多种混杂变量后， 高 ANGPTL7三分位组与更高的30天死亡率(OR 8.52, 95CI 1.45-50.17,p0.018)、 90天死 亡率(OR 8.52,95CI 1.45-50.17,p0.018) 相关。 以上结果说明ANGPTL7有独立的预测 急性心衰预后的价值。 0053 表1： 0054 0055 *多因素Logistic回归模型校正了年龄、 性别、 左室射血分数、 收缩压、 心 。

24、率、 糖尿 病、 冠心病、 高血压、 肌钙蛋白T、 NT-proBNP、 肾小球滤过率。 0056 OR比值比； CI置信区间。 说明书 5/5 页 7 CN 111122872 A 7 序列表 中山大学附属第一医院 血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 2 346 PRT Homo sapiens 2 Met Leu Lys Lys Pro Leu Ser Ala Val Thr Trp Leu Cys Ile Phe Ile 1 5 10 15 Val Ala Phe Val Ser His Pro Ala Trp Leu Gln。

25、 Lys Leu Ser Lys His 20 25 30 Lys Thr Pro Ala Gln Pro Gln Leu Lys Ala Ala Asn Cys Cys Glu Glu 35 40 45 Val Lys Glu Leu Lys Ala Gln Val Ala Asn Leu Ser Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Arg Asp Trp Val Ser Val Val Met Gln 65 70 75 80 Val Met Glu Leu Glu Ser Asn Ser Lys Arg Met Glu 。

26、Ser Arg Leu Thr 85 90 95 Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Ser Glu Met Asn Asn Gln Ile Asp Ile Met 100 105 110 Gln Leu Gln Ala Ala Gln Thr Val Thr Gln Thr Ser Ala Asp Ala Ile 115 120 125 Tyr Asp Cys Ser Ser Leu Tyr Gln Lys Asn Tyr Arg Ile Ser Gly Val 130 135 140 Tyr Lys Leu Pro Pro Asp Asp Phe Leu Gly Ser Pro。

27、 Glu Leu Glu Val 145 150 155 160 Phe Cys Asp Met Glu Thr Ser Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg 165 170 175 Arg Lys Ser Gly Leu Val Ser Phe Tyr Arg Asp Trp Lys Gln Tyr Lys 180 185 190 Gln Gly Phe Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Trp Leu Gly Asn Glu His 195 200 205 Ile His Arg Leu Ser Arg Gln Pro Thr Arg。

28、 Leu Arg Val Glu Met Glu 210 215 220 序列表 1/2 页 8 CN 111122872 A 8 Asp Trp Glu Gly Asn Leu Arg Tyr Ala Glu Tyr Ser His Phe Val Leu 225 230 235 240 Gly Asn Glu Leu Asn Ser Tyr Arg Leu Phe Leu Gly Asn Tyr Thr Gly 245 250 255 Asn Val Gly Asn Asp Ala Leu Gln Tyr His Asn Asn Thr Ala Phe Ser 260 265 270 Th。

29、r Lys Asp Lys Asp Asn Asp Asn Cys Leu Asp Lys Cys Ala Gln Leu 275 280 285 Arg Lys Gly Gly Tyr Trp Tyr Asn Cys Cys Thr Asp Ser Asn Leu Asn 290 295 300 Gly Val Tyr Tyr Arg Leu Gly Glu His Asn Lys His Leu Asp Gly Ile 305 310 315 320 Thr Trp Tyr Gly Trp His Gly Ser Thr Tyr Ser Leu Lys Arg Val Glu 325 330 335 Met Lys Ile Arg Pro Glu Asp Phe Lys Pro 340 345 序列表 2/2 页 9 CN 111122872 A 9 。