春兰CgWRKY11基因及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010298691.3 (22)申请日 2020.04.16 (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159号 (72)发明人 胡凤荣徐子涵王连平刘倩 黎猛 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 王翠翠 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(201。

2、8.01) A01H 6/20(2018.01) (54)发明名称 一种春兰CgWRKY11基因及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种春兰CgWRKY11编码基因 及其应用，CgWRKY11基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示， 其表达蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。 本发明通过对春兰栽培品种 宋梅 CgWRKY11基因的克隆与鉴定， 基因表达分析， 并 验证其功能， 发现CgWRKY11转基因拟南芥在幼苗 期， 与野生型拟南芥WT相比，CgWRKY11植株整体 矮小， 长势最弱， 表现为叶片较小， 叶片稍黄且有 早衰的趋势， 营养生长周期延长， 说明基因可能 抑制了植株的。

3、营养生长， 导致营养缺乏而延迟开 花， 可见该基因可能在兰花花性状改良方面有广 泛的用途。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 111304222 A 2020.06.19 CN 111304222 A 1. 一种春兰CgWRKY11基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.权利要求1所述的春兰CgWRKY11基因的表达蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 示。 3.权利要求1所述的春兰CgWRKY11基因在植物生产和育种中的应用。 4.含有权利要求1所述的春兰CgWRKY11基因的载体。 5.含有权利要求1所述的春兰CgWRKY11基因的宿主细胞。。

4、 权利要求书 1/1 页 2 CN 111304222 A 2 一种春兰CgWRKY11基因及其应用 技术领域 0001 本发明属于植物基因工程技术领域， 具体涉及一种春兰CgWRKY11基因及其应用。 背景技术 0002 兰科 （Orchidaceae） 是开花植物中最大科之一， 全世界含有25000多种， 约占所有 开花植物的10%。 春兰 （Cymbidium goeringii） 属于兰科兰属中的小花型地生兰种类， 其花 型奇特、 花色淡雅， 花香清幽， 叶姿优美， 观赏价值和经济价值极高。 春兰对生长环境要求较 高， 在生长过程中极易受到高温、 低温、 干旱等恶劣环境影响， 严重时，。

5、 会导致园艺观赏品质 下降， 甚至植株死亡。 因此， 研究植物应对非生物胁迫的分子机制以及鉴定具有抗逆功能的 基因对春兰育种和生产具有重要意义。 在植物细胞信号转导途径中， WRKY转录因子被认为 是植物生长和多种胁迫响应的关键枢纽， 为植物的遗传改良提供重要依据。 0003 WRKY转录因子是植物中最大的调节蛋白家族之一， 参与多种生理过程， 其中， 最突 出的是对生物和非生物胁迫的应激反应。 有报道表明WRKY基因可以增强植株对逆境胁迫的 耐受性。 向日葵HaWRKY76转基因植株对水涝胁迫表现出更强的抗逆性， 产量也明显增多。 AtWRKY25的过表达增强拟南芥的耐盐性。AtWRKY57。

6、在水稻中的过表达不仅提高了水稻的抗 旱性， 而且增强了其对盐和PEG的耐受性。 因此， 利用基因工程技术， 从春兰中克隆获得 CgWRKY11基因， 该基因在ABA胁迫下存在明显的表达差异， 因此将CgWRKY11基因转入植物 中， 极具应用前景。 0004 不同的植物， 即使是相同的基因族， 基因序列也是不同的， 即使是80%以上的基因 序列相同， 但是因为部分基因插入的位点不同， 将其转入植物中， 所起到的作用也是不同 的。 当外源基因进入染色体上， 产生了此基因编码的外源蛋白， 外源蛋白或酶通过一系列的 反应导致了其他酶或蛋白质活性的增强或者降低， 另外当外源基因嵌入在染色体的某个区 段。

7、时， 必将对整个染色体产生影响， 从而影响其他基因的活性或调控机制。 0005 即使插入的是同一个基因， 但是由于插入位点不同或者染色体组不同， 必然对所 在染色体产生影响， 进一步导致对所在染色体上的基因产生影响， 而基因微小的改变， 都有 可能影响其调控机制， 导致出现基因失活、 活性降低、 活性增强等改变， 也造成基因作用的 不同， 而基因的作用需要通过验证才能获得， 并不是通过推断就能得到。 发明内容 0006 发明目的： 针对现有育种技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种春兰 CgWRKY11基因。 本发明的另一目的是提供春兰CgWRKY11基因在兰花育种中的应用。 0007 技。

8、术方案： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下： 一种春兰CgWRKY11基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0008 所述的春兰CgWRKY11基因的表达蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0009 所述的春兰CgWRKY11基因在植物生产和育种中的应用。 0010 含有所述的的春兰CgWRKY11基因的载体。 说明书 1/8 页 3 CN 111304222 A 3 0011 含有所述的春兰CgWRKY11基因的宿主细胞。 0012 有益效果： 与现有技术相比， 本发明通过对春兰CgWRKY11基因的克隆与鉴定， 基因 的表达分析， 验证其功能，。

9、 发现过表达CgWRKY11基因的拟南芥植株在幼苗期， 与野生型拟南 芥WT相比， 与野生型拟南芥WT相比，CgWRKY11植株整体矮小， 长势最弱， 表现为叶片较小， 叶 片稍黄且有早衰的趋势， 营养生长周期延长， 可见该基因在兰花和其它植物生产、 育种中将 有广泛的用途。 附图说明 0013 图1是春兰CgWRKY11基因克隆和构建的过表达载体图； 图2 a图是CgWRKY11在春兰各组织中的表达情况， 其中， R表示根， P表示假鳞茎， L表示 叶， F表示花； b图是ABA胁迫下春兰CgWRKY11基因的表达情况； 图3 a图是酶切结果图， 其中， M： DL2000 Marker；C。

10、gWRKY11与pBI121连接后用XbaI和 SnaBI双酶切； b图是阳性重组子的筛选图， 其中， M： DL2000 Marker， 目的条带大小为996bp； 图4是转基因拟南芥植株PCR结果图， 其中， M： DL2000 Marker； 1： 以载体质粒DNA为阳性 对照； 2： 野生型DNA为阴性对照； 图5是转CgWRKY11基因植株与野生型拟南芥植株株型比较图， 图中WT， 野生型拟南芥； 11， 转CgWRKY11基因的不同株系； 图6是转CgWRKY11基因植株与野生型拟南芥在ABA胁迫下的表达量； 图7是转CgWRKY11基因植株根长变化图； WT： 普通野生型拟南芥；。

11、 横坐标代表基因号； 纵 坐标代表根长 （cm） ； ABA的浓度单位 （ M） 。 具体实施方式 0014 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 0015 实施例1 本实施例所采用的材料是春兰 宋梅 叶片， 采后速冻于液氮中， 超低温冰箱 （-80） 保 存。 0016 1） 春兰叶片总RNA的提取 按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行， 具体操作为： 将超低温冻存的春兰叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中， 用研杵研磨组织， 其间不 断加入液氮， 直至研磨成粉末状； 将研磨成粉状的样品加入到含有450 l Buffer PE 的 1.5 mL灭菌 tube中， 用移液器反复。

12、吹打直至裂解液中无明显沉淀； 将裂解液12,000 rpm， 4 离心5min； 将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌tube 中。 加入上清液 1/10体积的 Buffer NB， Vortex 振荡混匀， 12,000 rpm， 4离心5 min； 将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌 tube 中， 加入450 L的 Buffer RL， 使用移液枪将溶液混合均匀； 加入混合液1/2 体积的无水乙醇， 使用移液枪将溶液混合均匀后， 立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中； 12,000 rpm， 离心1min， 弃滤液， 将RNA Spin Column 放回到2 m。

13、l Collection Tube 中； 将500 L的 Buffer RWA 加入至RNA Spin Column 中， 12,000 rpm 离心30s， 弃滤 液； 600 L的Buffer RWB 加入至RNA Spin Column中， 12,000 rpm 离心30s， 弃滤液； 向RNA Spin Column膜中央加入50 L DNase I 反应液， 室温静置15min； 向RNA Spin Column膜中 说明书 2/8 页 4 CN 111304222 A 4 央加入350 L的Buffer RWB， 12,000 rpm离心30s， 弃滤液； 将 RNA Spin C。

14、olumn 重新安置 于2mL Collection Tube 上， 12,000 rpm 离心2min； 将 RNA Spin Column 安置于1.5 mL 的RNase Free Collection Tube上， 在RNA Spin Column 膜中央处加入50 L的 RNase Free dH2O室温静置5min， 12,000 rpm 离心2min洗脱RNA。 所得RNA经浓度和纯度检测后存 于-80冰箱保存备用。 0017 吸取2 L RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测， 结果显示28S和18S条带较为清晰， 28S 条带亮度约为18S的两倍， RNA质量较好。 通过微量核算蛋。

15、白测定仪检测RNA纯度， OD260/OD280 为2.05， OD260/OD230为2.03， 完整性较好， 可用于反转录。 0018 2） 第一链cDNA的合成 以所得到的的总RNA为模板， 使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录， 使用Oligo(dT)作 为锚定引物， 反转录合成第一链cDNA。 具体操作如下： 在离心管中配制按照下列模板RNA/引物的顺序配制混合物， 总量为10 L： 模板1 g， Oligo(dT) Primer(50 M) 1 L， dNTP Mixture(10mM each) 1 L ,剩余体积用RNase-free ddH2O补齐。 65保温5min后， 。

16、冰上迅速冷却； 将该离心管离心， 使离心管中的混合物均沉于 管底。 在新的离心管中配制反转录反应液 （20 L） ： 上述变性后反应液10 L， 5PrimeScript Buffer 4 L， RNase Inhibitor(40U/ l) 0.5 L， PrimeScript RTase(200 U/ l) 1 L， RNase Free dH2O补齐20 L。 缓慢摇匀， 在PCR仪上， 30保温10min， 42保温30min， 95保 温5min使酶失活， 冰上放置， 得到cDNA溶液。 0019 3） 目的基因引物的设计及克隆 根据现有的春兰转录组测序数据， 利用其它物种的WRKY。

17、相关基因序列进行Blast同源 比对。 利用Oligo6.0， Prime5.0设计相应引物， 引物序列为： CgWRKY11-F： 5- ATGGCAGTTGATCTAATCGGCTA -3， CgWRKY11-R： 5- TCAGATCTGGCGATGGGTGT -3。 0020 以cDNA第一链为模板， 利用PrimerStar Max高保真酶进行春兰CgWRKY11基因的克 隆。 PCR扩增体系 （50 L） 为： 25 lL PrimerStar Max， 2 L Forward Primer， 2 L Reverse Primer， 2 L Template DNA， 19 L d。

18、dH2O。 PCR程序为： 反应条件为94预变性3min， 98变 性10s， 60退火5s， 72延伸30s， 32个循环， 72总延伸5min， 16保温。 0021 PCR反应完成后， 取全部PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切割目的片段， 凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。 采用天根公司的DNA凝胶回收试剂盒， 进行目的片段纯化 回收， 具体操作为： 向吸附柱CA2中 （吸附柱放入收集管中） 加入500 L平衡液BL， 12000rpm离 心1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 将单一目的条带从琼脂糖凝胶 中切下， 放入干净的离心管中， 称取重量； 向胶块。

19、中加入等体积溶液PN （如果凝胶为0.1g， 其 体积可视为100 L， 则加入100 L PN溶液） ， 50水浴放置， 其间不断温和上下翻转离心管， 直至胶块完全溶解； 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中， 室温放置2min， 12000rpm离 心1min， 倒掉收集管中废液， 将吸附柱CA2放入收集管中； 向吸附柱CA2中加入600 L漂洗液 W， 12000rpm离心1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放回收集管中； 12000rpm离心2min， 尽量除尽漂洗液， 将吸附柱置于室温放置5min， 彻底晾干； 将吸附柱放到一个干净离心管 中， 向吸附膜中间位置悬空滴加30 。

20、L ddH2O， 室温静置2min， 12000rpm离心2min收集DNA溶 液。 取2 L回收纯化后的产物， 使用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。 说明书 3/8 页 5 CN 111304222 A 5 0022 4） 目的片段与载体连接 克隆载体为全式金公司的pEASY-Blunt载体， 进行连接反应， 连接体系 （5 L） ： 4 L PCR 纯化产物， 1 L pEASY-Blunt Vector， 轻轻吸打混匀后， 室温放置5min， 将离心管置于冰上。 0023 5） 连接产物的转化 从超低温冰箱中取出感受态细胞Trans5 菌株， 置于冰上融化。 吸取5 L的过夜连接产 物加入到。

21、100 L感受态细胞中； 将离心管置于冰上冰浴30 min； 42水浴锅中水浴， 热激90 s， 期间不要摇动； 后立即置于冰上冰浴2 min； 在超净台中加入800 L无抗生素的液体培养 基， 37、 180 rpm摇1h复苏； 4000 rpm 离心3 min， 吸去800 L上清； 将沉淀的菌体重悬， 涂 于LB平板 （Amp的浓度为100 mg/L） ， 37培养过夜。 0024 6） 重组质粒的筛选及验证 挑取在含有抗生素 （Amp） 的LB固体培养基上过夜生长的单菌落， 接种到含有同样抗生 素的750 L的LB液体培养基中。 200 rpm， 37过夜培养。 0025 PCR扩增体。

22、系为： 10uL Green TaqMix， 1 l M13-F/R， 1 L菌液， 7 L ddH2O补充到20 L。 0026 PCR程序为： 9410min； 9430 s， 5530 s， 721 min， 30 cycles； 725 min； 16forever。 0027 吸取5L的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。 验证后， 将条带大小正确的菌 液样品委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序， 测序引物为通用引物M13F/R。 测序结果在 NCBI上进行比对分析。 0028 根据对测序结果的分析， 最终确定克隆得到1个春兰WRKY编码基因， 命名为 CgWRKY11基因， 其核苷。

23、酸序列如SEQ ID NO.1所示，CgWRKY11基因编码长度为996bp， 含有 ATG起始密码子和TGA终止密码子， 其中ORF全长为996bp， 编码331个氨基酸的蛋白质， 该蛋 白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0029 实施例2 研究结果表明WRKY11基因在春兰中各个组织器官中均有表达 （图2a） ， 但是该基因在春 兰花中的表达量最高， 说明该基因在花中功能活跃。 通过对春兰ABA胁迫处理的叶片进行表 达分析 （图2b） ， 证明CgWRKY11基因在春兰叶片的ABA胁迫响应中起着重要的调控作用。 0030 本实施例所用的植物材料为拟南芥(Arabidopsis t。

24、haliana)Col （Columbia） 野生 型种子。 0031 本实施例所用的大肠杆菌菌株为Trans5 ； 农杆菌菌株为GV3101， 分别用于转化拟 南芥； 试验中所用植物表达载体为pBI121。 所用菌株分别购自全式金生物公司和普利斯生 物公司。 0032 1）CgWRKY11基因过表达载体的构建 将实施例1获得的CgWRKY11基因ORF全长序列与植物表达载体pBI121进行连接， 构建的 载体如图1。 0033 2） 质粒的提取： 按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒， 具体步骤如下： 取过夜培养的10mL菌液， 12000 rpm离心1min， 去掉上清液； 取500 。

25、L P1溶液 （含RNase A） 加至留有菌体沉淀的离心管中， 使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀； 取500 L P2溶液加至离 说明书 4/8 页 6 CN 111304222 A 6 心管中， 温和上下翻转时菌体裂解充分， 取700 L P3溶液加至离心管中， 立即温和上下翻 转， 充分混匀， 当出现白色絮状沉淀后， 12000rpm离心10min； 取500 L平衡液BL加至吸附柱 CP4中， 12000rpm离心1min， 弃掉收集管中的废液， 将吸附柱放回收集管， 将收集的上清液分 批加入过滤柱CS中， 12000rpm离心2min， 小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱CP4 中， 。

26、12000rpm离心1min， 弃掉收集管中的废液， 将吸附柱CP4放回收集管； 取500 L去蛋白液 PD加至吸附柱CP4中， 12000rpm离心1min， 弃掉收集管中废液， 将吸附柱CP4重新放回收集 管； 取600 l 漂洗液PW （含无水乙醇） 加至吸附柱CP4中， 12000rpm离心1min， 弃掉收集管中 的废液， 将吸附柱CP4放回收集管， 12000rpm离心2min， 去除吸附柱中残余的漂洗液； 将吸附 柱CP4移至新的1.5ml离心管中， 向吸附膜中间加入60 L ddH2O； 室温静置2min， 12000rpm离 心1min， 离心管中收集的溶液即为质粒。 最后测。

27、定质粒浓度， 为下一步实验做准备。 0034 3） 特异酶切位点的添加 以cDNA为模板， 通过PCR方法在目的基因的两侧添加特异性酶切位点。 春兰CgWRKY11基 因两侧添加XbaI和SnaBI酶切位点。 PCR反应体系、 程序及所使用引物如下： PCR扩增体系 （50 L） ： 25 L PrimerStar Max， 2 L Forward Primer， 2 L Reverse Primer， 2 L Template DNA， 19 L ddH2O。 PCR程序为： 反应条件为94预变性3min， 98变 性10s， 60退火5s， 72延伸30s， 32个循环， 72总延伸5mi。

28、n， 16保温。 0035 所使用的引物序列： CgWRKY11-XbaI-F： 5-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGCAGTTGATCTAATCGGCT -3， CgWRKY11-SnaBI-R： 5- TCACACAAACGGTGATACGTAGATCTGGCGATGGGTGTCG-3。 0036 将得到的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离， 使用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒进行回收纯化， 将回收后的产物与pBI121载体连接， 构建表达载体。 0037 4） 双酶切反应 将提取的pBI121质粒用XbaI和SnaBI在37条件下酶切15min， 电泳回收线性载体。

29、， -20 保存备用。 双酶切反应体系为50 L： pBI121质粒 20 L， 5buffer 5 L， XbaI 1 L， SnaBI 1 L， ddH2O 23 L。 酶切结果如图3a所示， 其中， M： DL2000 Marker； 1：CgWRKY11， 与pBI121连 接后用用XbaI和SnaBI双酶切。 0038 5） 连接反应 琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121， 根据所检测出的纯度 和浓度， 按连接体系加入各试剂。 其中， 目的片段分子数： 载体分子数=3:1-5:1， 连接反应体 系为： 线性化pBI121载体7 L， 插入片段3 L， 5CE 。

30、II buffer 4 l， Exnase II 2 l， ddH2O Up to 20 L。 在37下反应30min， 放置于冰上降温冷却。 0039 6） 连接产物转入大肠杆菌 将目的片段与载体pBI121连接后的产物转入大肠杆菌Trans5 感受态细胞中， 方法同 实施例1。 0040 7） 重组子的鉴定 挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素 （卡那霉素） 的LB液体培养基中， 37、 200 rpm 震荡培养过夜。 使用目的基因全长引物进行菌液PCR， 以筛选阳性克隆。 筛选后的阳性克隆 送南京金斯瑞公司测序。 同时使用天根质粒提取试剂盒提取质粒并进行酶切验证， 判断酶 切后片段大小是否。

31、一致。 结果如图3b所示， 为目的引物PCR结果， 条带大小为996bp。 说明书 5/8 页 7 CN 111304222 A 7 0041 8） 农杆菌感受态细胞的制备与转化 本实施例利用农杆菌GV3101来制备农杆菌感受态， 进行拟南芥的侵染实验； 农杆菌感 受态制备过程为： 挑取已经活化好的农杆菌单菌落， 接种于5mL液体LB培养基中， 28、 250 rpm摇菌培养20-24 h； 吸取2mL菌液， 接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中， 28、 250 rpm摇菌至OD600值为0.8左右； 将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30 min， 4、 5000 rpm离 心5 min。

32、， 弃上清； 加入10mL经预冷的0.1 mo1/L CaCl2溶液， 充分悬浮沉淀的菌体； 4， 5000 rpm离心5 min， 弃去上清； 加入1mL预冷的20 mmo1/L CaCl2溶液充分悬浮菌体， 即得 到所要制备的GV3101感受态细胞， 用离心管将其分装成100L/管， 迅速加入20%的无菌甘 油， -80放置保存。 0042 重组子的农杆菌转化： 冰浴， 使农杆菌感受态细胞融化， 将1-5 l经回收纯化后的 质粒加入到200 l的农杆菌感受态中， 轻轻混匀， 冰浴30 min； 使用液氮速冻l min， 37水 浴锅中热击1-5 min， 迅速置于冰上1-2 min； 加入。

33、800 l不含任何抗生素的LB培养基， 28 ， 100 rpm复苏2-4 h； 4000 rpm离心3 min， 吸掉部分培养基； 使用移液枪充分混匀剩余 的菌液， 后涂抹于添加 50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素 （EHA105） 或100 mg/L的庆大霉 素 （GV3101） 的固体 LB 培基上； 28倒置培养30-48 h。 0043 农杆菌重组子的鉴定： 从平板培养基上挑取长出的单菌落， 接种于含有相应抗生 素的液体培养基中； 28， 220 rpm培养过夜； 使用35S-F分别搭配如下引物进行菌液PCR， 引 物序列为： 35S-F： 5-GATAGTGGAAAAGG。

34、AAGGTG-3， 35S-CgWRKY11-R： 5- TCACACAAACGGTGATACGTAGATCTGGCGATGGGTGTCG -3。 0044 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测， 鉴定是否含有目的片段； 鉴定出的阳性克隆， 扩大培养后， 采用碱裂解法提取质粒， 进行双酶切验证； 鉴定后的阳性克隆加入适量无菌甘 油， 于-80保存备用。 0045 9） 农杆菌介导的拟南芥的转化 采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中， 具体操作方法为： 拟南芥(col野生型)保持 健康生长状态至开花； 活化携带有目的基因的农杆菌EHA105菌株。 挑取单菌落， 接种于5mL 含有卡那霉素和链霉素的。

35、LB培养基上， 28、 250 rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊， 约8-10 h； 吸 取1mL菌液， 接种到三角瓶中(50mL )摇菌24 h， 至OD值约为0.8左右； 将菌液5000 rpm在室 温下离心5 min， 去除上清后收集菌体， 用5%蔗糖溶液悬浮； 浸泡前， 加入SilwetL-77， 浓度 为0.05%(500 l/L)， 晃出泡沫； 将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15-30 s， 期 间轻轻晃动； 将浸过的拟南芥平躺在托盘中， 用保鲜膜覆盖， 锡箔纸密封避光， 4， 放置24 h； 揭开锡箔纸， 正长条件下培养， 当种子成熟时停止浇水。 0046 5%蔗糖溶液重悬液。

36、各成分如下： MS培养基， 添加蔗糖50g/L， MES 0.5g/L， Silwet- 77 500l/L。（注意： 配制后pH调制5.8， 菌液离心重悬后再加入SilwetL-77； 重悬液和菌液 的换算关系为： 重悬液用量： 菌液OD*菌液体积=0.8*重悬液） 。 0047 10） 转基因植株的筛选 收集的T1代转基因拟南芥的种子， 用酒精和升汞进行灭菌， 步骤为： 取适量获得的转基 因种子放置于1.5mL离心管中， 用75%酒精浸泡30 s； 10%次氯酸钠灭菌2 min 30s； 无菌水冲 洗3-4次， 第一次冲洗后更换经高压灭菌的新离心管； 用0.1%琼脂糖溶液悬浮。 说明书 6。

37、/8 页 8 CN 111304222 A 8 0048 将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素 （卡那霉素50 mg/L和头孢霉素 100 mg/L） 的1/2MS固体培养基上。 22， 光照培养。 大约一周后将培养基上可以正常生长的 拟南芥移植与土中， 继续生长。 0049 11） 转基因植株的检测 取适量拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片， 采用CTAB法提取DNA， 具体操作步骤为： 将适 量叶片置于灭菌处理后的2mL离心管中， 加入700 l的CTAB溶液， 用球磨仪彻底研磨， 65 静置10 min； 加入等体积的氯仿： 异戊醇， 数次颠倒使其混合均匀， 14000 rpm离心10 。

38、min； 将上清移至新的无菌离心管中， 加入等体积的异丙醇， 颠倒混匀数次， 室温静置2 min， 14000 rpm离心10 min， 倒掉上清； 加入70%的无水乙醇， 使用移液枪吹打洗涤两次， 14000 rpm离心1min， 弃去上清； 吹干表面液体， 加入20 L ddH2O溶解。 取上述提取的转基因和野 生型拟南芥的DNA， 用CgWRKY11基因的特异性引物进行PCR检测。 0050 春兰CgWRKY11基因转化拟南芥后， 获得过表达CgWRKY11基因拟南芥株系。 以重组 质粒为阳性对照， 以野生型为阴性对照， 以水为空白对照， PCR结果如图4所示， 阳性对照为 CgWRKY。

39、11基因载体PCR结果， 阴性对照以水为代替模板， WT是以野生型拟南芥DNA为模板。 0051 12） 表型观察 不同代转基因植株的获得： 收获的转基因T1代种子经灭菌， 筛选培养后， 再移植于营养 土中， 22， 16 h光照/8h黑暗培养； 经检测后保留初步确认的转基因植株， 待成熟后收获T1 代种子， 进行编号， 得到T2代； 同T1代一样， 将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培 养基上， 置于22， 连续光照； 10d左右， 对不同编号的T2代种子进行存活率统计， 选取存活 比例为75%的植株移植与营养土中按照22， 16 h光照/8h黑暗培养， 并取叶片进行阳性检 测； 阳性。

40、T2代植株继续进行编号， 收集种子， 得到T3代种子； 将种子灭菌后， 用筛选培养基筛 选， 置于光下连续光照培养； 10d左右， 观察不同编号的T3代植株， 全部存活并且没有出现分 离的为T3代纯合植株。 0052 对得到的转基因株系分批次进行观察。 0053 （1） 选取其中表型明显的转基因植株进行观察， 如图5所示， 结果发现与野生型拟 南芥相比， 转基因拟南芥植株生长发育缓慢，CgWRKY11转基因植株在幼苗期， 与野生型拟南 芥WT相比，CgWRKY11植株整体矮小， 长势最弱， 表现为叶片较小， 叶片稍黄且有早衰的趋势， 营养生长周期延长， 说明基因可能抑制了植株的营养生长， 导致。

41、营养缺乏而延迟开花。 0054 （2） 对转基因拟南芥进行ABA胁迫处理， 将经过消毒处理的转基因拟南芥种子和野 生型拟南芥种子播种于1/2MS培养基上生长四天左右， 转移到添加100 M ABA的1/2MS培养 基上， 生长10天左右照相观察拟南芥根长， 并记录数据,见图6， 结果发现，CgWRKY11的表达 量先上升后下降， 在转基因拟南芥植株中不同时刻均有不同程度的差异表达， 而在普通野 生型拟南芥植株 （WT） 中的表达量几乎均为0， 实验结果证明CgWRKY11基因已成功转入拟南 芥中； 如图7， 在ABA胁迫条件下， WT的根长约下降了11mm， CgWRKY11平均下降了18 m。

42、m， 结果 显示CgWRKY11转基因拟南芥根长的降幅比WT要大， 说明CgWRKY11对ABA敏感， 且可能加速了 ABA对根发育的抑制作用。 0055 本实施例将过表达的春兰CgWRKY11基因的35S:CgWRKY11转入模式植物拟南芥中， 进行表型观察和分析。 从结果可以看出， 过表达35S: CgWRKY11的拟南芥T2代植株出现生长 发育迟缓， 植株叶片变小；CgWRKY11超表达可能通过调控ABA信号通路相关基因的表达来促 说明书 7/8 页 9 CN 111304222 A 9 进ABA对根发育的抑制作用。 说明书 8/8 页 10 CN 111304222 A 10 序列表 。

43、南京林业大学 一种春兰CgWRKY11基因及其应用 8 SIPOSequenceListing 1.0 1 996 DNA 春兰Cymbidium goeringii 1 atggcagttg atctaatcgg ctacgcgaag atggacgacc agatcacaat ccaggaggcg 60 gcggctgccg gtatccggag catggaaaac ctaatctttc agctcaatcg ccaacatcag 120 aagtccacgt catcttcagc agctgcagcg accatcgatt gccgggaaat tgccgatcac 180 accgt。

44、ctcaa agttcaagaa gatgatctcc attctaaatc gcaccggcca cgcccgattc 240 cgccgcggcc cttccgtcca aattcttccc gcttctgtaa cacctgcgcc gcaggtagcg 300 gctccgcatc tggcgccagt gatggcggct ccggtcgtcc ctttacagag cctgacgtta 360 gattttacca agccaagctc cgtcggcggc ggatccactg atctagccat cgttgccgca 420 tcatcgggaa aatacgttaa gga。

45、gagcttc agcatctcga cgccaatctc ttcggcgaac 480 tcatccttta tgtcatcaat cactggcgat ggaagtgtct ccaatggtcg ccagggcgga 540 acgacctctc ttcttctccc ttcagtgccc gccatctctg ccggcggcgt cgttgccgga 600 aaacctccgc tagcagccta caagaaacgc tgccacagcc acgcccactc agaagatttt 660 actgggaagt tcaccgccaa cggcggtcgc tgccactgtt c。

46、caagcggcg aaagaatcgc 720 gtgaagagga cgatacgggt tccagcaatc agcgcaaaga tggccgatat cccgtccgac 780 gaatactcat ggcgaaagta tggtcagaag ccgataaagg gctctccata cccgagaggc 840 tactacaagt gcagcagcct gcgcggttgc ccggccagga aacacgtgga acgcgcgccg 900 gacgatccct cgatgctaat cgtcacctac gagggcgagc accgccactc ccagccctcc。

47、 960 gatgctctcg tcttcgacac ccatcgccag atctga 996 2 331 PRT 春兰Cymbidium goeringii 2 Met Ala Val Asp Leu Ile Gly Tyr Ala Lys Met Asp Asp Gln Ile Thr 1 5 10 15 Ile Gln Glu Ala Ala Ala Ala Gly Ile Arg Ser Met Glu Asn Leu Ile 20 25 30 Phe Gln Leu Asn Arg Gln His Gln Lys Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ala 35 40 。

48、45 序列表 1/3 页 11 CN 111304222 A 11 Ala Ala Thr Ile Asp Cys Arg Glu Ile Ala Asp His Thr Val Ser Lys 50 55 60 Phe Lys Lys Met Ile Ser Ile Leu Asn Arg Thr Gly His Ala Arg Phe 65 70 75 80 Arg Arg Gly Pro Ser Val Gln Ile Leu Pro Ala Ser Val Thr Pro Ala 85 90 95 Pro Gln Val Ala Ala Pro His Leu Ala Pro Val 。

49、Met Ala Ala Pro Val 100 105 110 Val Pro Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Phe Thr Lys Pro Ser Ser Val 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Thr Asp Leu Ala Ile Val Ala Ala Ser Ser Gly Lys 130 135 140 Tyr Val Lys Glu Ser Phe Ser Ile Ser Thr Pro Ile Ser Ser Ala Asn 145 150 155 160 Ser Ser Phe Met Ser Ser Ile Thr Gly 。

50、Asp Gly Ser Val Ser Asn Gly 165 170 175 Arg Gln Gly Gly Thr Thr Ser Leu Leu Leu Pro Ser Val Pro Ala Ile 180 185 190 Ser Ala Gly Gly Val Val Ala Gly Lys Pro Pro Leu Ala Ala Tyr Lys 195 200 205 Lys Arg Cys His Ser His Ala His Ser Glu Asp Phe Thr Gly Lys Phe 210 215 220 Thr Ala Asn Gly Gly Arg Cys His 。