桂枝茯苓胶囊的检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911349655.9 (22)申请日 2019.12.24 (71)申请人 江苏康缘药业股份有限公司 地址 222047 江苏省连云港市经济技术开 发区江宁工业城 (72)发明人 肖伟张探张弟谭维周军 王振中 (74)专利代理机构 北京律和信知识产权代理事 务所(普通合伙) 11446 代理人 姚志远王月春 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/32(。

2、2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种桂枝茯苓胶囊的检测方 法， 包括如下步骤： 取桂枝茯苓胶囊供试品和对 照品进行检测， 该检测的色谱条件为： 色谱柱选 自规格为3.050mm、 1.8m的AgilentEclipse PlusC18； 流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为 1mM甲酸水； 流速为0.20.4mL/min； 柱温为35 45； 根据检测结果， 获得桂枝茯苓胶囊的成分 信息或含量信息。 本发明提出的分析方法可以通 过一次正离子和负离子检测快。

3、速、 准确地完成对 桂枝茯苓胶囊中多个有效成分的分析。 权利要求书2页 说明书14页 附图10页 CN 111122728 A 2020.05.08 CN 111122728 A 1.一种桂枝茯苓胶囊的检测方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 取桂枝茯苓胶囊供试品和对照品进行检测， 该检测的色谱条件为： 色谱柱选自规格为 3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse Plus C18； 流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM 甲酸水； 流速为0.20.4mL/min； 柱温为3545； 梯度洗脱条件如下： 正离子色谱洗脱条件 负离子色谱洗脱条件 根据检测结果， 获得桂枝。

4、茯苓胶囊的成分信息或含量信息。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述供试品的制备为， 称取桂枝茯苓 胶囊0.2g， 用甲醇溶液20mL超声提取30min， 在3000rpm下离心10min， 取上清并经0.2 m滤膜 过滤后进样分析。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述流速为0.3mL/min， 柱温为40。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述对照品选自丹皮酚、 桂皮醛、 茯苓 酸、 桂皮酸、 苦杏仁苷、 芍药苷、 苯甲酸、 芍药苷内酯、 去氢土莫酸、 氧化芍药苷、 苯甲酰芍药 苷、 苯甲酰氧化芍药苷中的一种或多种。 5.一种桂枝茯苓胶。

5、囊化学成分分析方法， 其特征在于， 用LC/MS/MS对桂枝茯苓胶囊进 行分析， 其中， 该方法包括采用权利要求1所述的色谱条件和如下的质谱条件： 质谱条件： 选用电喷雾离子源， 正离子源参数： 喷雾电压4500V， 辅助气N2150 Arb， 辅助 气N2260 Arb， 辅助气加热温度500， 气帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重离子 反应监测； 负离子源参数： 喷雾电压-4500V， 辅助气1N250 Arb， 辅助气2N260 Arb， 辅助气加 热温度500； 气帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重离子反应监测。 6.一种桂枝茯苓胶囊的生。

6、物分析方法， 其特征在于， 该方法包括， 用LC/MS/MS对处理后 的桂枝茯苓胶囊血浆样品和标准血浆样品进行检测， 该方法该方法包括采用权利要求1所 述的色谱条件和如下的质谱条件： 质谱条件： 选用电喷雾离子源， 正离子源参数： 喷雾电压4500V， 辅助气N2150 Arb， 辅助 气N2260 Arb， 辅助气加热温度500， 气帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重离子 权利要求书 1/2 页 2 CN 111122728 A 2 反应监测； 负离子源参数： 喷雾电压-4500V， 辅助气1N250 Arb， 辅助气2N260 Arb， 辅助气加 热温度500； 气。

7、帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重离子反应监测； 根据检测结果， 获得桂枝茯苓胶囊的成分信息或含量信息。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述标准血浆样品为加入对照品的空 白血浆。 8.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述对照品选自丹皮酚、 桂皮醛、 茯苓 酸、 桂皮酸、 苦杏仁苷、 芍药苷、 苯甲酸、 芍药苷内酯、 去氢土莫酸、 氧化芍药苷、 苯甲酰芍药 苷、 苯甲酰氧化芍药苷中的一种或多种。 9.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述处理为： 取血浆样品， 加入内标溶 液， 沉淀蛋白， 振荡后离心， 取上清液； 该内标液选。

8、自甲苯磺丁脲。 10.根据权利要求6-9任一所述的检测方法， 其特征在于， 所述处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和/或标准血浆样品还包括内标物， 所述内标物 选自甲苯磺丁脲。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111122728 A 3 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及分析技术领域， 特别涉及一种桂枝茯苓胶囊的检测方法。 背景技术 0002 桂枝茯苓胶囊处方源于汉代张仲景的经典名方 金匮要略 桂枝茯苓丸， 有着两千 余年的临床用药历史， 是历代医家治疗妇科疾病的良方。 桂枝茯苓胶囊是在桂枝茯苓丸基 础上经过工艺改进、 质量标准提高、 药理毒理及临床研究研制而成的， 具有活。

9、血化瘀、 缓消 癥块之功效， 主要用于治疗妇科原发性痛经、 子宫肌瘤、 慢性盆腔炎包块、 子宫内膜异位症、 卵巢囊肿等。 桂枝茯苓胶囊于2006年11月通过美国FDA IND审查， 2007年4月在美国启动 期临床试验研究， 现已基本完成b期临床试验。 0003 虽然桂枝茯苓胶囊在临床应用中表现出较好的疗效， 现已对桂枝茯苓胶囊的物质 基础及作用机制、 生产工艺、 质量控制及临床应用等进行了一系列研究工作， 但仍有许多工 作尚需深入开展。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明旨在结合采用LC/MS/MS技术建立一种获得桂枝茯苓胶囊成分信 息或含量信息的方法。 0005 本发明提出了一种桂枝茯。

10、苓胶囊的检测方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 0006 取桂枝茯苓胶囊供试品和对照品进行检测， 该检测的色谱条件为： 色谱柱选自规 格为3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse Plus C18； 流动相中的B相为1mM甲酸的甲醇、 A 相为1mM甲酸水； 流速为0.20.4mL/min； 柱温为3545； 梯度洗脱条件如下： 0007 正离子色谱洗脱条件 0008 0009 负离子色谱洗脱条件 说明书 1/14 页 4 CN 111122728 A 4 0010 0011 根据检测结果， 获得桂枝茯苓胶囊的成分信息或含量信息。 0012 本发明另一具体实施方式中， 所。

11、述供试品的制备为： 称取桂枝茯苓胶囊0.2g， 用甲 醇溶液20mL超声提取30min， 在3000rpm下离心10min， 取上清并经0.2 m滤膜过滤后进样分 析。 0013 本发明另一具体实施方式中， 所述流速为0.3mL/min， 柱温为40。 0014 本发明另一具体实施方式中， 所述对照品选自丹皮酚、 桂皮醛、 茯苓酸、 桂皮酸、 苦 杏仁苷、 芍药苷、 苯甲酸、 芍药苷内酯、 去氢土莫酸、 氧化芍药苷、 苯甲酰芍药苷、 苯甲酰氧化 芍药苷中的一种或多种。 0015 所述对照品溶液的制备包括： 将各对照品置于容量瓶中， 加入甲醇稀释至刻度， 超 声使其溶解后， 配制成一定浓度如1.。

12、0mg/mL的储备液， 然后用50甲醇梯度稀释得到一系 列的对照品溶液。 0016 前述方法中， 含量信息可利用前述检测条件建立一种或多种对照品的标准曲线， 从而根据供试品检测结果计算有效成分的含量。 0017 本发明另一具体实施方式中， 所述桂枝茯苓胶囊供试品和对照品可选地包括内标 物， 所述内标物可选地为甲苯磺丁脲。 0018 本发明还提出了一种桂枝茯苓胶囊化学成分分析方法， 其特征在于， 用LC/MS/MS 对桂枝茯苓胶囊进行分析， 其中， 色谱条件和质谱条件分别为： 0019 色谱条件： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse Plus C18； 。

13、流 动相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.20.4mL/min； 柱温为3545； 梯度洗脱条件如下： 0020 正离子色谱洗脱条件 0021 0022 负离子色谱洗脱条件 说明书 2/14 页 5 CN 111122728 A 5 0023 0024 质谱条件： 选用电喷雾离子源， 正离子源参数： 喷雾电压4500V， 辅助气N2150 Arb， 辅助气N2260 Arb， 辅助气加热温度500， 气帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重 离子反应监测； 负离子源参数： 喷雾电压-4500V， 辅助气1N250 Arb， 辅助气2N260 Arb。

14、， 辅助 气加热温度500； 气帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重离子反应监测。 0025 利用该化学成分分析方法不仅可以迅速分离桂枝茯苓胶囊化学成分中各主要化 学成分， 还可获得桂枝茯苓胶囊化学成分中各主要化学成分的具体信息。 0026 本发明另一具体实施方式中， 所述流速为0.3mL/min， 柱温为40。 0027 本发明还提出了一种桂枝茯苓胶囊的生物分析方法， 其特征在于， 该方法包括， 用 LC/MS/MS对取处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和标准血浆样品进行检测， 该方法的色谱条 件： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse。

15、 Plus C18； 流动相中的B相为 1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.20.4mL/min； 柱温为3545； 梯度洗脱条件如 下： 0028 正离子色谱洗脱条件 0029 0030 负离子色谱洗脱条件 0031 0032 质谱条件： 选用电喷雾离子源， 正离子源参数： 喷雾电压4500V， 辅助气N2150 Arb， 辅助气N2260 Arb， 辅助气加热温度500， 气帘气35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重 离子反应监测； 负离子源参数： 喷雾电压-4500V， 辅助气1N250 Arb， 辅助气2N260 Arb， 辅助 气加热温度500； 气帘气。

16、35Arb， 碰撞气N2Medium， 扫描方式为多重离子反应监测根据检测 说明书 3/14 页 6 CN 111122728 A 6 结果， 获得桂枝茯苓胶囊在体内的成分信息或含量信息； 0033 根据检测结果， 获得桂枝茯苓胶囊在体内的成分信息或含量信息。 0034 本发明一具体实施方式中， 所述标准血浆样品为加入对照品的空白血浆。 0035 本发明一具体实施方式中， 所述桂枝茯苓胶囊血浆样品为给药后一定时间内所取 得的血浆。 0036 本发明另一具体实施方式中， 所述对照品选自丹皮酚、 桂皮醛、 茯苓酸、 桂皮酸、 苦 杏仁苷、 芍药苷、 苯甲酸、 芍药苷内酯、 去氢土莫酸、 氧化芍药苷。

17、、 苯甲酰芍药苷、 苯甲酰氧化 芍药苷中的一种或多种。 0037 本发明另一具体实施方式中， 所述对照品选自去氢土莫酸、 桂皮酸、 苦杏仁苷、 芍 药苷、 苯甲酸、 氧化芍药苷、 芍药内酯苷和丹皮酚； 同时， 可根据各对照品得到各自的标准曲 线， 并通过标准曲线计算血浆样品中具体成分的含量， 从而开展指标性成分/活性成分的药 动学研究。 0038 本发明另一实施方式中， 所述处理为： 取血浆样品， 加入内标溶液， 沉淀蛋白， 振荡 后离心， 取上清液； 该内标液选自甲苯磺丁脲。 0039 本发明另一实施方式中， 所述处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和/或标准血浆样 品还包括内标物， 所述内标物可选。

18、地为甲苯磺丁脲。 0040 本发明检测的目标成分包括正离子源(丹皮酚、 桂皮醛)和负离子源(茯苓酸、 桂皮 酸、 苦杏仁苷、 芍药苷、 苯甲酸、 芍药苷内酯、 去氢土莫酸、 氧化芍药苷、 苯甲酰芍药苷、 苯甲 酰氧化芍药苷)， 本发明通过筛选得到的分析方法可以通过一次正离子和负离子检测快速、 准确地完成对桂枝茯苓胶囊中多个有效成分的分析。 而且， 本发明选择了合适的样品处理 方式， 以及合适的对照品以及内标物， 能快速、 准确地检测桂枝茯苓胶囊给药后血浆样品的 主要有效成分的含量， 而且选择了多达8个指标作为标性成分/活性成分的研究对象， 更为 准确地反映了桂枝茯苓胶囊在体内的药动学特征。 上。

19、述方法的精密度、 准确度及回收率等 均良好， 满足样品的检测要求， 因而可应用于制剂的质量评价。 附图说明 0041 图1为本发明正离子色谱条件1的色谱图； 0042 图2为本发明正离子色谱条件1的色谱图； 0043 图3为本发明正离子色谱条件1的色谱图； 0044 图4为本发明正离子色谱条件1的色谱图； 0045 图5为本发明正离子色谱条件1的色谱图； 0046 图6为本发明正离子色谱条件1的色谱图； 0047 图7为本发明丹皮酚的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶液和 IS的样品； 0048 图8为本发明桂皮醛的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的。

20、样品； C： 加入标准溶液和 IS的样品； 0049 图9为本发明桂皮酸的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶液和 IS的样品； 0050 图10为本发明茯苓酸的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶液和 说明书 4/14 页 7 CN 111122728 A 7 IS的样品； 0051 图11为本发明苦杏仁苷的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶液 和IS的样品； 0052 图12为本发明芍药苷的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶液和 IS的样品； 0053 图13。

21、为本发明苯甲酸的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶液和 IS的样品； 0054 图14为本发明芍药内酯苷的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶 液和IS的样品； 0055 图15为本发明去氢土莫酸的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶 液和IS的样品； 0056 图16为本发明氧化芍药苷的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准溶 液和IS的样品； 0057 图17为本发明苯甲酰芍药苷的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入标准 溶液和IS的样品；。

22、 0058 图18为本发明苯甲酰氧化芍药苷的色谱图： A： 空白样品； B： 加入IS的样品； C： 加入 标准溶液和IS的样品； 0059 图19为本发明雌性SD大鼠灌胃给予0.5g/kg桂枝茯苓胶囊后的时间-血药浓度曲 线； 0060 图20为本发明雌性SD大鼠灌胃给予1.5g/kg桂枝茯苓胶囊后的时间-血药浓度曲 线； 0061 图21为本发明雌性SD大鼠灌胃给予3g/kg桂枝茯苓胶囊后的时间-血药浓度曲线。 具体实施方式 0062 以下结合实施例， 对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明， 以便能够更好 地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。 然而， 以下描述的具体实施方式和实施例。

23、仅 是说明的目的， 而不是对本发明的限制。 0063 其次， 需要注意的是， 本发明所涉及的未注明的浓度均为体积百分含量(v/v)。 其 它除非另外说明， 否则所有的百分数、 比率、 比例或份数按重量计。 另， 本发明如未注明具体 条件者， 均按照常规条件或制造商建议的条件进行， 所用原料药或辅料， 以及所用试剂或仪 器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 0064 除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。 0065 实施例1生物样品中桂枝茯苓胶囊的相关物质的浓度测定方法。

24、 0066 1、 实验材料 0067 1.1标准品及试剂 0068 标准品： 桂皮酸(中检院)； 桂皮醛(中检院)； 丹皮酚(中检院)； 苦杏仁苷(中检院)； 芍药苷(中检院)； 苯甲酸(中检院)； 茯苓酸(成都曼思特生物科技有限公司)； 芍药内酯苷 (成都曼思特生物科技有限公司)； 苯甲酰芍药苷(成都曼思特生物科技有限公司)； 氧化芍 说明书 5/14 页 8 CN 111122728 A 8 药苷(成都曼思特生物科技有限公司)； 去氢土莫酸(天津万象恒远科技有限公司)； 苯甲酰 氧化芍药苷(江苏康缘药业股份有限公司)。 0069 试剂： IS甲苯磺丁脲(sigma)HPLC级乙腈(默克)；。

25、 HPLC级甲醇(默克)； MS级甲酸(默 克) 0070 1.2仪器 0071 AB API5500质谱仪， ESI离子源(美国AB公司)； -70超低温冰箱(海尔)； XW-80A型 微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)； Centrifuge 5424型高速离心机 (eppendorf)； Mettler AE 240型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) 0072 2、 实验方法 0073 2.1溶液的配制 0074 2.1.1标准工作液的配制 0075 标准品储备液： 分别精密称取丹皮酚、 桂皮醛、 茯苓酸、 桂皮酸、 苦杏仁苷、 芍药苷、 苯甲酸、 芍药苷内酯、 去氢土莫。

26、酸、 氧化芍药苷、 苯甲酰芍药苷、 苯甲酰氧化芍药苷5mg、 将其 置于5mL容量瓶中， 加入甲醇稀释至刻度， 超声使其溶解后， 配制成浓度为1.0mg/mL的储备 液。 0076 内标储备液(IS-SS)： 精密称取甲苯磺丁脲5mg、 将其置于5mL容量瓶中， 加入甲醇 稀释至刻度， 超声使其溶解后， 配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。 0077 标准品工作液： 用50甲醇梯度稀释， 配制成20、 10、 5、 2、 1、 0.4、 0.2、 0.08 g/mL的 一系列混合工作液。 0078 2.1.2内标(IS)溶液的配制 0079 取浓度为1mg/mL甲苯磺丁脲对照品溶液5 L， 。

27、加甲醇1000mL， 稀释成浓度为5ng/mL 的内标工作液。 0080 2.2生物样品前处理 0081 取大鼠血浆样品50 L， 加入150 L的内标溶液， 沉淀蛋白， 充分振荡5min， 13000rpm 离心10min后， 取上清液进样分析。 0082 2.3分析条件 0083 2.3.1色谱条件筛选 0084 正离子色谱条件1： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent SB C18； 流动 相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.3mL/min； 柱温为40。 梯度洗脱条件 如下： 0085 正离子色谱洗脱条件 0086 0087 得到的图谱。

28、如图1所示， 由图1可知： 该梯度洗脱下丹皮酚和桂皮醛峰形太差和保 说明书 6/14 页 9 CN 111122728 A 9 留时间太短均达不到分析要求。 0088 正离子色谱条件2： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse Plus C18； 流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.3mL/min； 柱温为40。 梯度 洗脱条件如下： 0089 正离子色谱洗脱条件 0090 0091 得到的图谱如图2所示， 由图2可知： 更换色谱柱和更改梯度洗脱下丹皮酚和桂皮 醛峰形有拖尾和保留时间拖后， 均达不到分析要求。 0092 正离子。

29、色谱条件3： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse Plus C18； 流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.3mL/min； 柱温为40。 梯度 洗脱条件如下： 0093 正离子色谱洗脱条件 0094 0095 得到的图谱如图3所示， 由图3可知： 更改梯度洗脱下丹皮酚和桂皮醛峰形和保留 时间均达到分析要求。 0096 负离子色谱条件1： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent SB C18； 流动 相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.3mL/min； 柱温为40。 梯度洗脱条。

30、件 如下： 0097 负离子色谱洗脱条件 0098 0099 得到的图谱如图4所示， 由图4可知： 该梯度洗脱下只有内标甲苯磺丁脲峰形和保 说明书 7/14 页 10 CN 111122728 A 10 留时间达到分析要求； 其他成分峰形太差和保留时间太短均达不到分析要求。 0100 负离子色谱条件2： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent SB C18； 流动 相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.3mL/min； 柱温为40。 梯度洗脱条件 如下： 0101 负离子色谱洗脱条件 0102 0103 0104 得到的图谱如图5所示， 由图5可知。

31、： 更改流动相浓度梯度使待测物的保留时间处 于一个合适的时间， 但是待测化合物的分型均出现不同程度的前拖尾现象， 均不符合分析 要求。 0105 负离子色谱条件3： 色谱柱选自规格为3.050mm、 1.8 m的Agilent Eclipse Plus C18； 流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、 A相为1mM甲酸水； 流速为0.3mL/min； 柱温为40。 梯度 洗脱条件如下： 0106 负离子色谱洗脱条件 0107 0108 得到的图谱如图6所示， 由图6可知： 更改色谱柱后待测物的峰形较色谱条件2有很 大改善， 待测物的峰形和保留时间均符合分析要求。 0109 根据前述筛选过程， 本发明。

32、优选的色谱条件如下： 0110 色谱柱： Agilent Eclipse Plus C18(3.050mm， 1.8 m)； 流动相： B相1mM甲酸甲 醇、 A相1mM甲酸水； 柱温： 40； 流速： 0.3mL/min； 进样量： 2 L； 梯度洗脱条件如表1、 2所示： 0111 表1正离子色谱洗脱条件 0112 说明书 8/14 页 11 CN 111122728 A 11 0113 表2负离子色谱洗脱条件 0114 0115 2.3.2质谱条件 0116 选用电喷雾离子源(ESI)， 正离子源参数： 喷雾电压(IonSpray Voltage/IS) 4500V； 辅助气1(Ion 。

33、Source Gas 1/GS 1， N2)50Arb； 辅助气2(Ion Source Gas 2/GS 2， N2)60Arb； 辅助气加热温度(Temperature/TEM)500； 气帘气(Curtain Gas/CUR)35Arb； 碰 撞气(Collision Gas/CAD， N2)Medium； 扫描方式为多重离子反应监测(MRM)； 所检测化合物 的离子对， 碰撞电压(Collision Energy/CE)和去簇电压(Declustering Potential/DP)见 表3。 负离子源参数： 喷雾电压(IonSpray Voltage/IS)-4500V； 辅助气1(。

34、Ion Source Gas 1/GS 1， N2)50Arb； 辅助气2(Ion Source Gas 2/GS 2， N2)60Arb； 辅助气加热温度 (Temperature/TEM)500； 气帘气(Curtain Gas/CUR)35Arb； 碰撞气(Collision Gas/CAD， N2)Medium； 扫描方式为多重离子反应监测(MRM)； 所检测化合物的离子对， 碰撞电压 (Collision Energy/CE)和去簇电压(Declustering Potential/DP)见表4。 0117 表3正离子化合物及IS质谱检测参数 0118 0119 表4负离子化合物及I。

35、S质谱检测参数 0120 0121 0122 2.4标准曲线 0123 取90 L空白SD大鼠血浆若干份， 分别依次加入10 L系列标准品工作液， 配制成系 说明书 9/14 页 12 CN 111122728 A 12 列标准SD大鼠血浆样品， 按本节 “2.2” 项下方法处理后进样分析。 以样品浓度为自变量， 样 品中待测分析物和IS的峰面积比值为因变量， 采用加权法(1/C)， 计算待测分析物在SD大鼠 血浆中的线性回归方程。 0124 2.4.2精密度和准确度 0125 取90 L空白SD大鼠血浆样品若干份， 按本节 “2.4.1” 项下方法配制待测化合物低 浓度(100ng/mL)、。

36、 中浓度(500ng/mL)、 高浓度(2000ng/mL)的质控样品， 每一浓度水平平行 制备6份， 根据随行血浆标准曲线， 计算每份血浆样品中待测化合物的测定浓度， 并计算低、 中、 高浓度质控样品的精密度与准确度。 0126 2.4.3基质效应考查 0127 空白生物样品按 “2.2” 所述的方法经MeOH处理后取上清， 加入150 L至2000、 500、 100ng/mL的50 L化合物标准溶液后进行LC/MS/MS分析。 同时， 分别用150 L含内标混合物的 甲醇溶液加入至2000、 500、 100ng/mL的50 L化合物标准溶液制成对照样品后进行LC/MS/MS 分析。 分。

37、析过程中化合物与内标所受的基质效应按下式计算而得： 0128 化合物的基质效应()(空白血浆处理后加入各化合物的色谱峰面积/对照溶 液样品化合物色谱峰面积)100 0129 2.4.4血样提取回收率 0130 分别取2000、 500、 100ng/mL三种不同浓度的标准血浆样品(50 L)， 加入150 L含IS 混合物的甲醇溶液。 按 “2.2” 方法进行样品前处理， 进行LC/MS/MS分析。 同时， 50 L空白血浆 样品按 “2.2” 所述的方法经甲醇沉淀处理后得到上清溶液， 用其加入至2000、 500、 100ng/mL 的50 L化合物标准溶液后进行LC/MS/MS分析。 血浆。

38、中化合物和IS的提取回收率按下式计算 而得： 0131 化合物提取回收率()血浆样品的各化合物的色谱峰面积/处理后的空白血浆 中加入化合物色谱峰面积100 0132 3、 实验结果 0133 3.1方法特异性考察 0134 在 “2.2” 条件下， 各化合物的色谱保留时间(tR)分别为： 丹皮酚2.20min； 桂皮醛 2.15min； 桂皮酸5.14min； 茯苓酸7.39min； 苦杏仁苷3.37min； 芍药苷3.85min； 苯甲酸 4.53min； 芍药苷内酯3.58min； 去氢土莫酸6.82min； 氧化芍药苷3.16min、 苯甲酰芍药苷 5.16min； 苯甲酰氧化芍药苷4.。

39、77min。 甲苯磺丁脲正负离子的色谱保留时间(tR)分别为 2.15min和5.40min。 在服药前的空白血样中未测到各化合物， 内源性物质对分析无明显干 扰(图7-图18)。 0135 3.2测定生物样品中各化合物浓度的线性回归方程 0136 测定生物样品中各化合物浓度的线性回归方程见表5， 结果表明上述各标准曲线 线性良好， 可用于定量分析。 0137 表5各化合物浓度的线性回归方程 说明书 10/14 页 13 CN 111122728 A 13 0138 0139 0140 3.3各化合物与IS的基质效应及血样前处理过程中的提取回收率 0141 分析过程中各化合物与IS所受的基质效。

40、应和血样处理过程中的提取回收率考察 结果见表6。 结果表明： 该方法可以用来检测血浆中的桂枝茯苓胶囊的有效成分。 0142 表6各化合物与IS的基质效应及血样前处理过程中的提取回收率 说明书 11/14 页 14 CN 111122728 A 14 0143 0144 0145 3.4准确性及精密度考查 0146 分析生物样品中各化合物浓度的准确性和精密度见表7。 0147 表7分析生物样品中各化合物浓度的准确性和精密度 说明书 12/14 页 15 CN 111122728 A 15 0148 0149 0150 实施例2桂枝茯苓胶囊SD大鼠药代动力学研究 0151 1、 实验材料 0152。

41、 1.1药物及试剂 0153 受试药物： 桂枝茯苓胶囊 0154 1.2动物 说明书 13/14 页 16 CN 111122728 A 16 0155 SD大鼠， 体质量(25020g)， 18只， 由南通大学提供， 动物合格证号： SCXK(苏) 2014-0001 0156 2、 SD大鼠体内的药代动力学研究 0157 2.1给药方案与样品采集 0158 18只SD大鼠， 雌性， 随机分成3组， 实验前一天禁食12h以上， 不禁水。 随机分成三个 实验组0.5mg/kg组、 1.5mg/kg组和3mg/kg组。 ， 灌胃体积为1mL/100g， 灌胃给药后， 分别于 5min、 15mi。

42、n、 30min、 1h、 2h、 4h、 8h、 12h、 24h取前肢静脉血0.2mL， EDTA抗凝， 冰浴放置， 4下 于2小时内3500rmin-1离心10min收集上层血浆， -70冰冻保存。 0159 2.2数据分析 0160 数据处理均由AB Sciex Multi Quant 2.1软件自动计算获得， 并采用DAS 3.2.8 药代动力学软件， 以非房室模型统计分析各给药条件下指标性成分的药代动力学参数 0161 3、 实验结果 0162 图19图21为雌性SD大鼠分别给药0.5、 1.5、 3g/kg后不同时间点的相关血药浓 度-时间曲线。 表13所列为利用DAS3.0程序。

43、进行非房室模型计算所得的给药后各化合物的 药动学参数。 结合大鼠给药桂枝茯苓胶囊后的体内物质暴露分析和血浆药动学研究结果可 知， 本发明的方法可以准确测得不同时间的桂枝茯苓胶囊有效成分的学药浓度， 可选择的 机体对给药桂枝茯苓胶囊暴露的药代markers包括： 去氢土莫酸、 桂皮酸、 苦杏仁苷、 芍药 苷、 苯甲酸、 氧化芍药苷、 芍药内酯苷和丹皮酚， 通过对这些成分进行药动学研究， 可以更准 确地反映药物的药动学特点， 为桂枝茯苓胶囊的深入研究和质量控制提供依据。 0163 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还。

44、可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 14/14 页 17 CN 111122728 A 17 图1 图2 说明书附图 1/10 页 18 CN 111122728 A 18 图3 图4 图5 说明书附图 2/10 页 19 CN 111122728 A 19 图6 图7 说明书附图 3/10 页 20 CN 111122728 A 20 图8 图9 说明书附图 4/10 页 21 CN 111122728 A 21 图10 图11 说明书附图 5/10 页 22 CN 111122728 A 22 图12 图13 说明书附图 6/10 页 23 CN 111122728 A 23 图14 图15 说明书附图 7/10 页 24 CN 111122728 A 24 图16 图17 说明书附图 8/10 页 25 CN 111122728 A 25 图18 图19 说明书附图 9/10 页 26 CN 111122728 A 26 图20 图21 说明书附图 10/10 页 27 CN 111122728 A 27 。