孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法及分离仪.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011271199.3 (22)申请日 2020.11.13 (71)申请人 王蕊 地址 277100 山东省枣庄市市中区龙山路 办事处惠工村八区9号楼1单元201室 (72)发明人 王蕊赵妍 (74)专利代理机构 济南市新图新夏天专利代理 事务所(普通合伙) 37330 代理人 张伟彦 (51)Int.Cl. C12N 5/073(2010.01) C12N 5/078(2010.01) (54)发明名称 一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化 方法及分离仪 (57)摘要 。

2、本发明涉及细胞生物学检测技术领域， 尤其 涉及一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化 的分离仪， 所述分离仪为离心式血细胞分离机， 采用该分离仪进行分离纯化的方法， 包括以下步 骤： S1、 采集孕1128周孕妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液 20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 离心后静 置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液， 加入 稀释的细胞悬液于分层液面上， 离心后吸取白膜 层， 并加入PBS离心清洗。 本发明从孕妇外周血中 分离纯化获得胎儿有核红细胞， 在此获取过程中 采用细胞分离液， 可有效清除红细胞、 血小板和 单核巨核细。

3、胞， 更好地富集白细胞和有核红细 胞， 有效地提高了分离有核红细胞的效率。 权利要求书1页 说明书3页 CN 112266893 A 2021.01.26 CN 112266893 A 1.一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化的分离仪， 其特征在于， 所述分离仪为离 心式血细胞分离机。 2.一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 采集孕11-28周孕妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 离心后静置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液， 加入稀释的细胞悬液于分层液。

4、面上， 离心后吸 取白膜层， 并加入PBS离心清洗； 其中， 制备细胞悬液的步骤如下： 取S1中采集的外周血， 离心后取细胞沉淀物， 并向细胞沉淀物中加入等体积的36 38的RPMI1640细胞培养液， RPMI1640细胞培养液中含有质量分数为10%的胎牛血清， 充分 混匀制得稀释的细胞悬液； S4、 弃上清液， 再次加入20mL的PBS， 离心吹散， 收集剩下的细胞， 并分选出胎儿有核红 细胞； S5、 对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定， 收集并确定符合标准的胎儿 有核红细胞。 3.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述S2中离心速率。

5、为1200rpm/min1600rpm/min， 离心时间为30min。 4.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述细胞分离液的组成为： 质量分数为9%的聚蔗糖2030份、 质量分数为33.9%的泛影葡胺 515份。 5.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述S3中吸取白膜层时的离心速率为1800rpm/min2100rpm/min， 离心时间为10min。 6.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述S3中在加入了PBS后的离心速率为1300rpm/min1600。

6、rpm/min， 离心时间为10min。 7.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述S3中白膜层与PBS的混比为2:1。 8.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述S4中离心速率为1700rpm/min2200rpm/min， 离心时间为10min。 9.根据权利要求2所述的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 其特征在于， 所述离心过程均于分离仪中进行。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112266893 A 2 一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法及分离仪 技术领域 0001 本发明涉及细胞。

7、生物学检测技术领域， 尤其涉及一种孕妇外周血胎儿有核红细胞 分离纯化方法及分离仪。 背景技术 0002 出生缺陷是指婴儿出生前发生的身体结构、 功能或代谢等方面异常的一种统称, 通常包括先天结构畸形、 染色体异常、 遗传代谢性疾病以及功能异常如盲、 聋和智力障碍 等。 出生缺陷是导致早期流产、 早产、 死胎、 围产儿死亡、 婴幼儿死亡的主要原因， 可导致儿 童长期患病、 寿命缩短、 甚至终身残疾。 因此产前筛查、 产前诊断对预防出生缺陷至关重要。 0003 胎儿有核红细胞拥有完整的遗传信息， 在孕早期， 胎儿有核红细胞在孕妇外周血 液中含量丰富， 且细胞生存周期短， 在婴儿分娩几天后基本消失；。

8、 且其有明显的形态学特 征， 具有一些细胞表面标记 （如CD71、 GPA、 CD147） 和一些胞内标记如胚胎或胎儿 （-） 血红 蛋白， 可以通过一些阳性抗体如CD71、 GPA、 胎儿血红蛋白等进行富集和识别。 因此相对于其 他循环于母血中的胎儿细胞， 有核红细胞一直以来被认为是产前诊断的首选靶细胞， 但其 在母血循环中数量极少， 影响其应用于产前诊断。 0004 因此我们提出了一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法。 发明内容 0005 本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点， 而提出的一种孕妇外周血胎儿 有核红细胞分离纯化方法及分离仪。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用。

9、了如下技术方案： 一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化的分离仪， 所述分离仪为离心式血细胞分离 机。 0007 一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 包括以下步骤： S1、 采集孕11-28周孕妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 离心后静置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液， 加入稀释的细胞悬液于分层液面上， 离心后吸 取白膜层， 并加入PBS离心清洗； 其中， 制备细胞悬液的步骤如下： 取S1中采集的外周血， 离心后取细胞沉淀物， 并向细胞沉淀物中加入等体积的36 38的RPMI1640细胞。

10、培养液， RPMI1640细胞培养液中含有质量分数为10%的胎牛血清， 充分 混匀制得稀释的细胞悬液； S4、 弃上清液， 再次加入20mL的PBS， 离心吹散， 收集剩下的细胞， 并分选出胎儿有核红 细胞； S5、 对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定， 收集并确定符合标准的胎儿 有核红细胞。 说明书 1/3 页 3 CN 112266893 A 3 0008 优选的， 所述S2中离心速率为1200rpm/min1600rpm/min， 离心时间为30min。 0009 优选的， 所述细胞分离液的组成为： 质量分数为9%的聚蔗糖2030份、 质量分数为 33.9%的泛影葡胺515份。。

11、 0010 优选的， 所述S3中吸取白膜层时的离心速率为1800rpm/min2100rpm/min， 离心 时间为10min。 0011 优选的， 所述S3中在加入了PBS后的离心速率为1300rpm/min1600rpm/min， 离心 时间为10min。 0012 优选的， 所述S3中白膜层与PBS的混比为2:1。 0013 优选的， 所述S4中离心速率为1700rpm/min2200rpm/min， 离心时间为10min。 0014 优选的， 所述离心过程均于分离仪中进行。 0015 本发明的有益效果是： 本发明从孕妇外周血中分离纯化获得胎儿有核红细胞， 在此获取过程中采用细胞分离 液。

12、， 可有效清除红细胞、 血小板和单核巨核细胞， 更好地富集白细胞和有核红细胞， 有效地 提高了分离有核红细胞的效率。 具体实施方式 0016 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显 然， 所描述的实 施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施 例。 0017 一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化的分离仪， 分离仪为离心式血细胞分离 机。 0018 一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法， 包括以下步骤： S1、 采集孕11-28周孕妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 以1500。

13、rpm/min的速率将其置 于分离仪内离心30min后静置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液 （细胞分离液的组成为： 质量分数为9%的聚蔗糖 25份、 质量分数为33.9%的泛影葡胺12份） ， 加入稀释的细胞悬液于分层液面上， 并将其置于 分离仪内以2000rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层， 并按2:1的混比加入PBS， 再以 1500rpm/min的速率离心10min进行清洗； 其中， 制备细胞悬液的步骤如下： 取S1中采集的外周血， 离心后取细胞沉淀物， 并向细胞沉淀物中加入等体积的37的 RPMI1640细胞培养液， RPMI1640细胞培养液中含有质量分数为10。

14、%的胎牛血清， 充分混匀制 得稀释的细胞悬液； S4、 弃上清液， 再次加入20mL的PBS， 并将该混合液置于分离仪内以2000rpm/min的速率 离心10min， 将细胞吹散， 收集剩下的细胞， 并分选出胎儿有核红细胞； S5、 对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定， 收集并确定符合标准的胎儿 有核红细胞。 0019 实施例一： S1、 采集孕11-28周孕妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 以1200rpm/min的速率将其置 说明书 2/3 页 4 CN 112266893 A 4 于分离。

15、仪内离心30min后静置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液， 加入稀释的细胞悬液于分层液面上， 并将其置 于分离仪内以1800rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层， 并按2:1的混比加入PBS， 再以 1300rpm/min的速率离心10min进行清洗； S4、 弃上清液， 再次加入20mL的PBS， 并将该混合液置于分离仪内以1700rpm/min的速率 离心10min， 将细胞吹散， 收集剩下的细胞， 并分选出胎儿有核红细胞； S5、 对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定， 收集并确定符合标准的胎儿 有核红细胞。 0020 实施例二： S1、 采集孕11-28周孕。

16、妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 以1500rpm/min的速率将其置 于分离仪内离心30min后静置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液， 加入稀释的细胞悬液于分层液面上， 并将其置 于分离仪内以2000rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层， 并按2:1的混比加入PBS， 再以 1500rpm/min的速率离心10min进行清洗； S4、 弃上清液， 再次加入20mL的PBS， 并将该混合液置于分离仪内以2000rpm/min的速率 离心10min， 将细胞吹散， 收集剩下的细胞， 并分。

17、选出胎儿有核红细胞； S5、 对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定， 收集并确定符合标准的胎儿 有核红细胞。 0021 实施例三： S1、 采集孕11-28周孕妇的外周血， 用10ml 1640培养基稀释， 摇匀备用； S2、 取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中， 以1600rpm/min的速率将其置 于分离仪内离心30min后静置； S3、 取离心管并在其中预置细胞分离液， 加入稀释的细胞悬液于分层液面上， 并将其置 于分离仪内以2100rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层， 并按2:1的混比加入PBS， 再以 1600rpm/min的速率离心10min进行清洗； S4、 弃上清液， 再次加入20mL的PBS， 并将该混合液置于分离仪内以2200rpm/min的速率 离心10min， 将细胞吹散， 收集剩下的细胞， 并分选出胎儿有核红细胞； S5、 对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定， 收集并确定符合标准的胎儿 有核红细胞。 0022 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说明书 3/3 页 5 CN 112266893 A 5 。