重组融合蛋白及其制备的预防PCV2病毒感染的疫苗.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011555542.7 (22)申请日 2020.12.25 (71)申请人 北京科牧丰生物制药有限公司 地址 102629 北京市大兴区中关村科技园 区大兴生物医药产业基地祥瑞大街25 号 申请人 兆丰华生物科技 (南京) 有限公司 兆丰华生物科技 (南京) 有限公司北 京生物医药科技中心 兆丰华生物科技 (福州) 有限公司 (72)发明人 汤波刘奇于萍萍徐慧敏 石磊卢晓楠刘飞吕帅阳 张静韩昱鹏王敏聂思静 刘运平 (74)专利代理机构 北京金蓄专利代理有限公司 11544。

2、 代理人 赵敏 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61K 47/68(2017.01) A61P 31/20(2006.01) (54)发明名称 一种重组融合蛋白及其制备的预防PCV2病 毒感染的疫苗 (57)摘要 本发明属于生物疫苗技术领域, 具体涉及一 种重组融合蛋白PigFCPCV2CapIL29, 并进一步 公开了表达该。

3、重组融合蛋白的重组CHO细胞株, 以及其制备的预防PCV2病毒感染的疫苗。 本发明 所述重组融合蛋白, 将猪免疫球蛋白Fc片段、 猪 圆环病毒2型Cap蛋白与具有免疫增强作用的白 细胞介素29蛋白通过Lingker序列连接获得, 与 现有PCV2Cap相比, 可有效克服在体内半衰期短 且原核表达产物免疫活性低缺陷, 其体内半衰期 更长、 免疫效果更好, 只需要1次免疫且抗原免疫 用量更少减少多次疫苗注射应激反应, 可用于制 备抗猪圆环病毒病疫苗。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图1页 CN 112266421 A 2021.01.26 CN 112266421 A 1.一种重组融合。

4、蛋白, 其特征在于, 所述重组融合蛋白为将猪免疫球蛋白Fc片段、 猪圆 环病毒2型Cap蛋白与白细胞介素-29蛋白通过Lingker序列连接获得的重组融合蛋白 PigFC-PCV2Cap-IL29, 包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白, 其特征在于, 在所述SEQ ID No.2所示的氨基 酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签: Poly-Arg、 Poly-His、 FLAG、 c- myc。 3.一种编码权利要求1或2所述重组融合蛋白的基因, 其特征在于, 包括如SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。 4.一种含有权利要求3。

5、所述重组融合蛋白的编码基因的表达载体、 细胞系或重组菌。 5.一种表达权利要求1或2所述重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29的重组CHO细胞株。 6.一种构建权利要求5所述重组CHO细胞株的方法, 其特征在于, 包括如下步骤: (1) 人工合成如SEQ ID No.1所示的PigFC-PCV2Cap-IL29基因序列; (2) 以Hind和EcoRI酶切所得PigFC-PCV2Cap-IL29基因序列和真核质粒载体序列, 回 收酶切后的PigFC-PCV2Cap-IL29和真核质粒载体, 经连接、 转化、 克隆PCR及测序验证, 构建 所需PigFC-PCV2Cap -IL29表达。

6、载体; (3) 将所述PigFC-PCV2Cap-IL29表达载体转染CHO细胞株, 通过培养、 单克隆筛选获得 高表达PigFC-PCV2Cap-IL29的细胞株CHO-PigFC-PCV2Cap-IL29-88; (4) 将所述CHO-PigFC-PCV2Cap-IL29-88细胞株进行扩大培养, 、 驯化, 能够完全悬浮无 血清培养, 即得。 7.一种预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 其特征在于, 包括权利要求1或2所 述的重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29和水性复合佐剂; 所述疫苗中, 控制所述重组融合 蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29的含量20 g。 8。

7、.根据权利要求7所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 其特征在于, 控 制所述重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29所占比例为80%-95%, 所述水性复合佐剂比例为 20%-5%。 9.根据权利要求7或8所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 其特征在于, 所述水性复合佐剂包含矿物油、 铝胶、 聚合物、 皂素、 CpG ODN、 -IFN、 角鲨烷、 VC、 Poly I: C、 MPL-A、 Tween-80、 Span-80、 免疫刺激剂中的至少两种的混合物。 10.根据权利要求9所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 其特征在于: 所述皂素包括Qui。

8、lA和/或QS21; 所述铝胶包括氢氧化铝和/或磷酸铝; 所述聚合物包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、 卡波姆和/或泊洛沙姆; 所述免疫刺激剂包括 -干扰素、 -干扰素、 -干扰素、 GM-CSF和/或IL-2。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112266421 A 2 一种重组融合蛋白及其制备的预防PCV2病毒感染的疫苗 技术领域 0001 本发明属于生物疫苗技术领域, 具体涉及一种重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap- IL29, 并进一步公开了表达该重组融合蛋白的重组CHO细胞株, 以及其制备的预防PCV2病毒 感染的疫苗。 背景技术 0002 猪圆环病毒 (Porcinecirc。

9、ovirus, PCV) 是迄今发现的最小的动物病毒之一, 感染 猪的免疫系统会被完全破坏, 丧失对其他疫苗的免疫应答能力, 导致免疫失败, 同时导致其 他病原体的继发感染, 所以猪圆环病毒又称为猪的 “艾滋病” 。 现已知PCV有两个血清型, 即 PCV1和PCV2, PCV1为非致病性的病毒, PCV2为致病性的病毒, 猪对PCV2具有较强的易感性。 PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、 皮炎与肾病综合征等相关疾病的首要致病因子, 给养 猪业造成巨大的经济损失。 我国在2000年首次报道了猪圆环病毒病, 至今PCV2已在我国猪 群中流行二十年。 大量的流行病学研究表明, 我国猪群中PCV2。

10、感染十分普遍, PCV2抗体阳性 率高达80%以上, 由猪圆环病毒引起的继发感染通常超过50%, 死亡率达到40%以上。 在2001- 2012年期间, 中国分离了258株PCV2株, 其中有242株序列均为PCV2b基因亚型, 约占比 93.8%, 证明我国近几年流行的毒株为PCV2b 亚型。 0003 目前, 防控猪圆环病毒2型 (PCV2) 病毒病的主要方法即是接种疫苗。 当前国内市场 上使用的猪圆环病毒2型疫苗主要是PCV2全病毒灭活疫苗、 PCV1-PCV2嵌和病毒灭活疫苗以 及杆状病毒表达PCV2基因工程疫苗或者大肠杆菌表达PCV2基因工程苗。 其中, 全病毒灭活 疫苗对机体刺激时。

11、间比较短, 需2次接种, 而且PCV2在细胞上增殖滴度低, 制备费用高; 基因 工程亚单位疫苗相对于其他疫苗, 疫苗抗体产生的更早, 抗体水平稳定, 能够有效阻止病毒 的复制, 保护力强。 国内注册的只有青岛易邦的大肠杆菌表达系统表达的基因工程亚单位 疫苗和武汉中博的昆虫杆状病毒表达系统的基因工程亚单位苗。 但是, 亚单位疫苗对佐剂 的要求比较高, 水佐剂疫苗虽然在市场上备受青睐, 但水佐剂控缓释效果不如油佐剂, 因 此, 改善水佐剂疫苗的缓释性能, 使疫苗在抗体的产生时间、 抗体水平和持续时间上大幅度 提升显得至关重要。 0004 白细胞介素-29 (interleukin-29, IL-2。

12、9) 是新近发现的干扰素- (interferon- , IFN- ) 家族的新成员, 它主要由成熟的树突状细胞和巨噬细胞产生。 IL-29作为干扰素家族 的成员之一, 近年来已被发现具有抗多种病毒活性、 抗肿瘤增值活性、 免疫调节等作用。 IL- 29能够诱导TLR3的表达提高宿主抗病毒活性, 同时IL-29能够诱导靶细胞产生促炎症因子 来激活天然免疫反应, 进而启动体液免疫反应。 研究还发现, IL-29能够上调巨噬细胞中IL- 6、 IL-8、 IL-10表达, 能够调节Th1和Th2的免疫应答。 本申请方案通过将IL-29与PCV2共表 达, 同时接种免疫集体, 一方面期待能够调剂集体。

13、免疫系统应答, 另一方面, 在期待主动免 疫未能彻底激活以前, 可以非特异性的激活集体抗病毒机制, 达到防病、 抗病的目的。 说明书 1/9 页 3 CN 112266421 A 3 发明内容 0005 为此, 本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap- IL29, 即将猪免疫球蛋白Fc片段、 筛选的猪圆环病毒2型Cap蛋白与具有免疫增强作用的白 细胞介素-29蛋白通过Lingker序列连接获得的融合蛋白; 本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于所述重组融合蛋白PigFC- PCV2Cap-IL29制备的预防猪圆环病毒病的疫苗。 0006 为解决上述技。

14、术问题, 本发明所述的一种重组融合蛋白, 所述重组融合蛋白为将 猪免疫球蛋白Fc片段、 猪圆环病毒2型Cap蛋白与白细胞介素-29蛋白通过Lingker序列连接 获得的重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29, 包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 0007 具体的, 所述的重组融合蛋白, 在所述SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端 或羧基末端连接上选自如下组的标签: Poly-Arg、 Poly-His、 FLAG、 c-myc。 0008 具体的, 所述的重组融合蛋白, 其氨基酸序列为SEQ ID NO.1; 在蛋白质的氨基酸 序列中经过取代和/或缺失和/或添。

15、加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC-PCV2Cap- IL29活性的蛋白质。 0009 本发明还公开了一种编码所述重组融合蛋白的基因, 包括如SEQ ID No.1所示的 核苷酸序列。 0010 本发明还公开了一种含有所述重组融合蛋白的编码基因的表达载体、 细胞系或重 组菌。 0011 本发明还公开了一种表达所述重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29的重组CHO细胞 株。 0012 本发明还公开了一种构建所述重组CHO细胞株的方法, 包括如下步骤: (1) 人工合成如SEQ ID No.1所示的PigFC-PCV2Cap-IL29基因序列; (2) 以Hind和EcoRI酶切所。

16、得PigFC-PCV2Cap-IL29基因序列和真核质粒载体序列, 回 收酶切后的PigFC-PCV2Cap-IL29和真核质粒载体, 经连接、 转化、 克隆PCR及测序验证, 构建 所需PigFC-PCV2Cap -IL29表达载体; (3) 将所述PigFC-PCV2Cap-IL29表达载体转染CHO细胞株, 通过培养、 单克隆筛选获得 高表达PigFC-PCV2Cap-IL29的细胞株CHO-PigFC-PCV2Cap-IL29-88; (4) 将所述CHO-PigFC-PCV2Cap-IL29-88细胞株进行扩大培养, 、 驯化, 能够完全悬浮无 血清培养, 即得。 0013 本发明还。

17、公开了一种预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 包括所述的重 组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29和水性复合佐剂; 所述疫苗中, 控制所述重组融合蛋白 PigFC-PCV2Cap-IL29的含量20 g。 0014 本发明所述亚单位疫苗用于对仔猪的免疫应答。 0015 具体的, 所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 控制所述重组融合蛋 白PigFC-PCV2Cap-IL29与所述水性复合佐剂的质量比为80-90: 10-20, 优选为将85份融合 蛋白抗原相与15份佐剂复合物相混合, 低速搅拌均匀, 即得到猪圆环病毒2型基因工程亚单 位疫苗。 0016 具体的, 所述的。

18、预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗, 所述水性复合佐剂包 含矿物油、 铝胶、 聚合物、 皂素、 CpG ODN、 -IFN、 角鲨烷、 VC、 Poly I:C、 MPL-A、 Tween-80、 说明书 2/9 页 4 CN 112266421 A 4 Span-80、 免疫刺激剂中的至少两种的混合物。 0017 具体的, 所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗: 所述皂素包括QuilA和/或QS21, 控制其用量为20-400 g, 优选为150 g; 所述铝胶包括氢氧化铝和/或磷酸铝; 所述聚合物包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、 卡波姆和/或泊洛沙姆; 所述免疫刺激剂包括 -。

19、干扰素、 -干扰素、 -干扰素、 GM-CSF和/或IL-2。 0018 本发明所述重组融合蛋白, 将猪免疫球蛋白Fc片段、 猪圆环病毒2型Cap蛋白与具 有免疫增强作用的白细胞介素-29蛋白通过Lingker序列连接获得。 由于IgG类的免疫球蛋 白是血液中最丰富的蛋白质, 它们的半衰期可高达21天, 而FC片段是IgG保持体内较长半衰 期的主要原因, 同时具有稳定蛋白的作用, 本发明将该猪FC片段和PCV2 Cap抗原蛋白融合, 其氨基酸序列从N端到C端依次包括猪FC片段、 柔性肽接头、 PCV2Cap抗原蛋白质和白细胞介 素IL-29, 与现有PCV2Cap相比, 可有效克服在体内半衰期。

20、短且原核表达产物免疫活性低缺 陷, 其体内半衰期更长、 免疫效果更好, 只需要1次免疫且抗原免疫用量更少减少多次疫苗 注射应激反应, 可用于制备抗猪圆环病毒病疫苗。 0019 本发明所述抗猪圆环病毒病疫苗基于所述重组融合蛋白PigFC-PCV2Cap-IL29制 得, 通过构建出重组CHO细胞株, 经过培养、 纯化、 乳化工艺制备成猪圆环病毒亚单位灭活疫 苗, 该疫苗能够诱导机体产生显著体液免疫和细胞免疫, 免疫原性良好, 可以高效的引起仔 猪的免疫应答, 有效预防猪圆环病毒的感染。 附图说明 0020 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解, 下面根据本发明的具体实施例并结合 附图, 对本发明。

21、作进一步详细的说明, 其中, 图1为含有PigFC-PCV2Cap-IL29的编码基因的DNA片段回收纯化结果; 图2为所述获得的阳性重组菌的PCR鉴定阳性克隆结果; 图3为所述重组融合蛋白动物免疫实验结果。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述, 给出的实施例仅为了阐 明本发明, 而不是为了限制本发明的范围。 下述实施例中的实验方法, 如无特殊说明, 均为 常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等, 如无特殊说明, 均可从商业途径得到。 0022 原始菌株以及载体: CHO细胞、 pcDNA3.1表达载体, 由本公司提供。 融合基因按鼠类 密码子偏好性。

22、合成, 由北京梓熙生物公司合成。 0023 酶类及其他生化试剂: 内切酶、 连接酶购自TaKaRa公司, 质粒提取试剂盒购自天跟 生物, 其它均为国产试剂。 0024 CHO培养基: 无血清培养基, CDM4CHO培养基, 牛血清培养培养基, 购自Hyclone公 司。 0025 实施例1 PigFC-PCV2Cap-IL29突变体及其编码基因的获得 为了提高野生型PCV2Cap的长效性, 将PCV2Cap的蛋白质序列猪FC抗体片段融合, 同时 增加机体免疫应答效率, 链接了IL-29肽段。 具体的融合蛋白质具体的蛋白质位点如表1所 说明书 3/9 页 5 CN 112266421 A 5 示。

23、。 0026 表1融合蛋白质设计 本实施例合成所示的PigFC-PCV2Cap-IL29基因, 是将PCV2Cap蛋白N端融合猪FC片段, C 端链接IL-29片段, 其编码序列是SEQ ID No.1的第22-1551位所示, 编码SEQ ID No.2所示 的蛋白质PigFC-PCV2Cap-IL29。 0027 实施例2重组PigFC-PCV2Cap-IL29重组表达载体的构建 利用NheI和XhoI双酶切PMD18- PigFC-PCV2Cap-IL29载体得到SEQ ID No.1所示的DNA 合成DNA核酸分子, 1500bp左右片段是目标片段, 含有PigFC-PCV2Cap-I。

24、L29的编码基因的 DNA片段或突变编码基因的DNA片段进行回收纯化, 结果如图1。 0028 将纯化后的含有PigFC-PCV2Cap-IL29的编码基因的DNA片段分别与NheI和XhoI双 酶切真核表达载体pcCND3.1(-)酶切, 合成基因于载体段连接 (连接体系为0.5 l pcCND3.1 (-); 4.5 l PigFC-pigSCFVE2酶切片段, 2xT4快速连接酶, 室温3小时) 。 连接产物转化DH5 感受态细胞, 获得阳性重组菌, 用PCR鉴定阳性克隆结果如图2。 0029 提取阳性载体NheI和XhoI双酶切验证, 阳性验证正确的送去测序验证, 将测序结 果正确的是。

25、用SEQ ID No.1第22-1551位所示的PigFC-PCV2Cap-IL29的编码基因替换 pcCND3.1(-)的NheI和XhoI识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcCND3.1(-)-PigFC- PCV2Cap-IL29; 对测序正确菌株接种于100ml含氨苄LB培养基250ml三角瓶中, 37条件下, 220rpm摇床培养过夜, 用天根无内毒试剂盒抽提载体。 pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶 切产物, 回收产物准备转染哺乳细胞CHO用。 0030 实施例3融合表达细胞CHO获得的获得 将上述经过pvul酶切后纯化产物, 收集CHO 细胞, 进行融合表达, 具体包括如下步。

26、骤: (1) 转染前一天, 以合适的细胞密度接种到6孔培养板上; 转染时, 细胞要达到90-95%的 融合; (2) 配制溶液1: 240 l 无血清培养基+10 l lipofectamine 2000/孔 (总体积250 l) (温育5min) ; (3) 配制溶液2: 225 l无血清培养基+25 l (4 g) 质粒 per well (总体积250 l) ; (4) 将溶液1与溶液2混合, 室温下置20min; (5) 与此同时, 将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后, 加入2ml无血清培养 说明书 4/9 页 6 CN 112266421 A 6 基; (6) 将溶液1与溶。

27、液2的混合液逐滴加入孔中, 摇动培养板, 轻轻混匀; 在37、 5%的CO2 中保温5-6小时; (7) 6小时后, 更换含有血清的全培养基, 在37、 5%的CO2中48-72h检测转染水平。 0031 如果做稳定转染, 换全培养基培养后24h, 即可以1: 10或更高的稀释比例 (根据细 胞的生长情况) 接种到新的培养板, 加抗生素进行筛选。 0032 实施例4克隆筛选及细胞悬浮驯化 待细胞生长两天贴壁后, 换液 (D001+10% FBS) 加压, 加G418浓度为1.2-1.8mg/mL。 有大 量死细胞直接换液不加压, 待克隆长出。 细胞单克隆长至合适大小, 准备挑克隆。 将所有克 。

28、隆挑至96孔板中。 置培养箱中培养, 待克隆长至铺满80%孔底, 取上清SDS-PAGE 胶筛选表达 量高的细胞株留下继续筛选。 0033 选择7个初筛蛋白表达高的克隆细胞, 将细胞转移至T75 培养瓶中培养, 连续培养 2个月, 挑选最终适应悬浮培养高产的细胞株作为工程菌株。 0034 实施例5稳定细胞株的10L发酵流加培养 装液量为5L, 转速为100rpm, pH控制为7.2, 培养温度为37。 准备1L种子液, 密度为2.0 106个/mL, 加入发酵罐中, 每天计数, 观察细胞状态, 当发酵第5天左右细胞密度达到5.0 106左右每天补加补料培养基400mL连续补加6天, 此时蛋白浓。

29、度达到最大, 停止补加补料 培养基, 1天后停止发酵。 发酵过程中用O2维持发酵罐30%溶氧水平, CO2和NaHCO3控制pH 7.2, 细胞发酵变化如表2所示。 0035 表2CHO细胞发酵生产PigFC-PCV2Cap-IL29融合蛋白发酵参数 实施例6重组蛋白的纯化 收集发酵液, 5000rpm离心8min获得上清液, 用0.22 m的膜过滤。 第一步选用 buffer 说明书 5/9 页 7 CN 112266421 A 7 A: 20mM PBS、 0.15M NaCl、 pH7.2, 电导18.128ms/cm平衡纯化柱子, 用发酵液上样, buffer A 淋洗平衡, 随后用b。

30、uffer B: 4.5mM 柠檬酸钠、 25mM柠檬酸pH3.0、 电导1.27ms/cm洗脱。 洗脱 液用0.2M PB中和低pH纯化液, 膜包换液到PBS中, 经SDS-PAGE检测达到电泳纯。 整个纯化工 艺步骤衔接较好, 上一步层析的洗脱液只需要稍微的调节便可作为下一步处理液, 便于减 少中间处理步骤, 便于工业化操作和减少中间操作带来的污染。 0036 实施例7亚单位疫苗的制备 将纯化所得的PCV2Cap重组融合蛋白加入佐剂组成猪圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫 苗。 佐剂可以选用铝胶、 卡波姆971、 QuilA、 CpG-ODN、 矿物油等, 可选择加入细胞因子如猪 - 干扰素、。

31、 猪白细胞介素2等, 其中, 控制PigFC-PCV2Cap-IL29蛋白的有效成分浓度不低于25- 500 g/mL, 每剂量25-500 g。 0037 本实施例选用85重量份所述PigFC-PCV2Cap-IL29蛋白和15重量份的佐剂 (质量比 为10: 1: 1的卡波姆971、 QuilA、 猪 -干扰素复合佐剂) 充分混合, 制得所需疫苗。 0038 实施例8重组融合蛋白安全性实验 取健康3周龄仔猪10头, 分别随机分2个组, 每组5头, 共2组进行单剂量1次注射、 单剂量 2次注射, 和超剂量1次注射, 以接种安全性实验。 0039 实验期间, 每天观测实验动物临床症状变化, 包。

32、括精神、 采食、 活动、 呼吸、 饮水、 注 射部位炎症反应、 排泄状况, 每天体温检测, 记录动物异常情况, 如死亡, 如果有死亡需解 剖, 观测病理变化, 分析原因。 0040 经过2周和连续观测, 对注射重组融合疫苗前后的临床症状进行比较, 发现单剂量 接种和单剂量重复接种组以及超剂量接种组, 均饮食正常, 精神无不良变化, 呼吸及排泄未 见异常, 注射部位未发现发炎现象, 实验期间没有遇到动物有任何不良反应, 无死亡猪出 现, 注射后每天检测动物体温, 发现个别组中猪有体温升高现象, 但不超过3天, 大部分猪体 温维持39左右。 我们对高剂量猪的肝脏肠道肾组织进行免疫组化, 发现组织质。

33、地均匀, 未 见病理变化, 而且, 本发明中制备的疫苗蛋白即使以高剂量注射, 也无明显副作用, 是一种 安全免疫蛋白, 实施例9重组融合蛋白动物免疫实验 将本发明实施制备的PigFC-PCV2Cap-IL29蛋白按照实施例7所述制备方法制备疫苗, 使其有效抗原量为25 g/mL、 50 g/、 100 g/mL 3个梯度, 按照兽用生物制品规程要求进行成 品疫苗的检验, 用合格制品进行动物试验。 选择3-4周龄猪圆环病毒2型抗原及抗体双阴性 猪30头雌雄各半, 购自福建某猪场, 分别随机分6个组, 每组5头, 共6组如下表3 (设置试验疫 苗3组25 g/ml; 50 g/ml; 100 g/。

34、ml; 对照疫苗组1, 对照疫苗组1, 阴性对照组) 。 免疫后14天、 21天、 28天监测抗体, 免疫后28天用PCV2 SX07株进行攻毒, 攻毒剂量每头肌肉注射8ml, 攻 毒后4周采集血清监测病毒血症, 攻毒后4周剖杀所有猪, 采集淋巴结进行免疫组合检测; 通 过病毒血症和免疫组化检测结果分析抗原免疫效率。 0041 表3试验动物分组 说明书 6/9 页 8 CN 112266421 A 8 试验结果如下表4及附图3中显示, 疫苗免疫后, PCV2Cap蛋白含量越低, 抗体产生水平 越慢, 至免疫后4周, 25 g剂量组仅S/P值偏低, 50 g、 100 g组抗体产生速率最好, 二。

35、者之间 差异不显著, 对照疫苗组抗体产生良好, 与50 g、 100 g组无差异。 PCV2攻毒后, 病毒血症, 攻 毒对照组5/5阳性, 对照疫苗组1和50 g组均为4/5阴性、 对照疫苗组2、 50 g组和100 g组均 为5/5阴性; 如图3所示, 免疫组化检测, 攻毒对照组5/5强阳性, 对照疫苗组均5/5阴性, 25 g 组3/5阴性, 50 g组4/5阴性, 100 g组5/5阴性; 攻毒保护试验结果显示, PCV2 Cap融合蛋白 制备的疫苗免疫后能够对仔猪产生抵御PCV2感染的主动免疫保护力。 0042 表4不同PCV2Cap蛋白剂量疫苗免疫试验猪抗体监测结果 说明书 7/9 。

36、页 9 CN 112266421 A 9 注: a, PCV2 ELISA抗体阴阳性判断标准: S/P0.3阴性, 0.3S/P0.4可疑, S/P0.4 阳性;“+” 弱阳性,“+” 强阳性。 0043 可见, 本发明制备的重组融合蛋白制备的疫苗免疫后能够对仔猪产生抵御PCV2感 染的主动免疫保护力。 说明书 8/9 页 10 CN 112266421 A 10 0044 尽管本发明的实施方案已公开如上, 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用, 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域, 对于熟悉本领域的人员而言, 可容易地 实现另外的修改, 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般。

37、概念下, 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的实施例。 说明书 9/9 页 11 CN 112266421 A 11 序列表 申请人: 北京科牧丰生物制药有限公司、 兆丰华生物科技 (南京) 有限公司、 兆 丰华生物科技 (南京) 有限公司北京生物医药科技中心、 兆丰华生物科技 (福州) 有限公司 一种重组融合蛋白及其制备的预防PCV2病毒感染的疫苗 2 SIPOSequenceListing 1.0 1 1560 DNA PigFC-PCV2Cap-IL29 1 gctagccacc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttc。

38、cagg 60 ttccactggt gacatctgcc ccgcctgcga gagccccggc cccagcgtgt tcatcttccc 120 ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc caggtgacct gcgtggtggt 180 ggacgtgagc caggagaacc ccgaggtgca gttcagctgg tacgtggacg gcgtggaggt 240 gcacaccgcc cagaccagat gacctatccg cgtcgccgtt accgtcgccg tcgtcatcgc 300 cctcgcagtc a。

39、cttaggcca gattctgcgt cgccgtcctt ggctggtgca tcctcgtcac 360 cgctatcgct ggcgccgcaa gaacggcatc tttaacaccc gcctgagccg caccttcggc 420 tacaccatca agcgcacaac cgtgaagacc ccgagctggg cagtggatat gatgcgcttc 480 aacatcaatg actttctgcc gccgggtggt ggtagtaatc cgcgcagtgt gccgttcgag 540 tactaccgca tccgcaaggt gaaggtggag。

40、 ttctggcctt gcagcccgat cacccaaggt 600 gatcgtggtg tgggcagcag cgccgtgatc ctggacgaca acttcgtgac caaggccacc 660 gccctgacct acgacccgta cgtgaactac agcagccgcc acaccatcac ccagccgttc 720 agttaccaca gccgctattt caccccgaaa ccggtgctgg acagcaccat cgactacttc 780 cagccgaaca acaagcgcaa ccaactgtgg ctgcgtctgc agaccgcc。

41、gg caacgttgat 840 catgtgggtc tgggcacagc cttcgagaac agcatctacg accaggagta taacatccgc 900 gtgaccatgt acgtgcagtt ccgcgagttc aacctgaaag acccgcctct gaacccgtaa 960 caccgcccag accagatggc tacagcttgg atcgtggtgc tggcgactgt gatgctggac 1020 ttggccagag ctggccctgt ccccactttc aagcccacca caaccaggaa gggctgccac 1080 。

42、atgggccagt tccaatctct gtcaccacag gagctgaagg gcttcaagaa agccaaggat 1140 gctttggaag agtcactctc actgaagaac tggagctgca gctctcccct cttccccagg 1200 acccgggacc tgaggcagct gcaggtgtgg gagcgcctcg tggccttaga ggctgagcta 1260 gacttgactc tgaaggtcct aagggccgcg gctgactcat ccctgggggt caccctggac 1320 cagccacttc gcacg。

43、ctgca tcacatccac gtcgaacttc aggcttgcat cagggctcag 1380 cccacggcag gatcccggct ccagggccgc ctcaaccact ggctgcaccg gctccaagaa 1440 gccacaaaga aagagtccca aggctgcctt gaggcctctg tgacattcaa cctcttccac 1500 ctcctcgtaa gggacctgag aagtgttacc agtggagact tgcacatctg actcgagtag 1560 2 序列表 1/3 页 12 CN 112266421 A 12。

44、 515 PRT PigFC-PCV2Cap-IL29 2 Met Gly Thr Ala Thr Leu Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Thr Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Ala Ile Cys Pro Ala Cys Gly Ser Pro Gly Pro Ser 20 25 30 Val Pro Ile Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr Leu Met Ile Ser Ala 35 40 45 Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Gl。

45、y Gly Ala Pro 50 55 60 Gly Val Gly Pro Ser Thr Thr Val Ala Gly Val Gly Val His Thr Ala 65 70 75 80 Gly Thr Ala Pro Leu Gly Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg 85 90 95 Arg Arg His Arg Pro Arg Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg 100 105 110 Pro Trp Leu Val His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg 。

46、Arg Lys Asn 115 120 125 Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys 130 135 140 Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe 145 150 155 160 Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser 165 170 175 Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val 。

47、Lys Val Glu Phe Trp 180 185 190 Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala 195 200 205 Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr 210 215 220 Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe 225 230 235 240 Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro 。

48、Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr 245 250 255 Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg 260 265 270 Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe 序列表 2/3 页 13 CN 112266421 A 13 275 280 285 Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr 290 295 300 V。

49、al Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Thr 305 310 315 320 Ala Pro Leu Gly Met Ala Thr Ala Trp Ile Val Val Leu Ala Thr Val 325 330 335 Met Leu Asp Leu Ala Arg Ala Gly Pro Val Pro Thr Phe Lys Pro Thr 340 345 350 Thr Thr Arg Lys Gly Cys His Met Gly Gln Phe Gln Ser Leu Ser Pro 355 3。

50、60 365 Gln Glu Leu Lys Gly Phe Lys Lys Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser 370 375 380 Leu Ser Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Leu Phe Pro Arg Thr 385 390 395 400 Arg Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Trp Glu Arg Leu Val Ala Leu Glu 405 410 415 Ala Glu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Val Leu Arg Ala Ala Ala Asp S。

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内容关键字: 重组 融合 蛋白 及其 制备 预防 PCV2 病毒感染 疫苗
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