放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方法与应用.pdf

《放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方法与应用.pdf（11页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010164888.8 (22)申请日 2020.03.11 (71)申请人 安徽医科大学第二附属医院 地址 230601 安徽省合肥市经济技术开发 区芙蓉路678号 (72)发明人 庞小溪李飞常文瑞袁清玥 李腾宇 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 张立娜 (51)Int.Cl. C07K 14/00(2006.01) C07K 1/13(2006.01) A61K 51/08(2006.01) A61K 103/10(2006.01。

2、) (54)发明名称 放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方 法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种放射性锝标记的PD-L1靶 向多肽及其制备方法与应用。 本发明所提供的制 备放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的方法， 可包 括如下步骤： 在PD-L1靶向多肽的氨基端连接 DTPA后， 再用放射性锝进行标记。 本发明所提供 的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的制备方法其 标记率可达94.001.47， 标记率大于90， 稳定性好， 具有PD-L1靶向特异性， 具有生物安全 性。 本发明对于不同PD-L1表达水平患者进行分 层筛选， 为筛选潜在PD-L1mAb治疗受益患者群 体以及规避PD-。

3、L1mAb引起的致死性免疫相关不 良反应提供客观依据。 同时能够监测疗效反应， 提高药物有效性及安全性等方面具有重要意义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 111320675 A 2020.06.23 CN 111320675 A 1.一种制备放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的方法， 包括如下步骤： 在PD-L1靶向多肽 的氨基端连接DTPA后， 再用放射性锝进行标记。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述方法包括如下步骤： (A)配制含有SKI多肽、 氯化亚锡、 酒石酸钠和放射性锝的反应体系； 所述SKI多肽为在 PD-L1靶向多肽的氨基端连接DTPA后。

4、的产物； 其中， 所述SKI多肽、 所述氯化亚锡和所述酒石酸钠的配比为50 g所述SKI多肽： 15 g所 述氯化亚锡： 500 g所述酒石酸钠； (B)在室温下震荡反应。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于： 所述(A)中， 所述反应体系的pH为7.0。 4.根据权利要求2或3所述的方法， 其特征在于： 所述(A)中， 所述反应体系的总体积为 250 L。 5.根据权利要求2-4中任一所述的方法， 其特征在于： 所述(A)中， 所述放射性锝为 99mTc， 是以高锝酸钠的形式加入到反应体系中的； 和/或 所述SKI多肽、 所述氯化亚锡、 所述酒石酸钠和所述高锝酸钠淋洗液的配比为50 。

5、g所述 SKI多肽： 15 g所述氯化亚锡： 500 g所述酒石酸钠： 含有12-20mCi 99mTc的所述高锝酸钠淋 洗液。 6.根据权利要求2-5中任一所述的方法， 其特征在于： 所述(B)中， 所述震荡反应的时间 为1h。 7.根据权利要求2-6中任一所述的方法， 其特征在于： 所述(A)包括如下： (A1)将所述SKI多肽溶解于0.01mol/L、 pH7.4的PBS溶液中， 浓度为1 g/ L； (A2)将(A1)所得溶液加入等体积0.2mol/L的醋酸胺缓冲液， 得到混合溶液； (A3)向所述混合溶液中先后加入酒石酸钠和氯化亚锡， 震荡均匀后， 加入高锝酸钠淋 洗液， 所述高锝酸。

6、钠中的锝为99mTc， 调pH7.0， 总反应体积250 L； 其中， 所述SKI多肽、 所述 氯化亚锡、 所述酒石酸钠和所述高锝酸钠淋洗液的配比为50 g所述SKI多肽： 15 g所述氯化 亚锡： 500 g所述酒石酸钠： 含有12-20mCi 99mTc的所述高锝酸钠淋洗液。 8.根据权利要求1-7中任一所述的方法， 其特征在于： 所述PD-L1靶向多肽的氨基酸序 列如SEQ ID No.1所示。 9.采用权利要求1-8中任一所述的方法制备得到的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽。 10.权利要求9所述的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽在如下任一中的应用： (C1)作为或制备靶向PD-L1的。

7、放射性免疫探针； (C2)肿瘤显像或制备用于肿瘤显像的产品； (C3)制备靶向肿瘤细胞的产品。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111320675 A 2 放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制 备方法与应用。 背景技术 0002 基于PD-L1/PD-1通路阻断的免疫疗法在临床实践中展现了喜人的前景， 其是通过 阻断免疫逃逸， 激活免疫系统达到杀伤肿瘤细胞的目的。 但是临床研究表明， 不同个体对相 同免疫靶向疗法的敏感度和耐受性不一， 只有大约20的肿瘤患者可以从单一的抗PD-1/。

8、 PD-L1免疫治疗中获益； 且免疫治疗引起的免疫相关性不良反应(如免疫性心肌炎)也不容 忽视。 因此探究PD-L1抑制剂疗法的基本机制， 通过PD-L1这一生物靶标的表达水平预筛选 最佳获益患者人群或有望优化治疗方案、 节约医疗资源和成本， 更有助于发挥核医学分子 影像在提供 “个性化” 诊疗方案的作用， 推动精准医学时代的到来。 0003 很多研究表明， PD-L1的表达水平展现出其重要意义， 与免疫疗法的临床疗效有 关。 PD-L1存在膜形式(mPD-L1)和可溶形式(sPD-L1)两种可供检测的形式。 可溶形式的PD- L1主要采用酶联免疫吸附测定法。 而现今在临床工作中， 对于膜PD。

9、-L1表达水平的鉴定主流 方法是免疫组化法。 然而， 这种方法尚存在诸多限制： 肿瘤组织取材困难， 以非小细胞肺 癌为例， 即使是前瞻性临床研究， 也只有不到50的患者可以成功获取组织标本； 而且活体 取材具有创伤性。 肿瘤表达PD-L1是一个动态过程， 其表达水平根据肿瘤微环境的改变而 变化， 且其功能和稳定性随着在翻译后水平上进行的糖基化、 泛素化修饰程度调节而存在 一定差异。 IHC方法可能会由于肿瘤病灶内或病灶间的异质性表达以及病理切片制作等 原因， 导致错误的解读， 甚至漏诊。 0004 因此有必要找寻一种新的PD-L1水平检测方法以克服IHC检测法的缺点， 从而为免 疫治疗方案的个。

10、性化及疗效预测提供参考。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方法与应用。 0006 第一方面， 本发明要求保护一种制备放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的方法。 0007 本发明所要求保护的制备放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的方法， 可包括如下步 骤： 在PD-L1靶向多肽的氨基端连接DTPA后， 再用放射性锝进行标记。 0008 进一步地， 所述方法可包括如下步骤： 0009 (A)配制含有SKI多肽、 氯化亚锡、 酒石酸钠和放射性锝的反应体系； 所述SKI多肽 为在PD-L1靶向多肽的氨基端连接DTPA后的产物； 0010 其中， 所述SKI。

11、多肽、 所述氯化亚锡和所述酒石酸钠的配比为50 g所述SKI多肽： 15 g所述氯化亚锡： 500 g所述酒石酸钠。 0011 (B)在室温(255， 下同)下震荡反应。 0012 进一步地， 所述(A)中， 所述反应体系的pH为7.0。 说明书 1/5 页 3 CN 111320675 A 3 0013 进一步地， 所述(A)中， 所述反应体系的总体积为250 L。 0014 更进一步地， 所述(A)中， 所述放射性锝为99mTc， 是以高锝酸钠的形式加入到反应 体系中的。 0015 更进一步地， 所述SKI多肽、 所述氯化亚锡、 所述酒石酸钠和所述高锝酸钠淋洗液 的配比为50 g所述SKI。

12、多肽： 15 g所述氯化亚锡： 500 g所述酒石酸钠： 含有12-20mCi 99mTc 的所述高锝酸钠淋洗液(180 l)。 0016 进一步地， 所述(B)中， 所述震荡反应的时间为1h。 0017 更进一步地， 所述(A)可包括如下： 0018 (A1)将所述SKI多肽溶解于0.01mol/l、 pH7.4的PBS溶液中， 浓度为1 g/ L； 0019 (A2)将(A1)所得溶液加入等体积0.2mol/L的醋酸胺缓冲液， 得到混合溶液； 0020 (A3)向所述混合溶液中先后加入酒石酸钠和氯化亚锡， 震荡均匀后， 加入高锝酸 钠淋洗液， 所述高锝酸钠中的锝为99mTc， 调pH7.0。

13、， 总反应体积250 L； 其中， 所述SKI多肽、 所述氯化亚锡、 所述酒石酸钠和所述高锝酸钠淋洗液的配比为50 g所述SKI多肽： 15 g所述 氯化亚锡： 500 g所述酒石酸钠： 含有12-20mCi 99mTc的所述高锝酸钠淋洗液(180 l)。 0021 在本发明的具体实施方式中， 所述PD-L1靶向多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所 示。 0022 第二方面， 本发明要求保护采用前文第一方面所述的方法制备得到的放射性锝标 记的PD-L1靶向多肽。 0023 第三方面， 本发明要求保护前文第二方面所述的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽 在如下任一中的应用： 0024 (C1。

14、)作为或制备靶向PD-L1的放射性免疫探针； 0025 (C2)肿瘤显像或制备用于肿瘤显像的产品； 0026 (C3)制备靶向肿瘤细胞的产品。 0027 在本发明中， 选用99mTc标记PD-L1靶向多肽(SK)制备放射性免疫分子探针。 优点如 下： 基于单抗的分子探针存在明显不足， 其分子量大、 易失活、 组织渗透慢、 血液清除慢； 而基于多肽的分子探针在保持良好靶向性基础上， 能克服上述不足， 具有显著优势。 放射 性核素99mTc具有良好的物理性质， 是临床上最常用的显像核素， 其半衰期较短， 仅为6.03h； 作为过渡金属， 99mTc可形成多种多样的配合物， 适合于多种探针的标记； 。

15、发射纯低能射 线， 辐射损伤较小； 来源较方便， 性价比高， 适合于快速显像。 单光子发射计算机断层显像 仪(SPECT)是99mTc显像的影像设备， 该设备在临床中普及度最高， 故有利于后期临床转化。 可以全面显示肿瘤区域以及转移灶的PD-L1表达水平， 可在整个治疗过程中监测PD-L1水 平的动态变化， 而无需重复有创的取组织做活检。 0028 本发明接受以下基金资助： (1)国家级大学生创新创业训练计划项目， 编号 201910366028； (2)安徽医科大学校科学研究基金资助项目， 编号2019xkj028； (3)安徽医科 大学基础与临床合作研究提升计划项目， 编号2019xkjT。

16、011。 0029 本发明在优化其标记条件的基础上， 评估其稳定性和安全性等， 以三阴性乳腺癌 (TNBC)为模型， 通过SPECT显像， 验证99mTc标记新型放射免疫探针(99mTc-SKI)生物性质。 结 果显示： 本发明所提供的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的制备方法其标记率可达94.00 1.47， 标记率大于90， 故无需进一步纯化； 在4h内放化纯大于90， 说明其稳定性好； 说明书 2/5 页 4 CN 111320675 A 4 SPECT显像证实其具有PD-L1靶向特异性； 具有生物安全性。 本发明对于不同PD-L1表达水平 患者进行分层筛选， 为筛选潜在PD-L1 mA。

17、b治疗受益患者群体以及规避PD-L1 mAb引起的致 死性免疫相关不良反应提供坚实的客观依据。 最终通过优化诊疗方案， 提高个体化PD-L1 mAb疗效， 避免某些患者进行不必要的治疗， 显著降低医疗费用； 同时能够监测疗效反应， 提 高药物有效性及安全性等方面具有重要意义及临床应用前景。 附图说明 0030 图1为偶联有DTPA的SKI小分子多肽结构。 0031 图2为SKI的质谱结果， 分子量2864.9。 0032 图3为SKI的HPLC结果， 纯度99.9。 0033 图4为99mTc-SKI的稳定性检测结果： 4h内放化纯大于90(n3)。 0034 图5为TNBC荷瘤鼠99mTc-。

18、SKI的SPECT显像。 A： 注射后1小时健康裸鼠显像， 可见肾 脏、 膀胱明显显像， 尾部注射外渗污染； B： 注射48小时后显像， 肾脏及肿瘤组织清晰可见， 尾 部注射外渗污染； C： PD-L1 mAb阻断显像， 肿瘤组织显像明显抑制， 证明了该显像剂的PD-L1 靶向特异性。 0035 图6为99mTc-SKI三阴性乳腺癌小鼠模型生物分布。 具体实施方式 0036 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0037 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0038 实施例1、 放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的制备以及标记率检测 0。

19、039 一、 SKI小分子多肽的制备及鉴定 0040 在SEQ ID No.1所示的PD-L1靶向多肽的氨基端连接上DTPA， 得到SKI小分子多肽 (图1)。 0041 对SKI小分子多肽进行质谱和HPLC检测。 0042 质谱具体条件为： 操作模式:线性； 萃取模式:延迟； 极性:阳极采集控制:手动； 加 速电压:20000伏特； 栅极电压:95； 萃取延迟时间:200纳秒； 激光数:50/光谱； 激光强度: 2865； 激光频率:3.0Hz； 定标类型:缺失。 0043 高效液相色谱(HPLC)的具体条件为： 0044 高效液相色谱柱(HPLC Column)： Agela(2504.6。

20、mm I.D.)C18， 检测波长： 220nm； Buffer A： 0.05三氟乙酸(TFA)+2乙腈(CH3CN)， Buffer B： 0.05三氟乙酸(TFA)+90 三氟乙酸(TFA)； 均表示体积百分含量， Buffer A和Buffer B中余量均为水。 梯度： 15分钟 内Buffer B 15-30。 0045 SKI的质谱结果如图2所示。 理论计算SKI分子量为2864.08。 由图可见， 该多肽完成 合成后经由ESI-MS质谱技术测得实际分子量为2864.90， 二者十分接近， 故合成成功。 通过 高效液相色谱(HPLC)技术分析产物纯度， SKI的HPLC结果如图3所。

21、示。 由图可见， 产物纯度为 99.89。 0046 二、 放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的制备及标记率检测 0047 在反应管(多肽的PBS溶液)中依次加入醋酸铵缓冲液， 酒石酸钠， SnCl2， 高锝酸钠 说明书 3/5 页 5 CN 111320675 A 5 (锝为99mTc)。 采用逐步单因素， 固定多肽用量， 改变标记条件， 分别进行反应： 0048 氯化亚锡用量(5 g， 10 g， 15 g， 20 g)； 0049 总反应体积(150 L， 200 L， 250 L， 300 L， 350 L)； 0050 反应体系pH(5.5， 6.0， 6.5， 7.0， 7.5)； 。

22、0051 酒石酸钠用量(200 g， 300 g， 500 g， 600 g)。 0052 室温(255)下， 震荡反应时间1h。 分别测定标记率， 确定最佳标记条件。 0053 采取纸层析法， 用核素层析仪测定99mTc-SKI的标记率。 具体为将反应产物点样于 新华一号试纸， 待点样点干燥后， 分别置于展开剂1： 丙酮； 展开剂2： 生理盐水中进行展开。 待展开完全后， 测定试纸各段放射性计数， 计算标记率。 0054 标记率检测结果显示探索优化该探针的标记条件， 具体总结如下： 将50 g SKI多 肽溶解于0.01mol/l， pH7.4PBS溶液中， 浓度为1 g/uL。 将该溶液置。

23、于50 L醋酸胺缓冲液 (0.2mol/l)， 然后向上述混合液中加入10 L酒石酸钠(50 g/ L)， 随后加入10 L氯化亚锡 (1.5 g/ L)。 震荡均匀后， 加入一定活度的高锝酸钠淋洗液(组成： 除了放射性锝就是生理 盐水)180 L(其中放射性锝的含量为12-20mCi)。 调反应管pH7.0。 总反应体积250 L， 室温 下振荡器震荡反应时间1h。 取反应产物， 纸层析法测定标记率。 标记率为94.001.47 (n4)。 标记率大于90， 故无需进一步纯化。 0055 实施例2、 实施例1制备的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽的稳定性检测 0056 将实施例1制备得到的放。

24、射性锝标记的PD-L1靶向多肽(99mTc-SKI)的原液置于室 温环境中， 分别于放化30min， 1h， 2h， 4h， 测定放化纯， 以评估稳定性。 采取纸层析法， 用核素 层析仪测定99mTc-SKI的放射化学纯度， 具体操作同前(标记率检测方法)。 0057 结果如图4所示， 由图可见99mTc-SKI在4h内放化纯大于90(n3)， 这说明实施例 1制备得到的放射性锝标记的PD-L1靶向多肽具有较好的稳定性。 0058 实施例3、 99mTc-SKI三阴性乳腺癌小鼠模型生物分布 0059 一、 细胞培养及动物模型构建 0060 具文献报道， MDA-MB-231细胞系为人源性PD-。

25、L1高表达三阴性乳腺癌。 常规培养该 细胞。 在无菌操作原则前提下， 将浓度为1107/100 L的细胞悬液经皮下注射接种到小鼠 腋下， 构建皮下肿瘤动物模型， 瘤体直径0.8-1cm时， 行99mTc-SKI SPECT显像研究。 0061 二、 99mTc-SKI SPECT平面显像 0062 采用异氟烷气体麻醉， 待裸鼠麻醉成功后， 俯卧位固定于板上， 行SPECT显像。 0063 实验组： 由尾静脉注射7.4MBq(200 Ci， 100 l)的实施例1制备得到的99mTc-SKI。 0064 单抗阻断组： 经尾静脉注射1mg PD-L1单抗(BE0285， BioXCell Co.U。

26、SA)30min后， 再次经尾静脉注射7.4MBq(200 Ci， 100 l)的实施例1制备得到的99mTc-SKI。 0065 健康对照组： 由尾静脉注射7.4MBq(200 Ci， 100 l)的实施例1制备得到的99mTc- SKI。 0066 以上三组均分别于注射后1小时、 6小时、 12小时、 24小时、 48小时， 经异氟烷气体麻 醉后， 采取俯卧位固定， 行SPECT平面全身显像， 具体参数如下： 能峰120keV， 窗宽20， 高分 辨率， 平行孔准直器的探头， 静态采集200,000计数， 矩阵为256256， 放大倍数为2.0。 0067 结果如图5所示， 由图可见， 注。

27、射后1小时健康裸鼠可见肾脏、 膀胱明显显像， 尾部 注射外渗污染； 注射48小时后肾脏及肿瘤组织清晰可见， 尾部注射外渗污染； PD-L1 mAb阻 说明书 4/5 页 6 CN 111320675 A 6 断组， 可见肿瘤组织显像明显抑制， 证明了实施例1制备得到的99mTc-SKI的PD-L1靶向特异 性。 0068 三、 99mTc-SKI三阴性乳腺癌小鼠模型生物分布 0069 48h显像结束后， 眼球取血后， 颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠。 手术剥离肿瘤组织， 并取 其主要脏器组织(心脏、 肝脏、 脾脏、 肺脏、 肾脏、 胃壁、 小肠壁、 膀胱、 股骨、 肌肉)， 漂洗后， 称 重并记录各脏。

28、器质量； 测定各器官或组织以及血液的放射性计数， 计算各组织器官每克组 织经标准源校正后的核素探针摄取值。 0070 结果如图6所示， 由图可见， 除肾脏因该显像剂经泌尿系排泄所致放射性含量最高 外， 肿瘤组织对该显像剂摄取较高， 也证明了该显像剂具有良好的生物学特征。 0071 实施例4、 生物安全性结果 0072 一、 急性毒性反应 0073 将10只健康Babl/c裸鼠随机分为实验组和对照组， 每组5只。 按照2010年 中国药 典 规定， 实验组每只裸鼠经鼠尾静脉注射7.4MBq(200 Ci， 100 l)的实施例1制备得到的 99mTc-SKI溶液一次。 对照组经鼠尾静脉注射100。

29、 l生理盐水。 密切观察注射后两组小鼠饮食 饮水、 呼吸、 行为活动、 粪便及体重变化， 尤其死亡等严重不良反应情况。 0074 注射实施例1制备得到的99Tcm-SKI溶液后一周内， 实验组小鼠未出现惊厥、 步伐不 稳、 四肢瘫软、 呼吸抑制、 哮喘等不良反应， 更无死亡情况出现； 体重未发生明显改变， 且饮 水量与对照组小鼠无差别。 0075 二、 热原试验 0076 3只符合要求的新西兰大耳白兔， 测定其基础体温后的15min内， 由其耳缘静脉缓 慢注射已预热至约38的实施例1制备得到的99mTc-SKI溶液0.5ml， 注射后每隔30min测量 其肛内温度1次， 肛温计插入深度为6cm。

30、， 时间2.5min， 共测量2次， 两次体温之差不超过0.2 ， 以两次体温的平均值作为该兔的正常体温。 三只新西兰大耳白兔共测6次， 每只新西兰 大耳白兔2次体温中最高的一次减去正常体温， 即为该兔体温的升高温度。 0077 注射实施例1制备得到的99Tcm-SKI溶液后， 在初试3只家兔中， 体温升高均低于0.6 ， 并且3只家兔体温升高总和低于1.4， 因此热原检查符合 中国药典 规定。 说明书 5/5 页 7 CN 111320675 A 7 安徽医科大学第二附属医院 放射性锝标记的PD-L1靶向多肽及其制备方法与应用 GNCLN200568 1 PatentIn version 3.5 1 22 PRT Artificial sequence 1 Ser Gly Gln Tyr Ala Ser Tyr His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Gly Gly Ser Lys 20 序列表 1/1 页 8 CN 111320675 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 111320675 A 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 111320675 A 10 图5 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 111320675 A 11 。