检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物及试剂盒.pdf

《检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物及试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物及试剂盒.pdf（7页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011173152.3 (22)申请日 2020.10.28 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖北路1号 (72)发明人 邱泓铨黄翠琴孙晓双郑灿阳 (74)专利代理机构 福州君诚知识产权代理有限 公司 35211 代理人 戴雨君 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 检测华南虎或蜱虫。

2、内巴贝丝虫的通用引物 及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测华南虎或蜱虫内巴 贝丝虫的通用引物及试剂盒， 包括两组引物Bab 1和Bab2以及Bab3和Bab4， 本发明设计的引 物， 可以增加快速筛检宿主华南虎以及蜱虫中巴 贝丝虫的准确性与阳性比例， 避免侦测出巴贝丝 虫姊妹属血液原虫Colpodella造成误判。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 CN 112251521 A 2021.01.22 CN 112251521 A 1.检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物， 其特征在于： 包括两组引物， 具体如下： 第一组引物: Bab-1: 5 -ATCTAAGGAAG。

3、GCAGCAGGC -3 Bab-2: 5 - GAAACGTCCTTGGCAAATGC -3 第二组引物: Bab-3: 5 - GTGACAAGAAATAACAATAC-3 Bab-4: 5 - ACTAAGGTTCAATAACCAAC -3 。 2.一种采用权利要求1所述的检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物的巢式PCR鉴 定方法， 其特征在于： 其包括以下步骤： 1） 以华南虎血液样品或蜱虫样品基因组DNA为模板， 以权利要求1中所述的Bab-1和 Bab-2为第一轮引物， 进行第一轮PCR； 2)以第一轮PCR产物DNA为模板， 以权利要求1中所述的Bab-3和Bab-4为第二轮引物。

4、， 进 行第二轮PCR； 3)取第二轮PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳鉴定； 4)将第二轮PCR产物进行序列测定； 5)根据NCBI数据库中记载的巴贝丝虫基因序列， 进行系统进化分析， 最终得出样品鉴 定结果。 3.根据权利要求2所述的巢式PCR鉴定方法， 其特征在于： 所述第一轮PCR的反应条件 为： 95预变性5 min， 95变性1 min， 56退火1 min， 72延伸30s， 进行35个循环， 最后 72延伸10 min； 所述第二轮PCR的反应条件为： 95预变性5 min， 95变性1 min， 56退火45s， 72 延伸1min， 进行35个循环， 最后72延伸10 min。。

5、 4.检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括权利要求1所 述通用引物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112251521 A 2 检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于寄生虫分子检测技术领域， 具体涉及检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的 通用引物及试剂盒。 背景技术 0002 福建省梅花山区有个全国独一无二的梅花山华南虎园 (中国虎园), 华南虎为濒 临绝种的保育类动物， 梅花山区虽含有广大的草地， 但也蕴含许多种类的蜱虫, 蜱虫可透 过叮咬宿主以传播病原, 譬如立克次体以及巴贝丝虫等, 也常造成宿主的死亡, 之前有 几个个案发现。

6、死亡的华南虎分离出来的血液中都含有巴贝丝虫以及立克次体的存在。 0003 目前侦测巴贝丝虫所使用的通用引物甚少, 目前为止只有巢式PCR所使用的两 组通用引物 (Bab-5和Bab-6与Bab-7和Bab-8)用以侦测巴贝丝虫18S rRNA, 但此组引物在 使用上有其缺点： 容易侦测出其姊妹属血液原虫Colpodella。 有鉴于此,开发用于检测巴贝 丝虫的通用引物并利用巢式PCR技术去检测华南虎血液中是否有此病原体存在或者检测携 带此病原的蜱虫是当务之急， 也是预防华南虎濒临绝种的方式之一， 并且可以做为之后蜱 虫流行病学调查的数据依据。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种检测华。

7、南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物及试剂盒， 增加快速筛检宿主华南虎以及蜱虫中巴贝丝虫的准确性与阳性比例， 避免侦测出巴贝丝虫 姊妹属血液原虫Colpodella造成误判。 0005 为了实现上述目的， 本发明采用的技术方案是： 检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物， 包括两组引物， 具体如下： 第一组引物: Bab-1: 5 -ATCTAAGGAAGGCAGCAGGC -3 Bab-2: 5 - GAAACGTCCTTGGCAAATGC -3 第二组引物: Bab-3: 5 - GTGACAAGAAATAACAATAC-3 Bab-4: 5 - ACTAAGGTTCAATAACCAAC -3 。。

8、 0006 采用本发明所述的检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物的巢式PCR鉴定方 法， 包括以下步骤： 1） 以华南虎血液样品或蜱虫样品基因组DNA为模板， 以权利要求1中所述的Bab-1和 Bab-2为第一轮引物， 进行第一轮PCR； 2)以第一轮PCR产物DNA为模板， 以权利要求1中所述的Bab-3和Bab-4为第二轮引物， 进 行第二轮PCR； 3)取第二轮PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳鉴定； 4)将第二轮PCR产物进行序列测定； 说明书 1/3 页 3 CN 112251521 A 3 5)根据NCBI数据库中记载的巴贝丝虫基因序列， 进行系统进化分析， 最终得出样品鉴 定结果。 。

9、0007 所述第一轮PCR的反应条件为： 95预变性5 min， 95变性1 min， 56退火1 min， 72延伸30s， 进行35个循环， 最后72延伸10 min； 所述第二轮PCR的反应条件为： 95预变性5 min， 95变性1 min， 56退火45s， 72 延伸1min， 进行35个循环， 最后72延伸10 min。 0008 检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的试剂盒， 包括本发明所述通用引物。 0009 本发明的技术思路在于： 由于利用巢式PCR技术去检测蜱虫中巴贝丝虫的存在仍 有伪阳性的缺点, 因此还需要搭配1)基因组上不同区域DNA片段的引物， 2)全基因组测序， 去再次确认。

10、有此病原才能真正证实其病原体的存在。 发明人根据美国国家卫生研究院NCBI 网站参考巴贝丝虫18S rRNA序列设计两组巴贝丝虫的通用引物以进行巢式PCR， 一轮反应： Bab-1: 5 -ATCTAAGGAAGGCAGCAGGC -3 ， Bab-2: 5 - GAAACGTCCTTGGCAAATGC -3 ； 二轮反 应： Bab-3:5 -GTGACAAGAAATAACAATAC-3 ， Bab-4: 5 - ACTAAGGTTCAATAACCAAC-3 ， 预计得 到392 bp的DNA产物片段， 再搭配原有的两组通用引物 (Bab-5和Bab-6与Bab-7和Bab-8)， 可以增加。

11、侦测到巴贝丝虫阳性条带的比例， 也可以减少不必要的测序时间， 对于快速筛检 有很大的帮助。 0010 发明人团队从福建梅花山区不同区域约一千多只蜱虫， 利用抽取蜱虫组织中DNA 的试剂盒进行DNA的抽取， 再利用本发明引物进行巢式PCR技术去检测蜱虫中巴贝丝虫的存 在， 并与已知的通用引物或是全基因组测序的方式去再次验证是否为真阳性， 以计算本发 明通用引物的准确率， 如果准确率达到九成以上, 则可以开发成为巴贝丝虫的检测试剂 盒。 0011 本发明具有以下优点： 1)对引物的GC比例进行优化: 从第一轮的反应中可以看出在引物部分: Bab-1有11个 GC， Bab-2有10个GC， 第二轮。

12、的反应中Bab-3有6个GC， Bab-4有7个GC ， GC值相近， 对于PCR 反应的低温退火步骤会比较容易将引物黏合到模板上, 扩增效率也相对提高。 0012 2) 在引物的尾端黏合进行优化: Bab-6 以及 Bab-7 这两只引物序列最后以AT 结尾， 以生物化学的角度看来， A-T 之间氢键键结是以两条氢键键结, 本发明的四条引物 皆是以 G-C 作为结尾, G-C之间是以三条氢键键结, 因此比现有的引物稳定， 在PCR黏合 步骤相对稳定许多, 可以相对提高PCR 扩增的效率。 附图说明 0013 图1为采用本发明引物进行巢式PCR鉴定的结果。 0014 图2为采用血液原虫Colp。

13、odella的引物进行巢式PCR鉴定的结果。 具体实施方式 0015 一、 样品来源: 蜱虫样品均来自梅花山华南虎繁育基地。 血液原虫Colpodella样品使用EDTA 抗凝管 低温保存。 蜱虫样品使用50 mL离心管4低温保存 二、 实验步骤: 说明书 2/3 页 4 CN 112251521 A 4 1. 蜱虫DNA提取 1.1用镊子小心地将蜱虫样品从离心管中取出， 置于玻璃平皿中， 用无水乙醇清洗浸泡 10分钟， 重复2次， 室温晾干。 剪取30 mg蜱虫样品放入1.5 mL 离心管中。 0016 1.2 加入200 L缓冲液GA， 充分振荡混匀。 0017 1.3 加入20 L Pr。

14、oteinase K溶液， 充分混匀。 56水浴， 过夜消化。 0018 1.4 加入200 L 缓冲液GB， 充分颠倒混匀， 70放置10分钟。 0019 1.5 加入200 L 无水乙醇， 充分振荡混匀15秒。 0020 1.6 将吸附柱置于收集管， 将所得溶液全部转移至吸附柱中， 12000 rpm离心1分 钟， 弃滤液。 0021 1.7 加入500 L缓冲液GD， 12000 rpm离心1分钟， 弃滤液。 0022 1.8 加入600 L漂洗液PW， 12000 rpm离心1分钟， 弃滤液。 0023 1.9 重复操作步骤1.8 1.10 12000 rpm空离2分钟， 室温放置5分。

15、钟以晾干吸附柱。 0024 1.11转移吸附柱至一个新的1.5 mL无菌离心管中。 0025 1.12滴加20 L洗脱缓冲液TE于吸附柱中央的滤膜上。 室温静置5分钟。 12000 rpm 离心2分钟， 洗脱DNA。 0026 缓冲液GA、 GB、 GD以及漂洗液PW、 洗脱缓冲液TE是来自抽取蜱虫组织中DNA的试剂 盒 1.2 巢式PCR扩增 采用以下引物进行巢式PCR扩增 一轮反应: Bab-1: 5 -ATCTAAGGAAGGCAGCAGGC -3 Bab-2: 5 - GAAACGTCCTTGGCAAATGC -3 二轮反应: Bab-3: 5 - GTGACAAGAAATAACAAT。

16、AC-3 Bab-4: 5 - ACTAAGGTTCAATAACCAAC -3 预计扩增的目的片段为392 bp， 扩增反应体系为50 L(含5 L模板， 引物正反各1 L, dNTP 2 L, 10 X Taq buffer 5 L, Taq DNA polymerase (5U/ L) 0.5 L， 最后补ddH2O 35.5 l)， PCR反应条件如下： 第一轮95预变性5 min， 95变性1 min， 56退火1 min， 72延伸30s， 进行35个循 环， 最后72延伸10 min。 0027 第二轮95预变性5 min， 95变性1 min， 56退火1 min， 72延伸1m。

17、in进行35 个循环， 最后72延伸10 min。 0028 设置不加模板以双蒸水代替的阴性对照。 将所得产物置于1%琼脂糖凝胶进行电 泳， 在紫外投射仪上观察并记录实验结果。 0029 三、 实验结果 我们设计好引物 (Bab 1-4)并提取三只蜱虫的DNA， 并且利用本发明的引物进行巢式 PCR， 结果显示这三只蜱虫可以做出目标大小一致的阳性条带 （如图1） , DNA经过生物公司 测序， 皆为巴贝丝虫， 反之， 利用血液原虫Colpodella的引物， 并以这三只蜱虫的DNA当模 板， 除了阳性对照组外， 是无法扩增出任何的条带 (见图2)。 说明书 3/3 页 5 CN 1122515。

18、21 A 5 序列表 龙岩学院 检测华南虎或蜱虫内巴贝丝虫的通用引物及试剂盒 2020 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 atctaaggaa ggcagcaggc 20 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 gaaacgtcct tggcaaatgc 20 3 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 gtgacaagaa ataacaatac 20 4 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 actaaggttc aataaccaac 20 序列表 1/1 页 6 CN 112251521 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 112251521 A 7 。