预处理活化的间充质干细胞的制备方法及其在髓系白血病治疗中的应用.pdf

《预处理活化的间充质干细胞的制备方法及其在髓系白血病治疗中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《预处理活化的间充质干细胞的制备方法及其在髓系白血病治疗中的应用.pdf（11页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010282962.6 (22)申请日 2020.04.10 (71)申请人 南京大学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区仙林大 道163号生命科学学院B209 (72)发明人 沈萍萍孙璐琛杨南飞郑薇 左诗曼 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种预处理活化的间充质干细胞的制备方 法及其在髓系白血病治疗中的应用 (57)摘要 本发明属于医药生。

2、物技术领域， 具体涉及一 种脐带来源间充质干细胞应用于急慢性髓系白 血病分化疗法的应用。 本发明提供的间充质干细 胞为人来源的脐带间充质干细胞(UC-MSCs)， 在 经过特定的化学小分子-1， 25D3(1， 2-二羟基维 生素D3， 1， 25-DihydroxyvitaminD3)预处理活 化后得到的间充质干细胞(ActiveMSCs)； 所述 ActiveMSCs可高效诱导AML细胞分化， 该种能力 是通过分泌白介素6(IL-6)及吲哚-2， 3双加氧酶 (IDO)来实现的； 所述间充质干细胞为异体间充 质干细胞， 在经过VDR激动剂1， 25D3处理活化后 能够使其IL-6和IDO的。

3、表达及分泌能力显著提高 至少3倍， 抗AML能力显著增强。 相较于化疗， 间充 质干细胞移植的毒副作用更低， 且具备低免疫原 性， 满足临床需求， 且1， 25D3为临床批准药物， 预 处理后干细胞上清无药物残留。 该种方法为髓系 白血病的干细胞移植治疗提供了新的思路， 可应 用于髓系白血病的分化治疗。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 111471648 A 2020.07.31 CN 111471648 A 1.一种活化的间充质干细胞的制备方法， 该制备方法的步骤为： 1)MSCs细胞传代至60mm*15mm皿中， 使用含有10FBS的 -MEM完全培养基， 37、 5CO2 培。

4、养箱内培养过夜， 使其密度达到80。 2)将1， 25D3加入完全培养基中， 使其在培养液中的终浓度为1-10 M。 在此条件下， 培养 并活化MSCs 24小时。 3)在使用1， 25D3处理一天后， 弃上清， PBS洗两遍， 更换新鲜的含有10FBS的 -MEM完 全培养基继续培养MSCs以供后续使用(在此定义此种MSCs为Active MSCs)。 2.如权利要求1所述， 一种活化的间充质干细胞， 其特征在于使用异体来源的间充质干 细胞， 如： 新生儿的脐带组织来源的间充质干细胞(UC-MSCs)。 3.如权利要求1和2所述， 一种活化的脐带来源间充质干细胞的制备方法， 其特征在于 使化。

5、学小分子(如： 1， 25D3)激动间充质干细胞的维生素D受体(VDR)， 使其高表达白介素6 (IL-6)及吲哚-2， 3双加氧酶(IDO)， 进而发挥诱导急性单核白血病细胞分化的功能。 4.根据权利要求3中所述一种活化的间充质干细胞的制备方法， 其特征在于， 所述1， 25D3对脐带间充质干细胞的刺激时间为24-48h。 5.根据权利要求4中所述一种1， 25D3活化的间充质干细胞， 其特征在于， 所述1， 25D3对 脐带间充质干细胞的活化方法为： 终浓度1-10 M 1， 25D3刺激间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述一种活化的间充质干细胞， 其特征在于， 化学小分子(VDR激动剂。

6、 1， 25D3及其改构物， 如去泊三醇)激活间充质干细胞中的VDR， 使MSC表达IL-6及IDO的表达 量需提高3倍以上。 相应地， 白血病细胞(包括细胞系和原代细胞)的分化程度应上调至少 50(分化程度以CD11b、 CD14双阳性表达为判定依据)。 7.权利要求5所述一种预处理活化的间充质干细胞， 作为一种全新的髓系白血病(急性 髓系白血病和慢性髓系白血病)分化疗法的应用。 8.根据权利要求6所述一种间充质干细胞， 在治疗AML时进行外周静脉输注的有效剂量 为5106/kg-10106/kg。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111471648 A 2 一种预处理活化的间充质干细胞的。

7、制备方法及其在髓系白血 病治疗中的应用 技术领域 0001 本发明属于干细胞治疗领域， 具体涉及一种间充质干细胞的处理活化手段及相应 的在髓系白血病治疗中的应用。 背景技术 0002 髓系白血病是一种异质性的血液系统恶性肿瘤， 其主要表现为骨髓与血液中大量 的积累恶性的原始和幼稚髓性细胞。 这些原始白血病细胞停滞在了分化的早期阶段并大量 进行克隆性增殖， 严重妨碍正在的造血和免疫功能。 髓系白血病分为慢性髓系白血病 (chronic myeloid leukemia， CML)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia， AML)。 CML发病缓慢， 其自然病程包括无症状期。

8、、 慢性期、 加速期及急变期。 CML通常始于慢性期， 并 在数年的过程中发展为加速期， 最终发展为急变期。 急变期是CML的终末期， 临床表现为 AML。 目前治疗AML的主要手段为大剂量的化疗联合造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation， HSCT)， 虽然病人症状可得到完全缓解， 但由于大剂量化疗的使用， 仍然会导致严重的副作用。 与此同时， HSCT需要找到合适的配型以避免免疫排斥反应， 这也 大大限制了HSCT的临床应用。 随着免疫疗法的兴起， 针对血液肿瘤的CAR-T疗法相继问世。 其中， 针对CD19和CD20的CAR-T疗法。

9、已经成功的应用于临床的B细胞淋巴白血病和非霍奇金 性淋巴瘤， 但是针对髓系白血病的CAR-T疗法仍无实质性进展， 最主要的原因就是缺乏针对 AML细胞特异性的表面抗原， 导致CAR-T靶向性差， 致使正常的髓系细胞受损。 综上所述， 目 前仍然缺乏更加合理和有效的治疗AML的细胞疗法。 0003 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells， MSCs)是一种多潜能成体干细胞， 广泛 分布于间充质组织中， 如脂肪， 骨髓等。 临床上最常用的是骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow derived MSCs， BM-MSCs)， 一般以自体移植为主， 可用于治疗多种慢性疾病。

10、。 但是在 急性白血病人中的研究发现， AML病人的BM-MSCs失去了旺盛的自我更新能力， 同时也失去 了对正常造血干细胞生长和功能的维持作用， 转而支持AML细胞的生长和增殖。 除此之外， 有研究报道了AML病人来源的BM-MSCs还能够保护AML细胞免遭化疗药物的杀伤作用。 因此， 自体移植BM-MSCs无法达到缓解AML病程的作用， 甚至可能加剧AML的病程。 0004 脐带间充质干细胞(Umbilical cord MSCs， UC-MSCs)是一种从新生儿脐带组织中 分离获得的间充质干细胞。 相比于其他成体间充质干细胞， UC-MSCs具备一些独特的优势， 例如生长迅速， 细胞分泌。

11、能力旺盛， 免疫原性更低等。 有证据表明， 来自于健康新生儿的异 体UC-MSCs具备更强的免疫调节活力， 因而被成功应用于治疗多种自体免疫性疾病。 同时， 也有一些报道指出UC-MSCs具备一定的抗肿瘤活性。 0005 急性髓系白血病的分化疗法已经被成功应用于临床。 以全反式维甲酸和砷类化合 物为代表的 促分化小分子药物 ， 已 被证明能 够促进急性早幼粒白 血病 (Acute promyelocytic leukemia， APL)跨越分化障碍， 促进其向成熟粒细胞分化， 进而抑制白血病 细胞的增殖并降低其恶性程度。 虽然这两类药物能够促进APL细胞分化， 但却不具备普适 说明书 1/5 。

12、页 3 CN 111471648 A 3 性。 更为具有普适性的AML的分化疗法仍有待进一步开发。 0006 1， 2-二羟基维生素D3(1， 25-Dihydroxyvitamin D3， 1， 25D3)， 又名Calcitriol (CAS号： 32222-06-3)， 是维生素D3在体内的最终活性形式， 也是维持体内钙磷平衡必须的 维生素。 1， 25D3通过与其核受体维生素D受体(Vitamin D receptor， VDR)结合， 激活VDR下 游基因表达， 从而达到促进钙磷吸收， 骨分化等多种生理功能。 在白血病相关的临床试验 中， 1， 25D3曾被用于促进AML细胞的分化，。

13、 虽然有部分病人得到缓解， 但却引起了明显的高 血钙症(Hypercalcemia)， 直接导致1， 25D3的临床试验被终止。 因此， 优化VDR相关的分化疗 法成为研究的一个新焦点。 本发明利用1， 25D3预处理活化MSCs， 增强MSCs促进AML细胞分化 的能力， 从而达到控制AML病程的作用。 发明内容 0007 本发明目的在于构建一种预处理活化的MSCs的制备方法， 并作为治疗工具用于髓 系白血病的治疗。 其中包含预处理活化MSCs的技术方法， 处理后MSCs的质量控制方法及标 准， 以及评价促进髓系白血病分化的效能的方法与标准。 0008 为达到上述发明目的， 本发明所采用的M。

14、SCs预处理活化方案是以1-10 M的1， 25D3 预处理活化MSCs， 使其高表达白介素6(IL-6)、 吲哚-2， 3双加氧酶(IDO)， 进而高效诱导AML 细胞分化， 从而建立一种全新的AML分化疗法。 具体处理方法如下： 1. 1106MSCs细胞传代至60mm*15mm培养皿中， 使用含有10FBS的 -MEM完全培养 基， 37、 5CO2培养箱内培养过夜。 2.将1， 25D3加入完全培养基中， 使其在培养液中的终浓度为1-10 M。 在此条件下， 培养 MSCs 24-48小时。 3.在使用1， 25D3处理后， 弃上清， PBS洗两遍， 更换新鲜的含有10FBS的 -ME。

15、M完全培 养基继续培养MSCs以供后续使用(在此定义此种MSCs为Active MSCs)。 0009 Active MSCs的质量控制方法及标准： 该部分描述经过预处理后的MSCs， 即Active MSCs是否符合后续应用于髓系白血病分 化疗法的质量控制标准及其测定方法。 1.Active MSCs的培养上清中1， 25D3残留含量的质量控制： 高效液相色谱(HPLC)检测 该上清中1， 25D3的含量， 上清中1， 25D3的含量应在0.1nM以下。 2.Active MSCs的细胞活力的质量控制： CCK8细胞增殖检测法检测Active MSCs的细胞 增殖能力。 Active MSC。

16、s与处理前相比， 其增殖能力应不发生明显改变。 3.Active MSCs表型的质量控制： 流式细胞术鉴定Active MSCs细胞表面标志物CD14、 CD34、 CD45、 CD73、 CD90、 CD105的表达。 与处理前相处， Active MSCs的细胞表明标志物表达 丰度应不发生明显变化。 4.Active MSCs多潜能性评价： 将Active MSCs进行成脂、 成骨和成软骨诱导分化并评 价其分化程度， 判断其多潜能性的维持能力。 与处理前相比， Active MSCs的成脂肪细胞分 化， 成骨细胞分化及成软骨细胞分化能力应不受影响。 0009 符合以上标准的Active M。

17、SCs可进入下一步促进髓系白血病细胞分化的应用。 1.应用实时定量PCR(RT-qPCR)与ELISA测定Active MSCs的白介素6(IL-6)、 吲哚-2， 3 说明书 2/5 页 4 CN 111471648 A 4 双加氧酶(IDO)的表达。 与预处理前相比， Active MSCs的IL-6和IDO的表达与分泌能力应提 高至少3倍以上。 2.将Active MSCs分别与人源白血病细胞系(THP-1与U937细胞系)或白血病病人来源 的原代白血病细胞进行共培养， 流式细胞术评价AML细胞CD14和CD11b的表达。 相对于处理 前， CD11b、 CD14双阳性表达程度应上调至少。

18、50。 3.将Active MSCs分别与CFSE标记的人源白血病细胞系(THP-1与U937细胞系)共培养 1-3天， 流式细胞术检测Active MSCs显著抑制AML细胞的增殖。 0010 本发明制备的Active MSCs， 与未经处理的同批次的MSCs相比较具有更好的诱导 白血病细胞分化的能力， 使用1， 25D3预处理活化的MSCs具有更强的分泌能力， 其中诱导分 化的关键蛋白IL-6的表达显著增加。 Active MSCs可以作为一种治疗急性髓系白血病的新 型细胞疗法。 0012 本发明所述的用于治疗白血病的Active MSCs的外周静脉输注有效剂量为(5-10) 106/kg。

19、。 该有效剂量是通过大量的动物模型试验取得治疗效果而确定的。 附图说明 0013 图1高效液相色谱(HPLC)检测预处理MSCs中1， 25D3残留(A)同批次未处理MSCs， (B)Active MSCs， (C)1， 25D3纯品。 0014 图2 CCK8检测1， 25D3对MSCs增殖的影响。 0015 图3 Active MSCs流式鉴定， 流式检测标记物CD73、 CD90、 CD105、 CD14、 CD34、 CD45 的表达。 0016 图4 Active MSCs成骨(A)、 成脂(B)、 成软骨(C)诱导分化鉴定 0017 图5 MSCs体外诱导急性单核白血病细胞分化的能。

20、力检测。 流式细胞术检测(A)AML 细胞株U937细胞表面CD14和CD11b的表达， (B)白血病病人原代样本细胞表面CD14和CD11b 的表达。 0018 图6 MSCs体外抑制急性单核白血病细胞增殖的能力检测。 CCK8检测THP-1(左)和 U937(右)细胞株的增殖。 0019 图7预处理活化的MSCs， IL-6和IDO的表达量。 0020 图8预处理活化的MSCs静脉输注后对小鼠的白血病抑制作用检测。 具体实施方式 以下结合实施例对本发明的原理特征和技术方案进行描述， 所举实施例只用于解释本 发明， 并未用于限定本发明的范围。 0021 实施例1 0022 脐带间充质干细胞的。

21、分离及传代培养 1.配置组织消化酶(II型胶原酶250U/ml， 中性蛋白酶100U/ml， 透明质酸酶10U/ml)， 37 溶解于 -MEM培养基， 用0.22 m的滤器过滤除菌备用； 2.取新生婴儿的脐带组织， 将脐带放入培养皿中用含0.1青霉素-链霉素双抗的PBS 清洗干净， 放入 -MEM培养基中， 剥离三根血管， 将脐带剪碎成1-2mm3的组织块； 3.将剪碎的组织块与配置的组织消化酶溶液按1 1的体积比例混合于50ml离心管中， 说明书 3/5 页 5 CN 111471648 A 5 37， 200rpm， 消化3h， 待组织块基本消化完全即可； 4.将消化后的组织液4， 30。

22、0g离心5min， 弃上清。 PBS重悬于50ml -MEM培养基中， 4， 300g离心5min， 弃上清。 PBS洗两次， 将沉淀重悬于含有10胎牛血清、 1双抗的 -MEM培养 基中， 接种于直径10cm细胞培养皿中， 放置在37、 5CO2、 饱和湿度培养箱中静置贴壁培 养； 5. 3天后， 半量换液。 此后， 每两天换液， MSCS沿着贴壁的组织块或者贴壁的细胞长出； 6.待细胞长至80丰度时， 用含0.25胰酶和0.02EDTA细胞消化液消化下细胞； 重 悬细胞， 1000rpm离心5min， 弃上清， PBS洗一遍， 离心后弃上清， 获得的细胞沉淀用新鲜的培 养基重悬， 然后接种。

23、到新的培养皿中， 传代细胞。 待细胞长至90融合后， 进行下一次传代 培养。 0023 实施例2 0024 预处理活化的间充质干细胞的制备方法的优化 1.作为本发明MSCs预处理活化的一种优选实施方案， 所述1， 25D3在培养液中的终浓度 为4 M。 2.作为本发明MSCs预处理活化的一种优选实施方案， MSCs培养长至70-80丰度。 3.作为本发明MSCs预处理活化的一种优选实施方案， MSCs加入1， 25D3培养24小时。 4.作为本发明MSCs预处理活化的一种优选实施方案， 活化24小时的MSCs， 弃上清， 用pH 7.4的PBS洗两遍， 用含10FBS的 -MEM培养基继续培养。

24、。 0025 实施例3 0026 Active MSCs的质量控制方法及标准： 1.Active MSCs的培养上清中1， 25D3残留含量的质量控制： PBS清洗Active MSCs两遍， 使用含有10FBS的 -MEM完全培养基， 37、 5CO2培养箱内培养2天， 收集培养上清， 高效 液相色谱(HPLC)检测该上清中1， 25D3的含量， 上清中1， 25D3的含量应在0.1nM以下。 2.Active MSCs的细胞活力的质量控制： 以未经处理的同批次的MSCs对照， CFSE检测 Active MSCs的细胞增殖能力。 与处理前相比， 增殖能力应不变化。 3.Active MSC。

25、s表型的质量控制： 以未经处理的同批次的MSCs对照， 流式细胞术鉴定 Active MSCs细胞表面标志物CD14、 CD34、 CD45、 CD73、 CD90、 CD105的表达。 与处理前相比， 表 明标志物表达应不发生明显变化。 4.Active MSCs多潜能性评价： 以未经处理的同批次的MSCs对照， 同时将Active MSCs 进行成脂、 成骨和成软骨诱导分化及鉴定： 采用广州赛业生物的MSCs成骨和成脂分化诱导 培养基以及诱导方案进行诱导成脂肪和成骨分化； 采用Stem Cell的MSCs成软骨分化诱导 培养基以及诱导方案进行诱导成软骨分化。 通过形态学染色和观察， 判断分。

26、化能力的强弱 变化。 与预处理前相比， 三种谱系分化能力应不发生明显变化。 0027 实施例4 0028 Active MSCs促进AML细胞分化的效能评价方法及标准： Active MSCs， 以及未处理的同批次MSCs分别以105/孔的数目接种到12孔板中， 放到培 养箱中细胞贴壁生长12h， 弃培养上清， PBS洗2遍。 以在相同培养条件下单独培养的人白血 病细胞(THP-1、 U937细胞株， 原代白血病细胞)为对照， 直接接种2105/孔的THP-1和U937 细胞在培养MSCs和Active MSCs的孔板中， 进行体外实验。 说明书 4/5 页 6 CN 111471648 A 。

27、6 1.共培养48h后， 收取单独培养或共培养的THP-1和U937细胞株到1.5ml EP管中， PBS洗 两遍， 以单独培养的THP-1和U937细胞株为对照， 流式细胞术检测共培养的THP-1和U937细 胞CD14和CD11b的表达以及吞噬能力的变化。 2.以未经处理的同批次的MSCs对照， 实时定量PCR(RT-qPCR)检测Active MSCs中白介 素6(IL-6)、 吲哚-2， 3双加氧酶(IDO)的表达升高3倍及以上。 0029 以上实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。 对于本领 域的技术人员来说， 在不背离本发明精神和实质的情况下对本发明方法、 步骤或条件所做 的修改和替换， 均属于本发明的范围。 说明书 5/5 页 7 CN 111471648 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 111471648 A 8 图3 图4 说明书附图 2/4 页 9 CN 111471648 A 9 图5 图6 图7 说明书附图 3/4 页 10 CN 111471648 A 10 图8 说明书附图 4/4 页 11 CN 111471648 A 11 。