腺病毒载体及其构建方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010263028.X (22)申请日 2020.04.07 (71)申请人 南昌大学第一附属医院 地址 330006 江西省南昌市东湖区永外正 街17号 (72)发明人 彭洪薇魏筱华张洁王芸芸 刘红景艳傅群 (74)专利代理机构 北京东岩跃扬知识产权代理 事务所(普通合伙) 11559 代理人 谷岳 (51)Int.Cl. C12N 15/861(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/34(2006.01) C12N 5/10(2006。

2、.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种腺病毒载体及其构建方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种腺病毒载体， 其特征在 于， 所述腺病毒载体包含CXCR4启动子序列或与 其至少有80同源性的序列， 和位于所述CXCR4 启动子序列下游的人sTRAIL基因序列或与其至 少有80同源性的序列。 本发明通过构建CXCR4 启动子启动sTRAIL表达的顺反子片段插入腺病 毒系统中， 此种结构有利于借助CXCR4启动子在 乳腺癌细胞中的转录活性调控sTRAIL蛋白的表 达， 随着腺病毒的复。

3、制在肿瘤局部富集sTRAIL蛋 白， 通过腺病毒的旁观者效应克服肿瘤细胞对 sTRAIL的耐受， 增强本系统对CXCR4(+)乳腺癌细 胞的杀伤作用， 进而促进对乳腺癌转移的治疗， 并减少对周围正常组织细胞的损伤。 权利要求书1页 说明书16页 序列表1页 附图3页 CN 111471715 A 2020.07.31 CN 111471715 A 1.一种腺病毒载体， 其特征在于， 所述腺病毒载体包含CXCR4启动子序列或与其至少有 80同源性的序列， 和位于所述CXCR4启动子序列下游的人sTRAIL基因序列或与其至少有 80同源性的序列。 2.根据权利要求1所述的腺病毒载体， 其特征在于，。

4、 所述CXCR4启动子序列如SEQ ID No.1所示。 3.根据权利要求1所述的腺病毒载体， 其特征在于， 所述人sTRAIL基因序列如SEQ ID No.2所示。 4.根据权利要求1所述的腺病毒载体， 其特征在于， 所述腺病毒载体还包括： a)增强复制的基因； b)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸； c)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因； d)用于调节肿瘤微环境的基因； 和/或 e)报告基因。 5.根据权利要求1-4任意一项中所述的腺病毒载体， 其特征在于， 所述腺病毒载体为溶 瘤腺病毒载体， 所述溶瘤腺病毒载体优选为用于杀灭乳腺癌细胞的腺病毒载体。 6.如权利要求1-5任意一。

5、项中所述的腺病毒载体的构建方法， 其特征在于， 将所述 CXCR4启动子序列或与其至少有80同源性的序列， 和人sTRAIL基因序列或与其至少有 80同源性的序列按顺序插入腺病毒骨架质粒中， 经包装、 纯化后得到所述腺病毒载体。 7.一种组合物， 其特征在于， 所述组合物包含如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒 载体， 以及药学上可接受的载体。 8.一种核酸分子， 其特征在于， 所述核酸分子编码如权利要求1-5任意一项中所述的腺 病毒载体。 9.一种细胞， 其特征在于， 所述细胞包含如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载 体。 10.如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载体、 如权利要求。

6、7所述的组合物、 如权利 要求8所述的核酸分子或如权利要求9所述的细胞在制备治疗乳腺癌的药物中用途， 优选 地， 所述乳腺癌为转移性乳腺癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111471715 A 2 一种腺病毒载体及其构建方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及基因治疗领域， 特别涉及一种腺病毒载体及其构建方法和用途。 背景技术 0002 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一， 其发病率逐年升高。 据调查， 近年来， 乳腺癌 已跃居江西省城市女性居民发病首位， 严重威胁着我省乃至全国女性的健康。 0003 尽管目前乳腺癌的预后已得到了很大改善， 但乳腺癌发生远处转移的现象仍较为 常见。 据报道。

7、， 在接受治疗的早期乳腺癌患者中， 2050在5年内会发生远处转移， 其中 肺转移是乳腺癌最常见的转移部位之一。 一旦发生转移， 患者的5年生存率仅有大约25。 目前的临床治疗策略对乳腺癌转移的治疗效果不佳， 主要是因为缺乏对乳腺癌转移灶的选 择性。 虽然近年发展的针对HER2的赫赛汀和针对雌激素受体的靶向治疗方案对原发肿瘤具 有良好的疗效， 但对于转移病灶的疗效却不甚理想， 主要是因为上述靶向药物半衰期短， 在 乳腺癌尤其是乳腺癌的转移病灶局部难以维持有效的治疗浓度， 并且临床上均已发现了针 对上述药物的耐药现象。 因此， 寻找新的靶向治疗乳腺癌转移病灶的方案迫在眉睫。 0004 基因治疗是。

8、一类新兴的在转录水平实现靶向特异性的治疗方法， 其中腺病毒载体 由于不需要整合至宿主基因组、 具有较好的安全性， 且在复制过程中具有溶细胞作用， 已成 为肿瘤基因治疗中最常用的载体之一。 0005 趋化因子受体CXCR4Chemokine(C-X-C motif)Receptor 4是一类G蛋白偶联七 次跨膜受体， 是近年来发现的在肿瘤细胞中呈特异性高表达的蛋白之一， 它与多种肿瘤尤 其是乳腺癌的转移密切相关。 CXCL12是目前已知的唯一能与CXCR4结合并激活它的天然趋 化因子， CXCR4/CXCL12所构成的生物轴系统在生命过程的许多方面均发挥了作用， 并与肿 瘤的发生、 发展、 转移。

9、及HUMSCs的归巢等密切相关。 多项临床研究荟萃分析发现， CXCR4表达 水平高的乳腺癌组织具有淋巴结转移比例高、 高度分化、 进展快等恶性特征， 使其成为乳腺 癌转移治疗的一个潜在靶点。 对类乳腺癌干细胞进行流式分析也发现CD44+CD24-亚群细胞 CXCR4的表达更高， 并因此具有更强的侵袭性。 由此， 靶向CXCR4的治疗方案不仅有助于乳腺 癌转移的治疗， 对于清除乳腺癌干细胞可能也具有积极的意义。 0006 TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)为型跨膜蛋白， 是肿瘤坏死因子(TNF) 超家族的一员， 能在即使p53突变的情况下， 通过激活肿瘤细胞表面的死亡受体而诱导其凋 亡。

10、， 它的特点是可特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响， 其诱导凋亡的活性主 要依赖于TRAIL与功能性死亡受体DR4、 DR5的结合后激活细胞内的凋亡信号途径。 sTRAIL则 是TRAIL分子水解后的胞外区片段， 它具有和膜结合型TRAIL相类似的选择性诱导肿瘤细胞 凋亡的作用， 且sTRAIL分子量小， 更适于进行基因工程改造， 上述特性使得sTRAIL分子成为 肿瘤靶向治疗中理想的治疗性蛋白之一。 0007 sTRAIL虽然具有良好的肿瘤选择性， 但仍有部分肿瘤细胞对sTRAIL表现耐受， 具 体表现在乳腺癌方面为： sTRAIL虽可有效诱导乳腺癌高转移细胞MDA-MB-231细胞。

11、凋亡， 但 部分乳腺癌细胞如MDA-MB-361， MCF-7等对sTRAIL诱导的凋亡并不敏感。 因此， 需要寻找到 说明书 1/16 页 3 CN 111471715 A 3 一种方法来发挥sTRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用。 发明内容 0008 本发明的一个方面， 是针对现有技术中sTRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用弱并且会 产生耐受的问题， 提供了一种腺病毒载体及其构建方法和用途。 0009 本发明提供的技术方案为： 0010 一种腺病毒载体， 所述腺病毒载体包含CXCR4启动子序列或与其至少有80同源 性的序列， 和位于所述CXCR4启动子序列下游的人sTRAIL基因序列或与其至少有8。

12、0同源 性的序列。 0011 在本发明的一个实施方式中， 所述CXCR4启动子序列如SEQ ID No.1所示。 0012 在本发明的一个实施方式中， 所述人sTRAIL基因序列如SEQ ID No.2所示。 0013 作为优选， 在本发明的一个实施方式中， 所述腺病毒载体还可以包括： 0014 a)增强复制的基因； 0015 b)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸； 0016 c)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因； 0017 d)用于调节肿瘤微环境的基因； 和/或 0018 e)报告基因。 0019 作为优选， 在本发明的一个实施方式中， 上述腺病毒载体为溶瘤腺病毒载体， 更优 选。

13、地， 上述溶瘤腺病毒载体为用于杀灭乳腺癌细胞的腺病毒载体。 0020 本发明的另一个方面， 是提供了一种上述腺病毒载体的构建方法， 将所述CXCR4启 动子序列或与其至少有80同源性的序列， 和人sTRAIL基因序列或与其至少有80同源性 的序列按顺序插入腺病毒骨架质粒中， 经包装、 纯化后得到所述腺病毒载体。 0021 本发明的另一个方面， 是提供了一种组合物， 所述组合物包含上述腺病毒载体， 以 及药学上可接受的载体。 0022 上述腺病毒载体可以被变化成任意合适的形式， 例如， 包装成病毒颗粒的形式。 这 些都视为包含在本发明的保护范围之内。 其给药方式也可以为任意合适的方式， 例如， 。

14、注射 剂， 如瘤内注射、 静脉注射等。 所述药学上可接受的载体中还可以包括常规的添加剂， 如， 赋 形剂、 稳定剂、 防腐剂等。 0023 本发明的另一个方面， 是提供了一种核酸分子， 所述核酸分子编码上述腺病毒载 体。 0024 本发明的另一个方面， 是提供了一种细胞， 所述细胞包含上述腺病毒载体。 0025 所述细胞可以为哺乳动物细胞。 所述细胞可以是分离的细胞， 它们不存在于活体 动物中。 哺乳动物细胞可以为包括来自人、 小鼠、 大鼠、 仓鼠、 猴子、 兔子、 驴、 马、 绵羊、 牛和 猿的任何器官或组织的细胞。 优选地， 所述细胞是人细胞。 所述细胞可以是原代或永生化细 胞。 0026。

15、 本发明的另一个方面， 是提供了腺病毒载体、 上述组合物、 上述核酸分子或上述细 胞在制备治疗乳腺癌的药物中用途， 优选地， 所述乳腺癌为转移性乳腺癌。 0027 本发明的有益效果为： 0028 本发明通过构建CXCR4启动子启动sTRAIL表达的顺反子片段插入腺病毒系统中， 说明书 2/16 页 4 CN 111471715 A 4 此种结构有利于借助CXCR4启动子在乳腺癌细胞中的转录活性调控sTRAIL蛋白的表达， 随 着腺病毒的复制在肿瘤局部富集sTRAIL蛋白， 通过腺病毒的旁观者效应克服肿瘤细胞对 sTRAIL的耐受， 增强本系统对CXCR4(+)乳腺癌细胞的杀伤作用， 进而促进对。

16、乳腺癌转移的 治疗， 并减少对周围正常组织细胞的损伤。 附图说明 0029 图1为本发明实施例中的腺病毒载体的构建示意图； 0030 图2为CXCR4启动子荧光素酶报告载体构建图， 其中， A为载体构建示意图； B为 GV238荧光素酶报告载体酶切电泳图； C为携带CXCR4启动子的GV238荧光素酶报告质粒阳性 克隆鉴定结果图； D为阳性克隆质粒酶切鉴定结果图； 阳性克隆经测序鉴定、 比对， 证实已连 接上CXCR4启动子片段(-191+88)； 0031 图3为CXCR4启动子转录活性鉴定结果图， 其中， A为CXCR4启动子在乳腺癌细胞 MCF-7中的活性鉴定结果图； B为CXCR4启动。

17、子在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的活性鉴定结果 图； C为CXCR4启动子在乳腺正常上皮细胞MCF10A中的活性鉴定结果图； 上述图中SV40(猴空 泡病毒40启动子)为阳性对照； 0032 图4为CXCR4启动子驱动的腺病毒系统对乳腺癌细胞的杀伤活性结果图， 其中， A为 pAV-CXCR4promoter-sTRAIL-EGFP载体构建示意图； B为200MOI腺病毒感染乳腺癌细胞MDA- MB-231 48h后绿色荧光情况结果图； C为elisa检测腺病毒感染乳腺癌细胞48h后细胞上清 sTRAIL的表达情况结果图； D为腺病毒空载体感染乳腺癌细胞72h后凋亡情况结果图； E为 pA。

18、V-CXCR4promoter-sTRAIL-EGFP腺病毒载体感染乳腺癌细胞72h后凋亡情况结果图。 0033 序列说明 0034 SEQ ID No.1为本发明中CXCR4启动子的核酸序列； 0035 SEQ ID No.2为本发明中人sTRAIL的DNA序列。 具体实施方式 0036 本发明公开了一种腺病毒载体及其构建方法和用途， 本领域技术人员可以借鉴本 文内容， 适当改进工艺参数实现。 需要特别指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明， 并且相关人员明显能在不脱离本发 明内容、 精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与。

19、组合， 来实现和应用 本发明技术。 0037 在本发明中， 除非另有说明， 否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。 0038 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案， 下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。 0039 实施例1： CXCR4启动子荧光素酶报告基因载体的构建 0040 基因信息 0041 基因名称： CXCR4(NM_003467-promoter(-191-88) 0042 物种： Human 0043 构建示意图如图2的A所示。 说明书 3/16 页 5 CN 111471715 A 5 0044 1.质粒提取及酶切 0045。

20、 1)取冻存的GV238和测序正确T-PCXCR4菌液， 以1： 10的比例接种于10ml2-YT液体 培养基(含氨苄青霉素)， 37空气浴， 并振摇过夜。 0046 2)取3ml细菌培养物， 12000rpm离心1分钟， 尽量去除上清(分两次离心)。 0047 3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液I(事先已加入RNaseA)， 用移液器彻 底悬浮细菌沉淀。 0048 4)向离心管中加入250ul溶液II， 温和地上下翻转6-8次充分裂解。 0049 5)向离心管仲加入350ul溶液III， 立即温和地上下翻转6-8次， 充分混匀， 此时出 现白色絮状沉淀。 12000rpm离心10。

21、分钟， 用移液器小心将上清转移到吸附柱中， 不要吸出沉 淀。 0050 6)将吸附柱室温放置2分钟(加入上清)， 12000rpm离心1分钟， 将收集管中的废液 再加入吸附柱， 12000rpm再离心1分钟， 弃掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回离心管。 0051 7)向吸附柱中加入700ul漂洗液(已加入无水乙醇)， 12000rpm离心1分钟， 弃废液， 将吸附柱放入收集管中。 0052 8)向吸附柱中加入500ul漂洗液(已加入无水乙醇)， 12000rpm离心1分钟， 弃废液， 将吸附柱放入收集管中。 0053 9)12000rpm离心2分钟， 将吸附柱敞口置于室温数分钟。 0054。

22、 10)将吸附柱放入一个干净离心管中， 向吸附膜中央悬空滴加50ul经65水浴预 热的无菌去离子水， 室温放置5分钟， 12000rpm离心1分钟。 0055 11)为了增加回收效率， 离心管中的液体再加入吸附柱， 12000rpm离心1分钟再洗 脱一次。 0056 质粒的双酶切： 0057 将回收得到的pGL3-Basic和T-PCXCR4用XhoI和HindIII双酶切， 37水浴4小时。 0058 50 L反应体系 0059 0060 0061 将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1)， 切下目的片断进行DNA凝胶回收。 回收 的DNA片断置于-20保存， 取少许进行连接。 鉴定结果如图2的。

23、B所示。 0062 2.化学合成的目的基因CXCR4启动子序列 0063 CXCR4启动子序列如下或SEQ ID No.1所示。 0064 GGTACCTCACTACCGACCACCCGCAAACAGCAGGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGC CCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCTCGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCA TGCGCCGCGCTCGGAGCGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCTGCGGCAGCAGG 说明书 。

24、4/16 页 6 CN 111471715 A 6 TAGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGCCACCGCATCTGGAGAACCAGCGGTCTCGAG 0065 其中， 5 端下划线为KpnI酶切位点， 3 端下划线为XhoI酶切位点， 红色标记为目的 序列。 0066 3.携带CXCR4启动子双荧光素酶报告载体PCXCR4-Luc质粒的构建 0067 目的片段的双酶切： 0068 将回收得到的GV238和P-CXCR4用XhoI和Kpn|双酶切， 37水浴4小时。 0069 50 L酶切反应体系 0070 ddH2O40.5 l 10X buffer5 。

25、l 100BSA0.5 l 纯化的DNA质粒(1ug/ l)2 l KpnI(20U/ l)1 l XhoI(20U/ l)1 l Total50 l 0071 将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1)， 切下目的片断进行DNA凝胶回收。 0072 目的片段的胶回收： 0073 将上述酶切产物置于1琼脂糖凝胶中， 以1TAE为缓冲液进行水平电泳。 于紫外 光下从凝胶中切出300bp左右的条带， 用DNA胶回收试剂盒进行回收： 0074 1)将切下的琼脂糖凝胶块,放入1.5ml离心管中。 0075 2)称量胶块重量， 按每1mg琼脂糖加入3ul DR- Buffer的比例加入DR- Buffer， 。

26、均 匀混合后75水浴加热融化胶块， 约6-10分钟， 其间间断震摇， 使琼脂糖凝胶完全融化。 0076 3)再向上述胶块融化液中加入1/2体积量的DR-Buffer， 均匀混合。 将混合溶液 移入吸附柱中， 12000rpm/min离心1分钟； 将收集管中的液体重新加入吸附柱， 重复离心一 次， 弃收集管中滤液。 0077 4)将500 L的Rinse A加入吸附柱中， 12000rpm/min离心30秒， 弃收集管中滤液。 0078 5)将700 L的Rinse B加入吸附柱中， 12000rpm/min离心30秒， 弃收集管中滤液。 0079 6)重复步骤5)， 12,000rpm/min。

27、再离心2分钟。 0080 7)将吸附柱安置于一个新的1.5ml离心管上， 室温放置数分钟； 在吸附柱膜的中央 加入20ul去离子水， 室温静置5分钟后， 12000rpm离心1分钟洗脱DNA。 0081 8)琼脂糖凝胶电泳， 并贮存于-20。 0082 回收的DNA片断置于-20保存， 取少许进行连接。 0083 目的质粒的连接、 转化： 0084 将回收产物连入GV238载体： 0085 反应体系为10 L 0086 0087 4过夜。 说明书 5/16 页 7 CN 111471715 A 7 0088 连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞： 0089 0090 上述混合溶液冰浴5分钟后。

28、加入200ulDH5a感受态细胞， 轻混匀， 冰浴20分钟， 再置 于室温10分钟， 用涂布棒将混合液涂布于氨苄青霉素抗性的2-YT细菌培养板上， 37恒温 培养过夜。 0091 菌液PCR鉴定： 0092 挑取培养板上生长的克隆分别置于1ml 2-YT液体培养基(含氨苄青霉素)中， 37 空气浴， 并振摇2小时后取1ul菌液进行PCR反应： 0093 反应体系： 0094 0095 菌落PCR反应条件： 0096 以前面合成的CXCR4启动子基因片段为模板， 以P1： GGTACCTCACTACCGACC； P2： CTCGAGGCCGCTGGTTCT为上下游引物(带下划线部分为KpnI/X。

29、hoI限制性内切酶位点)。 0097 扩增体系： 0098 0099 扩增循环： 0100 94变性5分钟； 94变性30秒， 58退火30秒， 72延伸1分钟， 共35个循环； 72 延伸10分钟。 再加入1ulTaqDNA聚合酶， 继续72延伸20分钟， 在扩增产物3 末端加A。 0101 选取菌液PCR阳性菌落的菌液扩大至10ml 2-YT液体培养基(含氨苄青霉素)中， 37 空气浴， 并振摇过夜。 过夜培养后的菌液按1： 1的比例加入细菌冻存液置于-80冰箱保 说明书 6/16 页 8 CN 111471715 A 8 存， 并取少许送测序(invitrogen)。 鉴定结果如图2的C。

30、和D所示。 0102 阳性克隆质粒提取： 0103 选取阳性菌落， 37强烈振荡过夜， 至OD6001.0， 离心菌液； 采用质粒提取试剂盒 (北京赛百盛基因技术有限公司)提取。 其操作步骤如下： 0104 1)在细菌沉淀中加入100 l悬浮液， 振荡至彻底悬浮。 0105 2)加入150 l裂解液， 立即温和颠倒离心管5-10次以混匀， 室温静置4min。 0106 3)加入150 l中和液， 立即温和颠倒离心馆5-10次以混匀。 0107 4)12000g-13000g离心10min， 将上清液小心移入吸附柱， 静置3min， 离心15sec， 倒 掉收集管中的液体， 将吸附柱放入同一个收。

31、集管中。 0108 5)在吸附柱中加入600 l 80异丙醇， 离心15sec， 倒掉收集管中的液体， 将吸附 柱放入同一收集管中， 重复一次本操作。 0109 6)离心1min， 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中， 在吸附膜中央加入50 l ddH2O， 室温静置1min后， 离心1min， DNA液于-20保存备用。 0110 实施例2： 双荧光素酶报告基因检测实验 0111 1.目的质粒(GV238-PCXCR4)细胞转染： 0112 (1)取对数生长期的细胞， 用无血清、 无抗生素的RPMI 1640培养液洗涤两次， 调整 细胞浓度为3105/ml， 每孔500 l加入24孔板。

32、； 0113 (2)将不同浓度的siRNA稀释于Opti-MEM1中(50 l/孔)， 轻轻混匀， 另外将合适浓 度的脂质体Lipofectamine 2000稀释于Opti-MEM1中(50 l/孔)， 混合后室温放置5min。 5min后将脂质体和siRNA两两混合， 轻轻混匀后室温放置20min； 0114 (3)将100 l脂质体-siRNA复合物加入细胞中， 摇动培养板轻轻混匀； 0115 (4)37培养6-8h后， 每孔加入500 l含20FBS的RPMI 1640培养液； 0116 在转染后的不同时间点收集细胞， 进行下一步的检测。 0117 2.荧光素酶报告基因检测： 0118。

33、 萤火虫荧光素酶检测缓冲液临用前加入50萤火虫荧光素酶检测底物， 标记为萤 火虫荧光素酶检测试剂； 0119 Renilla荧光素酶检测缓冲液临用前加入100Renilla荧光素酶检测底物， 标记 为Renilla荧光素酶检测试剂。 0120 1)裂解细胞 0121 对于贴壁细胞： 吸尽细胞培养液后用1PBS润洗2遍后加入细胞裂解液； 对于悬浮 细胞： 离心去上清后 0122 用1PBS润洗2遍后离心去上清后加入细胞裂解液。 于振荡器上室温裂解20min以 裂解充分。 充分裂解后， 10000-15000g离心3-5分钟， 取上清用于测定。 0123 2)荧光数值检测 0124 将样本、 萤火。

34、虫荧光素酶检测试剂、 Renilla荧光素酶检测试剂平衡至室温后再进 行以下操作： 0125 a)每孔加入100ul裂解上清。 0126 b)每孔加入100ul萤火虫荧光素酶检测试剂， 加入20ul样本， 用移液器轻柔吹打混 匀后读数； 以细胞裂解液为空白对照。 说明书 7/16 页 9 CN 111471715 A 9 0127 c)每孔加入100ul Renilla荧光素酶检测试剂， 使用酶标仪震荡混匀后读数。 0128 3)计算荧光比值 0129 在以Renilla荧光素酶为内参的情况下， 用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以 Renilla荧光素酶测定得到的RLU。 根据得到的比值来。

35、比较不同样本间目的报告基因的激活 程度。 0130 3.结果： 0131 如图2所示， 经阳性克隆经测序鉴定、 比对， 证实已连接上CXCR4启动子片段(-191 +88)。 如图3所示， CXCR4启动子转录活性在肿瘤细胞中与阳性对照相当， 在正常细胞中与 阴性对照相当。 0132 实施例3： 腺病毒载体的构建与包装 0133 构建示意图如图1所示。 0134 1.人sTRAIL片段克隆与鉴定 0135 外周血淋巴细胞(PBL)的分离及刺激培养： 0136 1)采正常人外周静脉血约10ml， 经抗凝处理后， 按1:1的体积比加入淋巴细胞分离 液， 静置20分钟， 1500rpm离心15分钟，。

36、 用吸管小心吸取白膜层相， 尽量不要将其它层面的细 胞或液体吸入。 0137 2)将上面收集到的淋巴细胞用PBS洗涤两遍后， 以含10胎牛血清的RPMI1640培 养基培养2天， 同时加入IL-2(1000U/ml)刺激细胞。 0138 人外周血淋巴细胞cDNA文库的建立： 0139 提取总RNA： 所有用具均经0.1DEPC水浸泡过夜并高温消毒， 液体试剂由消毒后 的0.1DEPC去离子水配置。 0140 1)离心收集5106经过IL-2刺激的单个核细胞， 1-2ml冰冷无菌PBS洗细胞二次。 0141 2)在细胞沉淀中加入1ml Trizol剧烈吹打， 室温放置5分钟。 0142 3)加入。

37、200ul氯仿， 剧烈震荡混匀， 室温静置2-3分钟。 0143 4)12000rpm 4离心15分钟。 0144 5)取上清， 尽量不要吸取中间的环状白膜， 加入500ul异丙醇， 混均， -20过夜。 0145 6)12000rpm 4离心15分钟。 0146 7)弃上清， 沉淀加入75乙醇1ml洗涤， 离心12000rpm， 5分钟， 4， 洗两次。 0147 8)弃上清， 空气中晾干RNA。 0148 9)加入40 ul DEPC水溶解， 长期保存在-80。 0149 逆转录体系40ul， 按常规说明书。 0150 2.人可溶性TRAIL(114aa-281aa)片断的PCR扩增 01。

38、51 首先以IL-2刺激48小时的人外周血单个核细胞cDNA文库为模板， 扩增出人sTRAIL 片断(114-281)， 序列如下或如SEQ ID No.2所示： 说明书 8/16 页 10 CN 111471715 A 10 0152 0153 长度为536bp， 黑体为与分泌信号与异亮氨酸拉链融合基序列的接头序列， 斜体下 划线为限制性内切酶NotI和XbaI的识别位点。 0154 然后再以DNA互相 “搭桥” 拼接的方法， 用4条长引物合成分泌信号与异亮氨酸拉链 融合基， 序列为： 0155 0156 0157 长度为209bp， 斜体下划线为限制性内切酶HindIII的识别位点， 斜体。

39、为分泌信号 序列， 下划线为异亮氨酸拉链序列， 黑体为与人sTRAIL序列的接头序列。 0158 以上面获得的人单个核细胞cDNA文库为模板， 以P3： GCGAGAGGGAA GTGAGAGAAAG AGGTCCTCAG； P4： ATCG TCTAGA GCGGCCGC TTAGCCAACTAAAAAGGCCCC为上下游引物(带下划线 部分为XbaI和NotI限制性内切酶位点， 斜体是与P10反向互补序列)。 0159 扩增体系： 0160 0161 扩增循环： 0162 94变性5分钟； 94变性30秒， 62退火30秒， 72延伸1分钟， 共35个循环； 72 延伸10分钟。 说明书 。

40、9/16 页 11 CN 111471715 A 11 0163 扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳结束后切下544bp大小的条带用凝胶 DNA回收试剂盒进行回收， 方法同实施例1。 回收的DNA片断置于-20保存备用。 通过酶切电 泳后鉴定无误。 0164 3.pGL3-sTRAIL质粒的构建： 0165 将测序正确的T-sTRAIL质粒和pGL3-Basic质粒， 用HindIII和XbaI进行双酶切， 37 水浴4小时。 0166 将双酶切产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 对T-sTRAIL质粒切胶回收小片断， 对 pGL3-Basic质粒切胶回收大片断。 0167 连接反应： 0168 。

41、反应体系为10 L(pGL3-Basic片断与sTRAIL片断摩尔比控制在1： 5-10之间) 0169 连接产物转化大肠杆菌DH5a(氨苄青霉素抗性)， 挑取克隆做菌液PCR， 阳性的克隆 菌培养过夜， 小提质粒方法同实施例1。 0170 用获得的质粒进一步酶切鉴定。 鉴定结果构建无误。 0171 4.pGL3-PCXCR4-sTRAIL质粒的构建 0172 将鉴定正确的pGL3-sTRAIL质粒和上述测序正确的T-PCXCR4质粒， 用HindIII和 XhoI进行双酶切， 37水浴4小时。 将双酶切产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 对T-PCXCR4质粒 切胶回收小片断， 对线性的pGL3-s。

42、TRAIL质粒切胶回收。 0173 连接反应： 0174 反应体系为10 L(pGL3-Basic片断与sTRAIL片断摩尔比控制在1： 5-10之间) 0175 连接产物转化大肠杆菌DH5a(氨苄青霉素抗性)， 挑取克隆做菌液PCR， 阳性的克隆 菌培养过夜， 小提质粒方法同实施例1。 0176 用获得的质粒进一步酶切鉴定。 鉴定结果构建无误。 0177 5.pADPCXCR4-sTRAIL(without poly(A)质粒的构建 0178 将鉴定正确的pGL3-PCXCR4-sTRAIL质粒和腺病毒穿梭质粒pAdTrack， 用XhoI和 NotI进行双酶切， 37水浴4小时。 将双酶切。

43、产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 对pGL3-PCXCR4- sTRAIL质粒切胶回收小片断， 对线性的pAdTrack质粒切胶回收。 0179 连接反应： 0180 反应体系为10 L(pAdTrack片断与PCXCR4-sTRAIL片断摩尔比控制在1： 5-10之 间)。 连接产物转化大肠杆菌DH5a(卡那青霉素抗性)， 挑取克隆做菌液PCR(引物选择P4和 P9)， 阳性的克隆菌培养过夜， 小提质粒方法同实施例1。 0181 用获得的质粒进一步酶切鉴定。 鉴定结果构建无误。 0182 5.T-poly(A)质粒的构建 0183 以上pAdTrack为模板， 以P11： GGGG GCGGCCG。

44、C TGGAGTTCGTGACCG CCGC； P12： GGGG GGTACC CGCGTTAAGATACATTGATGAG上下游引物(带下划线部分为NotI和KpnI限制性内切酶 位点)。 0184 扩增体系： 说明书 10/16 页 12 CN 111471715 A 12 0185 0186 0187 扩增循环： 0188 94变性5分钟； 94变性30秒， 64退火30秒， 72延伸30秒， 共35个循环； 72 延伸10分钟。 再加入1ulTaqDNA聚合酶， 继续72延伸20分钟， 在扩增产物3 末端加A。 0189 扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳结束后切下340bp大小。

45、的条带用凝胶 DNA回收试剂盒进行回收， 方法同2.3.5。 回收的DNA片断置于-20保存备用。 0190 将回收的片断与pMD19-T simple载体相连， 连接反应之后， 转化大肠杆菌DH5a(氨 苄青霉素抗性)， 挑取菌落做菌液PCR， 鉴定阳性的克隆保存在-80并送测序， 具体方法同 实施例1。 0191 送去测序鉴定， poly(A)序列应为： 0192 GGGGGCGGCCGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCG GACTCAGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCAT。

46、ACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAA AACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTA TAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTT TGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGGGTACCCCCC 0193 鉴定无误。 0194 6.pADPCXCR4-sTRAIL质粒的构建 0195 将测序正确的T-Poly(A)质粒和鉴定正确的p。

47、ADPCXCR4-sTRAIL(without poly (A)质粒， 用NotI-HF和KpnI-HF进行双酶切， 37水浴4小时。 将双酶切产物进行1琼脂糖 凝胶电泳， 对T-Poly(A)质粒切胶回收小片断， 对线性的pADPCXCR4-sTRAIL(without poly (A)质粒切胶回收。 0196 连接反应： 0197 反应体系为10 L(pAdTrack片断与PCXCR4-sTRAIL片断摩尔比控制在1： 5-10之 间)。 连接产物转化大肠杆菌DH5a(卡那青霉素抗性)， 挑取克隆小量提取质粒， 方法同实施 例1。 0198 用获得的质粒酶切鉴定。 鉴定结果构建无误。 01。

48、99 至此穿梭质粒pADPCXCR4-sTRAIL构建完毕。 0200 7.细菌内同源重组 0201 制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞： 0202 1.将含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183冻存液接种于2-YT固体培 养基(含链霉素和氨苄青霉素)， 于37培养过夜。 说明书 11/16 页 13 CN 111471715 A 13 0203 2.挑取一个单菌落接种于5mL2-YT液体培养基(含链霉素和氨苄青霉素)， 37空 气浴， 200rpm振摇培养过夜。 0204 3.将500ul过夜培养的菌液倒入装有50mL 2-YT(含链霉。

49、素和氨苄青霉素)的三角 烧瓶中， 37空气浴， 200rpm振摇培养至OD600为0.4-0.6。 0205 4.菌液冰浴5分钟， 4000rpm4离心10分钟收集菌体， 将菌体重新悬浮于1/20体积 (2.5mL)的4预冷TSB液。 冰浴10分钟后， 直接用于转化， 每次转化尽量使用新鲜的感受态 细胞。 0206 用线性pADPCXCR4-sTRAIL质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌 BJ5183感受态细胞： 0207 线性pAdPCXCR4-sTRAIL质粒 20 L 0208 Solution A 20 L 0209 无菌去离子水 60 L 0210 上述混合溶液冰。

50、浴5分钟后加入200ul含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌 BJ5183感受态细胞(新鲜的)， 轻混匀， 冰浴20分钟， 再置于室温10分钟， 用涂布棒将混合液 涂布于卡那霉素抗性的2-YT细菌固体培养基上， 37恒温培养过夜。 0211 8.重组腺病毒质粒的鉴定 0212 从上面所述的固体培养基上挑选数个体积最小的卡那霉素抗性菌落， 接种于10mL 含有卡那霉素的2-YT液体培养基内， 37空气浴振荡培养过夜。 小量提取质粒方法同上， 1琼脂糖凝胶电泳。 根据质粒大小初步鉴定， 选取近40Kb大小的质粒， 用PCR及PacI酶切的 方法鉴定重组子。 0213 PacI酶切反应条件。