2-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010379802.3 (22)申请日 2020.05.08 (83)生物保藏信息 CGMCC No.19557 2020.04.07 (71)申请人 江苏华燕集团有限公司 地址 225401 江苏省泰州市泰兴市城区工 业园区碾坊路1号 (72)发明人 帅玉英荣德明 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普 通合伙) 32100 代理人 葛雷 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/90(2。

2、006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/61(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12P 19/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 2-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备方法和 用途 (57)摘要 本发明公开了一种2-岩藻糖基乳糖高产菌 株及其制备方法和用途， 菌株保藏编号为CGMCC No.19557。 本发明以大肠杆菌E.coliBL21(DE3) 为生产宿主， 通过过表达磷酸甘。

3、露糖变位酶 (manB)、 甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manC)、 GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)、 GDP-L-岩藻糖合 酶(flc)和-1,2-岩藻糖转移酶 （futC） ， 构建 2-FL的合成路径， 在此基础上通过过表达蔗糖 转运蛋白、 乳糖转运蛋白提高底物的供应， 进一 步提高2-FL的生产能力， 实现2-FL在大肠杆菌 中高效表达， 获得2-FL高产菌株。 权利要求书2页 说明书10页 CN 111471637 A 2020.07.31 CN 111471637 A 1.一种2-岩藻糖基乳糖高产菌株 （Escherichia coli） ， 其特征是： 保藏编号为 C。

4、GMCC No.19557。 2.一种权利要求1所述的2-岩藻糖基乳糖高产菌株 （Escherichia coli） 的制备方法， 其特征是： 包括下列步骤： （1） 构建E. coli BL21(DE3)-1： 以Escherichia coliMG1655基因组为模板， 设计引物： 上游引物：manB-F： CCGGAATTCA TGATAAATATGGTCGTGTTGAGGA， 下游引物：manB-R： CGCGGATCCTTACAAAAGAGTAACTTTATGCAAA； PCR扩增磷酸甘露糖变位酶表达基因表达基因manB序列； 将上述PCR产物与pCDF-Duet质粒 进行EcoRI。

5、/BamHI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的manB基因片段与pCDF- Duet质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受 态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的 质粒pCDF-Duet-manB； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：manC-F： CCCAAGCTTATGAGCTCACCTCT TATTCCGGTTA， 下游引物：manC-R： AAATATGCGGCCGCTCAATCTTCAAATCGAAGGATATCA； PCR扩增甘 露糖-1-磷。

6、酸鸟苷酰转移酶表达基因manC序列； 将上述PCR产物与pCDF-Duet-manB质粒进行 HindIII/NotI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的manC基因片段与pCDF-Duet- manB质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受 态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的 质粒pCDF-Duet-manB-manC； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：gmd-F： GGGAATTCCATATGTCAAAAGTCG CTCTCATCACCG， 与下游。

7、引物：gmd-R： CGGGGTACCATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACCG； PCR扩增GDP- 甘露糖-4 ,6-脱水酶表达基因gmd序列； 将上述PCR产物与pCDF-Duet-manB-manC质粒进行 NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的gmd基因片段与pCDF-Duet-manB- manC质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受 态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的 质粒pCDF-Duet-manB-manC-gmd； 以E. coli 。

8、MG1655基因组为模板， 设计上游引物：flc-F： CCGGAATTCATGAGTAAACAACGA GTTTTTATTG， 下游引物：flc-R： CGCGGATCCTTACCCCCGAAAGCGGTCTTGATTC； PCR扩增GDP-L-岩 藻糖合酶表达基因flc序列； 将上述PCR产物与pACYC-Duet质粒进行EcoRI/BamHI双酶切， 酶 切产物经胶回收纯化后， 将所获得的flc基因片段与pACYC-Duet质粒酶切片段利用DNA连接 酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氯霉素抗性平板筛选转化子 并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证。

9、， 得到构建成功的质粒pACYC-Duet-flc； 基于Helicobacter pylori基因组中提供的 -1,2-岩藻糖转移酶的序列， 设计上游引 物：futC-F： GGGAATTCCATATGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTT， 下游引物：futC-R： CGCGGATCCTTAA GCGTTATACTTTTGGGATTTC； PCR扩增 -1,2-岩藻糖转移酶基因； 将上述PCR产物与pACYC-Duet 质粒进行NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的futC基因片段与pACYC- Duet-flc质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连。

10、接产物经热激转化E. coli JM109 感受态， 氯霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成 功的质粒pACYC-Duet-flc-futC； 将上述质粒pCDF-Duet-manB-manC-gmd、 pACYC-Duet-flc- 权利要求书 1/2 页 2 CN 111471637 A 2 futC转化大肠杆菌BL21 （DE3） 中构建E. coli BL21(DE3)-1； （2） 构建得到重组菌株E. coli BL21(DE3)-3： 以枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 168基因组为模板， 设计上游引物：scrB-F：。

11、 CAT GCCATGGATGACAGCACATGACCAGGAGCTTC， 下游引物：scrB-R： CGCGGATCCCTACATAAGTGTCCAAAT TCCGACA； PCR扩增蔗糖转运蛋白之一的scrB表达基因scrB序列； 将上述PCR产物与pET-Duet 质粒进行NcoI/BamHI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的scrB基因片段与pET- Duet质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受 态， 氨苄抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的质 粒pET-Duet-scrB； 。

12、以E. coli K-12基因组为模板， 设计上游引物：scrY-F： GGGAATTCCATATGATGTATAAAAA AACAACTTTGGCAG， 下游引物：scrY-R： CGGGGTACCTTAAAACCAGGTTTCCATTTGGACA； PCR扩增蔗糖 转运蛋白之一的scrY表达基因scrY序列； 将上述PCR产物与pET-Duet质粒进行NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将 所获得的scrY基因片段与pET-Duet-scrB质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接 产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氨苄抗性平板筛选转化子并培养， 。

13、进行质粒提取和 酶切或PCR验证， 得到构建成功的质粒pET-Duet-scrB-scrY； 将上述质粒pET-Duet-scrB - scrY质粒转化至E. coli BL21(DE3) -1中， 获得重组菌株E. coli BL21(DE3)-2； 以E. coli BL21 （DE3） 基因组为模板， 设计基因敲除所需sgRNA及同源臂引物， PCR扩增 lacZ基因上下游同源臂； 胶回收之后得到纯的敲除基因片段， 接E. coli BL21(DE3)/pKD46 于30 培养， OD600达到0.1时， 加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱导pKD46- -red系统表 达， 当OD6。

14、00达到0.30.4时， 制备感受态， 加入敲除基因片段于感受态中， 电转后， 敲除lacZ 基因， 获得重组菌E. coli BL21(DE3)-2/lacZ； 以上述的重组菌株E. coli BL21(DE3)-2/lacZ为出发菌株， 分别设计lacY-F： GGGA ATTCCATATGATGTACTATTTAAAAAACACAAACT， 下游引物：lacY-R： CGCGGATCCTTAAGCGACTTCATT CACCTGACGA， 扩增E. coli K-12中的lacY表达基因lacY， 并通过融合PCR分别将该基因与大 肠杆菌中强启动子PssrA融合， 构建lacY的高效表达。

15、阅读编码框； 随后， 利用大肠杆菌中的 同源整合系统， 将上述表达框整合至前述的重组菌株中， 构建得到重组菌株E. coli BL21 (DE3)-3， 即2-岩藻糖基乳糖高产菌株Escherichia coli。 3.一种权利要求1所述的2-岩藻糖基乳糖高产菌株在提高2-FL产量中的应用， 其特 征是： 将重组菌E. coli BL21(DE3)-3接种至种子培养基中， 37 过夜培养； 确定30、 OD600 0.8时添加0.5 mM IPTG， 发酵时间96h为发酵条件； 在此条件下， 发酵培养基中蔗糖和 果糖的浓度分别为30 g/L和20 g/L。 4.一种权利要求1所述的2-岩藻糖基。

16、乳糖高产菌株在提高2-FL产量中的应用， 其特 征是： 将重组菌E. coli BL21(DE3)-3菌株单菌落于装液量100 mL的种子液中， 30、 180 r/min的回旋式摇床培养至OD60010.0作为种子液； 将种子液60 mL以2.0%的接种量接种到 工作体积为3 L的发酵培养基中， 发酵罐发酵温度33， 搅拌转速600 r/min， 通气量1vvm， pH 6.8； 对数生长期时加入12 mL浓度为50 mg/mL的IPTG， 对数期结束后流加蔗糖， 直至浓 度为22 g/L； 初始6 h流加速率为9 mL/h， 随后以9 mL/h的速率流加115 h； 发酵终止后发酵 液2-。

17、FL浓度达100 g/L。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111471637 A 3 2-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种2-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备方法和用途。 背景技术 0002 人乳是碳水化合物、 脂肪、 蛋白质、 维生素、 矿物质和微量元素组成的复杂混合物。 其中主要成分是碳水合物， 其可进一步分成乳糖和更复杂的寡糖(人乳寡糖， HMO)。 然而乳 糖可被人体用作能源， 复杂寡糖却不能被婴儿代谢。 复杂寡糖由200多种不同的寡糖组成， 其含量占总碳水化合物总含量的最高可达20。 这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有 的， 尚未在其它哺乳。

18、动物的乳液中发现。 0003 迄今为止已鉴定了约200种结构各异的HMO， 并且其诸多有益性质被报道。 HMO不能 被母乳喂养的婴儿消化， 但却可作为肠中双歧杆菌属(Bifidobacteria)、 乳杆菌属 (Lactobacillus)和拟杆菌属(Bacteroides)等有益细菌的碳源和能源， 使它们在肠道中占 据优势并在竞争中战胜病原体， 可预防肠道上皮感染。 此外， HMO还可直接结合至致病性细 菌、 原生动物和病毒， 通过模拟聚糖细胞表面受体来阻断病原体-宿主相互作用， 从而保护 母乳喂养儿童免于传染病。 0004 在众多的人乳寡糖中， 最重要的是2-岩藻糖基乳糖(2-fucosy。

19、llactose， 2- FL)。 存在于人乳中的其他重要HMO是3-岩藻糖基乳糖、 乳-N-四糖、 乳-N-新四糖和乳-N-岩 藻戊糖。 除这些中性寡糖以外， 还可在人乳中发现酸性HMO， 例如3-唾液酰乳糖、 6-唾液酰 乳糖以及唾液酰乳-N-四糖a、 b和c， 或唾液酰乳-N-岩藻戊糖II等。 这些结构与上皮细胞表 面糖络合物的抗原表位(Lewis组织血型抗原)是近缘的， HMO与上皮表位的结构同源性说明 其针对细菌病原体具有保护特性。 0005 由于它们的有益特性， 将HMO作为组分包含于婴儿配方物和其他食品中是有利的， 这使得大量(最高达数吨级别)生产HMO成为当前寡糖生产的要点。 。

20、由于受限的供应和难以 获得各个人乳寡糖的纯度， 开发了获得这些复杂分子中的一些的化学途径。 然而， 被证实在 商业上不可持续的化学和生物催化方法， 此外， 尤其是人乳寡糖的化学合成途径包括若干 有毒的化学品， 这带来污染最终产物的风险。 0006 由于人乳寡糖的化学合成中涉及的挑战， 开发了若干酶促生产方法和发酵方法。 今天， 对于若干HMO如2-FL、 3-岩藻糖基乳糖、 乳-N-四糖、 乳-N-新四糖、 乳-N-岩藻戊糖I、 乳-N-二岩藻己糖II、 3-唾液酰乳糖和6-唾液酰乳糖而言， 已开发了相关微生物发酵方 法， 这些方法主要使用经遗传工程化的细菌菌株如重组大肠杆菌(Escheric。

21、hia coli，E. coli)。 0007 然而， 即使是目前可获得的基于细菌发酵的最有效方法， 也无法或几乎无法实现 在发酵液中大于20 g/L的HMO效价。 工业级方法必须通常超过50 g/L的效价， 尽管100 g/L 更为理想。 说明书 1/10 页 4 CN 111471637 A 4 发明内容 0008 本发明的目的是提供使得可以实现高效价的2-岩藻糖基乳糖高产菌株及其制备 方法和用途。 0009 本发明的技术解决方案是： 一种2-岩藻糖基乳糖高产菌株 （Escherichia coli） ， 其特征是： 保藏编号为 CGMCC No.19557。 0010 一种所述的2-岩藻。

22、糖基乳糖高产菌株 （Escherichia coli） 的制备方法， 其特征 是： 包括下列步骤： （1） 构建E. coli BL21(DE3)-1： 以Escherichia coli MG1655基因组为模板， 设计引物： 上游引物：manB-F： CCGGAATTC ATGATAAATATGGTCGTGTTGAGGA， 下游引物：manB-R： CGCGGATCCTTACAAAAGAGTAACTTTATGCAAA； PCR扩增磷酸甘露糖变位酶(manB)表达基因表达基因manB序列； 将上述PCR产物与pCDF- Duet质粒进行EcoRI/BamHI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后，。

23、 将所获得的manB基因片段与 pCDF-Duet质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构 建成功的质粒pCDF-Duet-manB； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：manC-F： CCCAAGCTTATGAGCTCACCTCT TATTCCGGTTA， 下游引物：manC-R： AAATATGCGGCCGCTCAATCTTCAAATCGAAGGATATCA； PCR扩增甘 露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manC)表达基因manC序列；。

24、 将上述PCR产物与pCDF-Duet-manB质 粒进行HindIII/NotI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的manC基因片段与pCDF- Duet-manB质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构 建成功的质粒pCDF-Duet-manB-manC； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：gmd-F： GGGAATTCCATATGTCAAAAGTCG CTCTCATCACCG， 与下游引物：gmd-R： CGGGGTACC。

25、ATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACCG。 PCR扩增GDP- 甘露糖-4 ,6-脱水酶(gmd)表达基因gmd序列； 将上述PCR产物与pCDF-Duet-manB-manC质粒 进行NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的gmd基因片段与pCDF-Duet- manB-manC质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构 建成功的质粒pCDF-Duet-manB-manC-gmd； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设。

26、计上游引物：flc-F： CCGGAATTCATGAGTAAACAACGA GTTTTTATTG， 下游引物：flc-R： CGCGGATCCTTACCCCCGAAAGCGGTCTTGATTC； PCR扩增GDP-L-岩 藻糖合酶(flc)表达基因flc序列； 将上述PCR产物与pACYC-Duet质粒进行EcoRI/BamHI双酶 切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的flc基因片段与pACYC-Duet质粒酶切片段利用 DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氯霉素抗性平板筛 选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的质。

27、粒pACYC-Duet-flc； 基于Helicobacter pylori基因组中提供的 -1,2-岩藻糖转移酶 （futC） 的序列， 由上 海生工基于大肠杆菌密码子偏好性合成futC序列， 设计上游引物：futC-F： GGGAATTCCATAT GGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTT， 下游引物：futC-R： CGCGGATCCTTAAGCGTTATACTTTTGGGATTTC； 说明书 2/10 页 5 CN 111471637 A 5 PCR扩增 -1,2-岩藻糖转移酶 （futC） 基因； 将上述PCR产物与pACYC-Duet质粒进行NdeI/ KpnI双酶切， 酶切。

28、产物经胶回收纯化后， 将所获得的futC基因片段与pACYC-Duet-flc质粒 酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氯霉 素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的质粒 pACYC-Duet-flc-futC； 将上述质粒pCDF-Duet-manB-manC-gmd、 pACYC-Duet-flc-futC转化 大肠杆菌BL21 （DE3） 中构建E. coli BL21(DE3)-1； （2） 构建得到重组菌株E. coli BL21(DE3)-3： 以枯草芽孢杆菌 （Bacillus sub。

29、tilis） 168基因组为模板， 设计上游引物：scrB-F： CAT GCCATGGATGACAGCACATGACCAGGAGCTTC， 下游引物：scrB-R： CGCGGATCCCTACATAAGTGTCCAAAT TCCGACA； PCR扩增蔗糖转运蛋白之一的scrB表达基因scrB序列； 将上述PCR产物与pET-Duet 质粒进行NcoI/BamHI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的scrB基因片段与pET- Duet质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受 态， 氨苄抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或。

30、PCR验证， 得到构建成功的质 粒pET-Duet-scrB； 以E. coli K-12基因组为模板， 设计上游引物：scrY-F： GGGAATTCCATATGATGTATAAAAA AACAACTTTGGCAG， 下游引物：scrY-R： CGGGGTACCTTAAAACCAGGTTTCCATTTGGACA。 PCR扩增蔗糖 转运蛋白之一的scrY表达基因scrY序列； 将上述PCR产物与pET-Duet质粒进行NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将 所获得的scrY基因片段与pET-Duet-scrB质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接 产物经热激转化E.。

31、 coli JM109感受态， 氨苄抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和 酶切或PCR验证， 得到构建成功的质粒pET-Duet-scrB-scrY。 将上述质粒pET-Duet-scrB - scrY质粒转化至E. coli BL21(DE3) -1中， 获得重组菌株E. coli BL21(DE3)-2； 以E. coli BL21 （DE3） 基因组为模板， 设计基因敲除所需sgRNA及同源臂引物， PCR扩增 lacZ基因上下游同源臂； 胶回收之后得到纯的敲除基因片段， 接E. coli BL21(DE3)/pKD46 于30 培养， OD600达到0.1时， 加入终浓度为0.2。

32、%的L-阿拉伯糖诱导pKD46- -red系统表 达， 当OD600达到0.30.4时， 制备感受态， 加入敲除基因片段于感受态中， 电转后， 敲除lacZ 基因， 获得重组菌E. coli BL21(DE3)-2/lacZ； 以上述的重组菌株E. coli BL21(DE3)-2/lacZ为出发菌株， 分别设计lacY-F： GGGA ATTCCATATGATGTACTATTTAAAAAACACAAACT， 下游引物：lacY-R： CGCGGATCCTTAAGCGACTTCATT CACCTGACGA， 扩增E. coli K-12中的lacY表达基因lacY， 并通过融合PCR分别将该基。

33、因与大 肠杆菌中强启动子PssrA融合， 构建lacY的高效表达阅读编码框； 随后， 利用大肠杆菌中的 同源整合系统， 将上述表达框整合至前述的重组菌株中， 构建得到重组菌株E. coli BL21 (DE3)-3， 即2-岩藻糖基乳糖高产菌株Escherichia coli。 0011 一种所述的2-岩藻糖基乳糖高产菌株在提高2-FL产量中的应用， 其特征是： 将 重组菌E. coli BL21(DE3)-3接种至种子培养基中， 37 过夜培养； 确定30、 OD600 0.8时 添加0.5 mM IPTG， 发酵时间96h为发酵条件； 在此条件下， 发酵培养基中蔗糖和果糖的浓度 分别为30。

34、 g/L和20 g/L。 0012 将重组菌E. coli BL21(DE3)-3菌株单菌落于装液量100 mL的种子液中， 30、 180 r/min的回旋式摇床培养至OD60010.0作为种子液； 将种子液60 mL以2.0%的接种量接 说明书 3/10 页 6 CN 111471637 A 6 种到工作体积为3 L的发酵培养基中， 发酵罐发酵温度33， 搅拌转速600 r/min， 通气量 1vvm， pH 6.8(补加氨水自动控制)； 对数生长期时加入12 mL浓度为50 mg/mL的IPTG， 对数 期结束后流加蔗糖， 直至浓度为22 g/L； 初始6 h流加速率为9 mL/h， 随。

35、后以9 mL/h的速率 流加115 h； 发酵终止后发酵液2-FL浓度达100 g/L。 0013 本发明以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为生产宿主， 通过过表达磷酸甘露糖变位酶 (manB)、 甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manC)、 GDP-甘露糖-4 ,6-脱水酶(gmd)、 GDP-L-岩藻 糖合酶(flc)和 -1,2-岩藻糖转移酶 （futC） ， 构建2-FL的合成路径， 在此基础上通过过表 达蔗糖转运蛋白、 乳糖转运蛋白提高底物的供应， 进一步提高2-FL的生产能力， 实现2-FL 在大肠杆菌中高效表达， 获得2-FL高产菌株。 0014 下面结合实施例对本发明作进。

36、一步说明。 0015 2-岩藻糖基乳糖高产菌株， 保藏编号为 CGMCC No.19557。 分类命名： 大肠埃希氏 菌， 拉丁文学名：Escherichia coli， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 地址： 北京市朝阳区北辰西路l号院3号， 保藏日期2020年4月7日。 具体实施方式 0016 培养基： 种子培养基为:蔗糖5.0 g/L， 氮源和微量元素组成为:1.0 g/L酵母提取物， 2.0 g/L NH4Cl， 10.0 g/L Na2HPO47H2O， 3.0 g/L KH2PO4， 0.5 g/L NaCl， 0.25 g/L MgSO47H2O， 1。

37、5.0 mg/L CaCl22H2O和10 mg/L维生素B1。 0017 发酵培养基为:蔗糖22.0 g/L， 13.5 g/L KH2PO4， 4.0 g/L (NH4)2H2PO4， 1.7 g/L 柠檬酸， 1.4 g/L MgSO47H2O， 10 mg/L的微量元素溶液 （10 g/L 柠檬酸铁， 2.25 g/L ZnSO47H2O， 10 g/L CuSO45H2O， 0.35 g/L MnSO4H2O， 0.23 g/L Na2B4O710H2O， 0.11 g/L (NH4)6Mo7O24， 2.0 g/L CaCl22H2O ） 分析方法 使用分光光度计 （Biomate。

38、 5， Thermo， N.Y.， USA） 进行菌浓检测。 细胞内的FucT2酶蛋白 使用12%的SDS-PAGE进行检测。 添加0.1 mM的IPTG 3 h后， 菌体被收集并调整浓度为7.2 g/ L。 使用50 mM的磷酸盐缓冲液 （pH 7.0） 进行重悬并进行超声破碎， 之后进行15000 g离心20 min将上清液沉淀分离。 之后进行凝胶电泳分析。 0018 使用高效液相色谱HPLC （Agilent Technologies 1200 Series） ， 配备Rezex ROA 有机酸柱H+ （Phenomenex， Torrance， Calif. USA） 和RI检测器 （。

39、Agilent， Palo Alto， Calif.， USA） 对2-FL产量进行分析。 柱子使用0.01 M 硫酸以0.6 mL/min的流速进行检测， 柱温50 。 0019 为了确认2-FL的纯度， 发酵培养液被收集并用LC/MS进行检测。 其中LC （Agilent Technologies 1100 Series） 配备Agilent Zorbax Eclipse ZDB-C8 （4.6x150 mm， 5微米） 柱子和一个Agilent LC/MSD捕获XCT Plus检测器。 柱子流速为0.4 ml/min， 洗脱程序为： 95% （v/v） 洗脱液A （15 mM 醋酸铵） 。

40、和5%洗脱液B （乙腈） 1 min； 6 min内将B液浓度从5%升到 95%， 之后95%的B液洗10 min。 其中MS的检测范围为70600 （m/z） 。 0020 一种2-岩藻糖基乳糖高产菌株 （Escherichia coli） 的制备方法， 具体步骤： （1） 构建E. coli BL21(DE3)-1： 说明书 4/10 页 7 CN 111471637 A 7 以Escherichia coli MG1655基因组为模板， 设计引物： 上游引物：manB-F： CCGGAATTC ATGATAAATATGGTCGTGTTGAGGA， 下游引物：manB-R： CGCGGAT。

41、CCTTACAAAAGAGTAACTTTATGCAAA； PCR扩增磷酸甘露糖变位酶(manB)表达基因表达基因manB序列； 将上述PCR产物与pCDF- Duet质粒进行EcoRI/BamHI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的manB基因片段与 pCDF-Duet质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构 建成功的质粒pCDF-Duet-manB； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：manC-F： CCCAAGCTTATGA。

42、GCTCACCTCT TATTCCGGTTA， 下游引物：manC-R： AAATATGCGGCCGCTCAATCTTCAAATCGAAGGATATCA； PCR扩增甘 露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manC)表达基因manC序列； 将上述PCR产物与pCDF-Duet-manB质 粒进行HindIII/NotI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的manC基因片段与pCDF- Duet-manB质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构 建成功的质粒pCDF。

43、-Duet-manB-manC； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：gmd-F： GGGAATTCCATATGTCAAAAGTCG CTCTCATCACCG， 与下游引物：gmd-R： CGGGGTACCATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACCG。 PCR扩增GDP- 甘露糖-4 ,6-脱水酶(gmd)表达基因gmd序列； 将上述PCR产物与pCDF-Duet-manB-manC质粒 进行NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的gmd基因片段与pCDF-Duet- manB-manC质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经。

44、热激转化E. coli JM109感受态， 链霉素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构 建成功的质粒pCDF-Duet-manB-manC-gmd； 以E. coli MG1655基因组为模板， 设计上游引物：flc-F： CCGGAATTCATGAGTAAACAACGA GTTTTTATTG， 下游引物：flc-R： CGCGGATCCTTACCCCCGAAAGCGGTCTTGATTC； PCR扩增GDP-L-岩 藻糖合酶(flc)表达基因flc序列； 将上述PCR产物与pACYC-Duet质粒进行EcoRI/BamHI双酶 切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将。

45、所获得的flc基因片段与pACYC-Duet质粒酶切片段利用 DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氯霉素抗性平板筛 选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的质粒pACYC-Duet-flc； 基于Helicobacter pylori基因组中提供的 -1,2-岩藻糖转移酶 （futC） 的序列， 由上 海生工基于大肠杆菌密码子偏好性合成futC序列， 设计上游引物：futC-F： GGGAATTCCATAT GGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTT， 下游引物：futC-R： CGCGGATCCTTAAGCGTTAT。

46、ACTTTTGGGATTTC； PCR扩增 -1,2-岩藻糖转移酶 （futC） 基因； 将上述PCR产物与pACYC-Duet质粒进行NdeI/ KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的futC基因片段与pACYC-Duet-flc质粒 酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氯霉 素抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的质粒 pACYC-Duet-flc-futC； 将上述质粒pCDF-Duet-manB-manC-gmd、 pACYC-Duet-flc-futC转化 大肠杆菌BL21。

47、 （DE3） 中构建E. coli BL21(DE3)-1； （2） 构建得到重组菌株E. coli BL21(DE3)-3： 以枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 168基因组为模板， 设计上游引物：scrB-F： CAT GCCATGGATGACAGCACATGACCAGGAGCTTC， 下游引物：scrB-R： CGCGGATCCCTACATAAGTGTCCAAAT 说明书 5/10 页 8 CN 111471637 A 8 TCCGACA； PCR扩增蔗糖转运蛋白之一的scrB表达基因scrB序列； 将上述PCR产物与pET-Duet 质粒进行NcoI/BamHI双酶。

48、切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将所获得的scrB基因片段与pET- Duet质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接产物经热激转化E. coli JM109感受 态， 氨苄抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和酶切或PCR验证， 得到构建成功的质 粒pET-Duet-scrB； 以E. coli K-12基因组为模板， 设计上游引物：scrY-F： GGGAATTCCATATGATGTATAAAAA AACAACTTTGGCAG， 下游引物：scrY-R： CGGGGTACCTTAAAACCAGGTTTCCATTTGGACA。 PCR扩增蔗糖 转运蛋白之一的scrY表达基因scr。

49、Y序列； 将上述PCR产物与pET-Duet质粒进行NdeI/KpnI双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后， 将 所获得的scrY基因片段与pET-Duet-scrB质粒酶切片段利用DNA连接酶进行过夜连接； 连接 产物经热激转化E. coli JM109感受态， 氨苄抗性平板筛选转化子并培养， 进行质粒提取和 酶切或PCR验证， 得到构建成功的质粒pET-Duet-scrB-scrY。 将上述质粒pET-Duet-scrB - scrY质粒转化至E. coli BL21(DE3) -1中， 获得重组菌株E. coli BL21(DE3)-2； 以E. coli BL21 （DE3） 基因组为模板。

50、， 设计基因敲除所需sgRNA及同源臂引物， PCR扩增 lacZ基因上下游同源臂； 胶回收之后得到纯的敲除基因片段， 接E. coli BL21(DE3)/pKD46 于30 培养， OD600达到0.1时， 加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱导pKD46- -red系统表 达， 当OD600达到0.30.4时， 制备感受态， 加入敲除基因片段于感受态中， 电转后， 敲除lacZ 基因， 获得重组菌E. coli BL21(DE3)-2/lacZ； 以上述的重组菌株E. coli BL21(DE3)-2/lacZ为出发菌株， 分别设计lacY-F： GGGA ATTCCATATGATGTA。