可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010217461.X (22)申请日 2020.03.25 (71)申请人 江苏科技大学 地址 212003 江苏省镇江市梦溪路2号 (72)发明人 刘超超王琼 (74)专利代理机构 北京盛凡智荣知识产权代理 有限公司 11616 代理人 陈月婷 (51)Int.Cl. C12N 15/83(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/82(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) (54)发明名称 一种可进行植物多基因编辑的病。

2、毒载体及 其构建方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种可进行植物多基因编辑 的病毒载体及其构建方法和应用， 涉及植物基因 编辑技术领域； 将tRNA、 sgRNA依次连接构成单元 序列， 连接载体pCE2； 使用 “金门” 克隆方法， 将靶 标基因的靶序列插入到每个单元序列的tRNA与 sgRNA之间， 并且多个所述单元序列串联排列， 此 串联序列插入到TRV2病毒载体中， TRV侵染过量 表达Cas9蛋白的植株后， 组装有不同目标靶序列 的tRNA-sgRNA表达序列单元获得转录， 完成多基 因编辑过程， 可实现多个基因的编辑或者根据目 标进行不同基因的组合编辑。 本方法使植株中能 翻译。

3、成正常蛋白序列的mRNA表达量更低、 基因沉 默表型更稳定， 且可同时精确靶向敲除多个基 因。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 111334527 A 2020.06.26 CN 111334527 A 1.一种可进行植物多基因编辑的病毒载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)合成sgRNA-tRNA串联序列后， 连接载体pCE2， 得载体pCE2-GT； 所述sgRNA-tRNA串联序列 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； (2)以所述载体pCE2-GT为模板， 将不同的靶标序列分别插入到所述sgRNA-tRNA串联序 列的sgRNA和tRNA序列之间， 得。

4、单元序列； (3)将若干个所述单元序列串联后插入到TRV2病毒载体中， 得连接多个靶标序列的 TRV2-multiSG。 2.根据权利要求1所述构建方法， 其特征在于， 步骤(1)中利用TOPO克隆方法将所述 sgRNA-tRNA串联序列连接在载体pCE2上。 3.根据权利要求1所述构建方法， 其特征在于， 步骤(2)使用基于II型核酸内切酶酶切 和连接的 “金门” 克隆方法， 将靶标基因的靶序列插入到每个单元序列的tRNA与sgRNA之间。 4.根据权利要求3所述构建方法， 其特征在于， 所述II型核酸内切酶包括BsaI、 AarI、 BbsI、 BsmAI或BsmBI。 5.根据权利要求1。

5、所述构建方法， 其特征在于， 步骤(3)中将串联后的若干个单元序列 插入到TRV2病毒载体的多克隆位点EcoRI与BamHI之间。 6.根据权利要求5所述构建方法， 其特征在于， 在所述插入后， 还包括质粒Sanger测序 验证。 7.利用权利要求16任一项所述构建方法构建得到的TRV2-multiSG载体。 8.一种植物多基因编辑的方法， 其特征在于， 将权利要求7所述TRV2-multiSG载体侵染 过量表达Cas9蛋白的植株， 得多基因编辑植株。 9.一种检测多基因编辑植株的方法， 其特征在于， 提取所述多基因编辑植株的DNA， PCR 扩增目的基因的靶标区域， 然后Sanger测序鉴定。

6、。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111334527 A 2 一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用 技术领域 0001 本发明属于植株基因编辑技术领域， 具体涉及一种可进行植物多基因编辑的病毒 载体及其构建方法和应用。 背景技术 0002 靶向基因组编辑技术是指通过将外源序列靶向染色体特定的位点， 定点改造基因 组DNA来改变基因组中的特定基因， 实现定点插入一个基因或DNA元件， 或将特定基因序列 敲除的目的， 以便更加准确、 深入地了解疾病发病机理和探究基因功能。 早期的靶向基因组 编辑技术主要依赖于基因同源重组(基因打靶， gene targeting)及体细胞核移植。

7、技术来完 成对特定基因的改造， 这一时期的主要技术手段包括： 基因重组技术(Recombineering)， 寡 核苷酸介导的基因修复(single-strandedoligonucleotides)， 腺病毒介导的靶向基因改 造(AAV-mediated gene target)的突破， 是靶向技术上的一大变革， 但这些方法总体而言 存在效率低， 技术要求高而且成本高的缺点。 发明内容 0003 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构 建方法和应用， 基因沉默表型更加稳定高效； 对幼苗进行农杆菌侵染即可使目的基因发生 突变并研究其功能， 因此该方法比通过遗传。

8、转化获得稳定的基因编辑植株更加快捷高效， 大大缩短了试验周期。 0004 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0005 本发明提供了一种可进行植物多基因编辑的病毒载体的构建方法， 包括以下步 骤： (1)合成sgRNA-tRNA串联序列后， 连接载体pCE2， 得载体pCE2-GT； 所述sgRNA-tRNA串联 序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 0006 (2)以所述载体pCE2-GT为模板， 将不同的靶标序列分别插入到所述sgRNA-tRNA串 联序列的sgRNA和tRNA序列之间， 得单元序列； 0007 (3)将若干个所述单元序列串联后插入到TRV2病毒载体。

9、中， 得连接多个靶标序列 的TRV2-multiSG。 0008 优选的， 步骤(1)中利用TOPO克隆方法将所述sgRNA-tRNA串联序列连接在载体 pCE2上。 0009 优选的， 步骤(2)使用基于II型核酸内切酶酶切和连接的 “金门” 克隆方法， 将靶标 基因的靶序列插入到每个单元序列的tRNA与sgRNA之间。 0010 优选的， 所述II型核酸内切酶包括BsaI、 AarI、 BbsI、 BsmAI或BsmBI。 0011 优选的， 步骤(3)中将串联后的若干个单元序列插入到TRV2病毒载体的多克隆位 点EcoRI与BamHI之间。 0012 优选的， 在所述插入后， 还包括质粒。

10、Sanger测序验证。 0013 本发明还提供了利用所述构建方法构建得到的TRV2-multiSG载体。 说明书 1/6 页 3 CN 111334527 A 3 0014 本发明还提供了一种植物多基因编辑的方法， 将所述TRV2-multiSG载体侵染过量 表达Cas9蛋白的植株， 得多基因编辑植株。 0015 本发明还提供了一种检测多基因编辑植株的方法， 提取所述多基因编辑植株的 DNA， PCR扩增目的基因的靶标区域， 然后Sanger测序鉴定。 0016 本发明提供了一种一套进行植物多基因编辑的TRV病毒载体， tRNA、 sgRNA依次连 接构成单元序列， 该单元序列构建于一个通用载。

11、体pCE2； 使用基于Bsa 酶切和连接的 “金 门” 克隆方法， 以 “边切边连” 法将靶标基因的靶序列插入到每个单元序列的tRNA与sgRNA之 间， 并且多个所述单元序列串联排列， 此串联序列插入到TRV2病毒载体中， TRV侵染过量表 达Cas9蛋白的植株后， 组装有不同目标靶序列的tRNA-sgRNA表达序列单元获得转录， 之后 被植物内源tRNA加工酶切割， 生成一个个成熟的gRNA， 接着gRNA和Cas9蛋白结合形成复合 体并引发靶标DNA双链断裂， 随后的植物内源修复机制导致indel的产生， 完成多基因编辑 过程， 可实现多个基因的编辑或者根据目标进行不同基因的组合编辑。 。

12、相较于同样使用此 TRV载体的病毒诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing,VIGS)， 本方法使目 标基因在基因组水平就已产生DNA突变， 因此使植株中能翻译成正常蛋白序列的mRNA表达 量更低、 基因沉默表型更稳定； 并且， 本载体可同时精确靶向敲除多个基因， 在多基因功能 研究中， 这一点是传统VIGS难以实现的； 而相较于通过遗传转化进行基因编辑的方法， 本方 法无需进行外植体培养、 诱导愈伤分化等复杂的操作， 能更加快捷高效、 省时省力地获得基 因编辑植株， 这将对基础研究和作物改良的基因组编辑技术产生积极影响。 附图说明 0017 图1为利用本发。

13、明所述病毒载体同时敲除4个不同家族基因的效果图； 0018 图2为gRNA连接方式。 具体实施方式 0019 本发明提供了一种可进行植物多基因编辑的病毒载体的构建方法， 包括以下步 骤： (1)合成sgRNA-tRNA串联序列后， 连接载体pCE2， 得载体pCE2-GT； 所述sgRNA-tRNA串联 序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 0020 (2)以所述载体pCE2-GT为模板， 将不同的靶标序列分别插入到所述sgRNA-tRNA串 联序列的sgRNA和tRNA序列之间， 得单元序列； 0021 (3)将若干个所述单元序列串联后插入到TRV2病毒载体中， 得连接多个靶标序列。

14、 的TRV2-multiSG。 0022 本发明合成sgRNA-tRNA串联序列后， 连接载体pCE2， 得载体pCE2-GT； 所述sgRNA- tRNA串联序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 本发明优选人工合成所述sgRNA-tRNA串 联序列(SEQ ID NO.1)： GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAA AAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGG GTTCGATTCCCGGCTGGTGCA。

15、， 并以TOPO克隆方法连接于载体pCE2， 命名为pCE2-GT； 在后续步骤 中， pCE2-GT作为PCR模板使用， 用于合成不同靶标的sgRNA-tRNA单元。 0023 本发明以所述载体pCE2-GT为模板， 将不同的靶标序列分别插入到所述sgRNA- tRNA串联序列的sgRNA和tRNA序列之间， 得单元序列。 本发明优选依据金门组装原则 说明书 2/6 页 4 CN 111334527 A 4 (Golden Gate assembly)设计引物并合成多顺反子tRNA-sgRNA(PTG)。 为了将多个DNA片段 按照一定的顺序用金门组装法连接， 本发明的DNA片段优选用Bsa。

16、I(或其他II型核酸内切 酶， 如AarI、 BbsI、 BsmAI、 BsmBI)消化后， 顺次连接的两个片段需要有且唯一且能重叠的4个 碱基， 而gRNA间隔区(即靶标序列)是各个PTG之间唯一不同的序列， 因此， 各PTG应在gRNA间 隔区内被划分为两个DNA片段。 如图 2中A和B所示 (具体连接方式参考Xie et al.2015.Boosting CRISPR/Cas9multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.PNAS)， gRNA间隔区被分成两部分， 重叠4bp， 每一半间隔基。

17、在具 有BsaI位点的寡聚引物中合成。 0024 本发明将若干个所述单元序列串联后插入到TRV2病毒载体中， 得连接多个靶标序 列的TRV2-multiSG。 本发明优选在TRV2多克隆位点EcoRI与BamHI之间， 以同源重组法插入 上一步获得的靶向多个基因的tRNA-sgRNA串联序列， 质粒Sanger测序验证， 得到TRV2- multiSG载体。 0025 本发明还提供了利用所述构建方法构建得到的TRV2-multiSG载体。 0026 本发明还提供了一种植物多基因编辑的方法， 将所述TRV2-multiSG载体侵染过量 表达Cas9蛋白的植株， 得多基因编辑植株。 本发明所述侵染。

18、的方法， 优选包括： 将以拟南芥 AtUBI3启动子驱动过表达Cas9蛋白的番茄种子用无菌水在烧瓶中发芽。 瓶子放在25号的瓶 子里以每分钟200转的速度摇24小时。 用滤纸和无菌水将种子转移到平板上。 发芽约24h后， 种子发芽长度达0.51cm， 进行抽真空侵染。 本发明在进行所述侵染时， 优选采用冻融法将 pTRV1、 TRV2-multiSG导入根癌农杆菌菌株GV3101。 将含有目标基因的农杆菌涂LB平板(含 卡那霉素(50 g/mL)、 利福平(25 g/mL)、 庆大霉素(25 g/mL)3种抗生素)， 28培养2天左右 出现单菌落。 挑取单菌落于含有3mL LB培养基的10mL。

19、离心管中， 28， 200rpm摇菌24h。 按1： 100比例将上述农杆菌菌液加入3种相同抗生素的50mLB培养基中， 扩大培养至OD600值在0.8 1.0之间(约12h)。 4000g， 4， 离心10min， 弃上清。 预冷侵染液悬浮沉淀至OD60011.5 (侵染液配制： 10mM氯化镁、 10mM MES， pH5.7， 用时加乙酰丁香酮至150 M)。 室温放置3h， pTRV1： TRV2-multiSG1:1混合侵染。 0027 本发明优选在每1.5或2.0ml离心管中放置渗透混合物和发芽种子(约10粒)。 然 后， 将离心管放入真空干燥器中。 利用幼芽真空渗透系统一个连接到。

20、便携式空气压缩机 (GAST)的真空干燥机将农杆菌渗透到幼芽中。 相对真空度为-25kpa。 真空压力维持约30秒， 然后迅速释放到大气压， 重复了5次。 处理过的幼芽播于营养土壤中。 幼苗培养条件： (212 ， 2030相对湿度)， 光照强度为300 M/m2/s， 光-暗周期16/8h。 0028 本发明还提供了一种检测多基因编辑植株的方法， 提取所述多基因编辑植株的 DNA， PCR扩增目的基因的靶标区域， 然后Sanger测序鉴定。 0029 本发明对所述DNA的提取方法以及PCR扩增的方法及引物并没有特殊限定， 利用本 领域的常规方法即可。 0030 下面结合实施例对本发明提供的可。

21、进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方 法和应用进行详细的说明， 但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 0031 实施例1 0032 1.载体构建： 0033 1.1人工合成gRNA-tRNA串联序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC 说明书 3/6 页 5 CN 111334527 A 5 CGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGC CACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA， 并以TOPO克隆方法。

22、连接于载体pCE2， 命名为 pCE2-GT,在后续步骤中， pCE2-GT作为PCR模板使用， 用于合成不同靶标的gRNA-tRNA单元， 靶标包括： 0034 SlTCP2-sg1(Solyc07g062680.1， SEQ ID NO.2)， TACAAGGAGGTCACATTGTG； 0035 SlOBP3-sg2(Solyc03g083420.2， SEQ ID NO.3)， TATGTCTCCGTTAGAATCGG； 0036 SlHSP70-sg3(Solyc03g082920.2， SEQ ID NO.4)， GTGACAAGATTTCATGGGGA； 0037 SlHSFA8。

23、-sg4(Solyc09g059520.2， SEQ ID NO.5)， GTGGAGGATGAGTCAACTGA。 0038 1.2依据金门组装原则(Golden Gate assembly)设计引物并合成多顺反子tRNA- gRNA(PTG)。 0039 其中， 引物信息如下所示： 0040 SLTCP2-SG1-F(SEQ ID NO.6):TA GGTCTC CGGTCACATTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG 0041 SLTCP2-SG1-R(SEQ ID NO.7):CG GGTCTC AGACCTCCTTGTATGCACCAGCCGGGAATCGA； 0042 SL。

24、OBP3-SG2-F(SEQ ID NO.8):TA GGTCTC CCGTTAGAATCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG 0043 SLOBP3-SG2-R(SEQ ID NO.9):CG GGTCTC AAACGGAGACATATGCACCAGCCGGGAATCGA 0044 SLHSP70-SG3-F(SEQ ID NO.10):TA GGTCTC CATTTCATGGGGAGTTTTAGAGCTAGAAAT AG 0045 SLHSP70-SG3-R(SEQ ID NO.11):CG GGTCTC AAAATCTTGTCACTGCACCAGCCGGGAATC GA 0046 。

25、SLHSFA8-SG4-F(SEQ ID NO.12):TA GGTCTC CTGAGTCAACTGAGTTTTAGAGCTAGAAAT AG 0047 SLHSFA8-SG4-R(SEQ ID NO.13):CG GGTCTC ACTCATCCTCCACTGCACCAGCCGGGAATC GA； 0048 L5AD-TRV2-ECORI-F(SEQ ID NO.14):GTGAGTAAGGTTACCGAATTCAACAAAGCACCAGTG GTCTAG； 0049 L3AD-TRV2-BAMHI-R(SEQ ID NO.15):CGTGAGCTCGGTACCGGATCCAAAACAAAAA。

26、AGCAC CGACTCGGTGCCACTTTTTC； 0050 S5AD-TRV2-F(SEQ ID NO.16):GTGAGTAAGGTTACCGAATTC； 0051 S3AD-TRV2-R(SEQ ID NO.17):CGTGAGCTCGGTACCGGATCC。 0052 为了将多个DNA片段按照一定的顺序用金门组装法连接， DNA片段用BsaI(或其他 II型核酸内切酶， 如AarI、 BbsI、 BsmAI、 BsmBI)消化后， 顺次连接的两个片段需要有且唯一 且能重叠的4个碱基， 而gRNA间隔区(即靶标序列)是各个PTG之间唯一不同的序列， 因此， 各 PTG应在gRNA间隔。

27、区内被划分为两个DNA片段。 如图2中A和B所示， gRNA间隔区被分成两部 分， 重叠4bp， 每一半间隔基在具有BsaI位点的寡聚引物中合成。 0053 1.3在TRV2多克隆位点EcoRI与BamHI之间， 以同源重组法插入上一步获得的靶向 四个基因的tRNA-gRNA串联序列， 质粒Sanger测序验证， 得到TRV2-multiSG载体。 0054 2.侵染过程： 将以拟南芥AtUBI3启动子驱动过表达Cas9蛋白的番茄种子用无菌水 在烧瓶中发芽。 瓶子放在25号的瓶子里以每分钟200转的速度摇24小时。 用滤纸和无菌水将 种子转移到平板上。 发芽约24h后， 种子发芽长度达0.51。

28、cm， 进行抽真空侵染。 说明书 4/6 页 6 CN 111334527 A 6 0055 采用冻融法将pTRV1、 TRV2-multiSG导入根癌农杆菌菌株GV3101。 将含有目标基因 的农杆菌涂LB平板(含卡那霉素(50 g/mL)、 利福平(25 g/mL)、 庆大霉素(25 g/mL)3种抗生 素)， 28培养2天左右出现单菌落。 挑取单菌落于含有3mL LB培养基的10mL离心管中， 28 ， 200rpm摇菌24h。 按1： 100比例将上述农杆菌菌液加入3种相同抗生素的50mLB培养基中， 扩大培养至OD600值在0.8-1.0之间(约12h)。 4000g， 4， 离心1。

29、0min， 弃上清。 预冷侵染液悬 浮沉淀至OD6001-1.5(侵染液配制： 10mM氯化镁、 10mM MES， pH5.7， 用时加乙酰丁香酮 至150 M)。 室温放置3h， pTRV1： TRV2-multiSG1:1混合侵染。 0056 在每1.5或2.0ml离心管中放置渗透混合物和发芽种子(约10粒)。 然后， 将离心管 放入真空干燥器中。 利用幼芽真空渗透系统一个连接到便携式空气压缩机(GAST)的真空干 燥机将农杆菌渗透到幼芽中。 相对真空度为-25kpa。 真空压力维持约30秒， 然后迅速释放到 大气压， 重复了5次。 处理过的幼芽播于营养土壤中。 幼苗培养条件： (212。

30、， 2030相对 湿度)， 光照强度为300 M/m2/s， 光-暗周期16/8h。 0057 3.筛选。 将上一步的植株取样， 提取DNA， PCR扩增目的基因的靶标区域， Sanger测 序鉴定， 选出目的基因发生突变的植株， 进行后续实验。 0058 通过利用本方法来进行反向遗传学的基因功能研究， 由于在种子萌芽阶段目的基 因即发生突变， 且此突变可通过有丝分裂的方式在后期长出的苗器官中继续存在， 因此其 基因沉默表型维持时间久， 可长达10到15周， 而传统的VIGS方法需要靶向目的基因的片段 持续表达才能维持其基因沉默的表型， 一般仅能有效维持46周， 因此本方法其基因沉默 表型更加。

31、稳定高效； 利用本发明所述载体可同时敲除4个不同家族基因(图1)； 对幼苗进行 农杆菌侵染即可使目的基因发生突变， 当代苗即可用于实验研究， 实验周期一般为13个 月， 而通过遗传转化获得稳定的基因编辑植株则至少需要68个月的时间， 因此该方法更 加快捷高效， 大大缩短了试验周期。 0059 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 5/6 页 7 CN 111334527 A 7 0060 说明书 6/6 页 8 CN 111334527 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 111334527 A 9 。