基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010277836.1 (22)申请日 2020.04.10 (71)申请人 廊坊天光生物技术有限公司 地址 065500 河北省廊坊市固安县新兴产 业示范园区肽谷生物医药产业园孵化 楼 (72)发明人 程勇张昊王征刘继来 (74)专利代理机构 北京志霖恒远知识产权代理 事务所(普通合伙) 11435 代理人 韩亚伟 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/53(2006.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名。

2、称 一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及 其应用 (57)摘要 本申请提供一种基于半酶的免洗免疫分析 检测方法及其应用， 包括以下步骤： (1)免洗免疫 分析试剂的制备； (2)免洗免疫分析检测。 本申请 首次将单体碱性磷酸酶分裂为两个半酶， 并和免 疫检测抗体对分别进行融合表达， 从而避免了传 统的免洗平台进行化学偶联的方法， 表达产物纯 度高， 均一性好， 本申请中该单体酶进行拆分后 没有活性， 但是在抗体对识别抗原将半酶拉到足 够近后， 两个半酶就会结合拥有单体酶的活性， 并能成功催化底物， 同时本申请避免了传统免疫 检测清洗的过程， 极大的降低了检测时对仪器的 依赖， 该检测方法稳定性。

3、好， 反应时间快， 操作方 便。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图5页 CN 111505307 A 2020.08.07 CN 111505307 A 1.一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法， 其特征在于： 包括以下步骤： (1)免洗免疫分析试剂的制备 将单体碱性磷酸酶phoX基因分裂成N-phoX和C-phoX两个半酶基因， 获取与待检测物相 匹配的抗体载体， 即Antibody_1-A、 Antibody_2-B； 将N-phoX克隆到Antibody_1的表达载体Antibody_1-A上， 融合表达在重链的C段， 转染 到CHO细胞中， 表达纯化获得半酶N-phoX-An。

4、tibody_1； 将半酶基因C-phoX克隆到Antibody_2的表达载体上， 融合表达在重链的C段， 转染到 CHO细胞中， 表达纯化获得半酶C-phoX-Antibody_2； 将N-phoX-Antibody_1和C-phoX-Antibody_2等比例混合， 即得免洗免疫分析试剂； (2)免洗免疫分析检测 将步骤(1)中获得的免洗免疫分析试剂加入到待检测样品中， 反应1小时， 然后加入反 应底物， 检测光强度， 根据待检测物的标准曲线测定样品中待检测物的含量。 2.如权利要求1所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法， 其特征在于， 所述半酶 N-phoX的氨基酸序列为SEQ ID。

5、 NO： 1。 3.如权利要求2所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法， 其特征在于， 所述半酶 C-phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO： 2。 4.如权利要求1所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法， 其特征在于， 所述免洗 免疫分析试剂的反应底物为对硝基笨磷酸盐、 酚酞磷脂酶和4-MUP中的一种。 5.如权利要求1所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法， 其特征在于， 所述待检 测物为小分子化合物， 脂类和蛋白质。 6.利用权利要求1-5所述的任意一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法在临床诊断和 药物开发领域的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111505307 A 2 。

6、一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用 技术领域 0001 本申请涉及免疫检测技术领域， 尤其涉及一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法 及其应用。 背景技术 0002 目前， 免洗的免疫分析平台主要有以下四个平台。 0003 第一个平台为荧光偏振免疫分析(FPIA:Fluorescent polarization immunoassay)， 该平台不是基于三明治夹心法， 而是采用竞争法， 只采用一株抗体进行检 测 。因 此 ， 特 异 性 较 差 ， 容 易 有 非 特 异 性 的 检 测【S m i t h D S ,E r e m i n SA.Anal.Bioanal.Chem.391。

7、(5),14991507(2008). 】 。 0004 第二个平台为荧光共振能量转移(FRET:Fluorescence resonance energy transfer)， 该检测方法利用在三明治系统中从供体到受体的光子能量转移来检测抗体和 抗原结合反应 【Lam AJ,St-Pierre F,.Nat.Meth.9(10),10051012(2012). 】 。 该方法的成 本较贵， 另外和抗体结合只能采用化学偶联的方法， 并且偶联效率较低， 均一性较差。 0005 第三个平台为发光氧通道免疫分析(LOCI:Luminescent oxygen-channeling immunoass。

8、ay),商品名为AlphaLISA， 德国PerkinElmer公司专利， 使用供体和受体珠(直径 250-350纳米)。 当供体珠被680nm光激发时， 它们释放出活性的单线态氧。 这种活化的单线 态氧在溶液中迅速衰变回基态。 然而， 如果受体珠在附近， 单重态氧分子可以将其能量转移 到受体珠中的化学发光化合物， 从而触发受体珠在615nm处发光。【Ullman EF,Kirakossian H,.Clin.Chem.42(9),15181526(1996). 】 。 和FRET一样， 和抗体结合只能采用化学偶联的 方法， 并且偶联效率较低， 均一性较差。 0006 第四个平台为DNA pr。

9、oximity平台， 将DNA探针偶联到抗体上， 利用抗体对识别抗 原后， 可以实现将抗体上偶联的DNA探针杂交， 并利用DNA可以扩增的优势来放大检测信号 【Assarsson ELM,Holmquist G,.PLoS ONE 9(4),e95192(2014)】 。 同样， 该方法采用化学偶 联的方法有明显的缺点， 另外， DNA扩增对环境要求极高， 容易出现假阳性的结果。 0007 采用分裂酶的方法进行蛋白和蛋白相互作用是目前基础研究领域常用的方法。 比 如HRP分裂酶 【Martell,J.D.Nature Biotechnology.VOLUME 34,NUMBER 7(2016)。

10、】 ， beta半 乳糖苷酶 【FABIO ROSSI,.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.94,pp.84058410,(1997)】 和荧 光素酶luciferase 【Ann-Marie Broome,.Mol Pharm.7(1):6074(2010). 】 。 0008 碱性磷酸酶是化学发光免疫方法学中常用的酶， 碱性磷酸酶有化学和动力学上稳 定的底物可用。 碱性憐酸酶作为信号酶， 具有较广的特异性底物， 当酶被固定后， 其酶活可 以迅速利用比色和终点突光检测法测定。 因此， 被广泛应用于医学、 免疫学和分析生物技 术。 目前常见的基因重组碱性磷酸酶来自大肠杆菌p。

11、hoA基因表达， 其活性结构是二聚体结 构， 因此很难进行酶分裂法。 说明书 1/8 页 3 CN 111505307 A 3 发明内容 0009 本申请为解决上述技术问题而提供一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其 制备方法。 0010 本申请所采取的技术方案是： 一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法， 其特征在 于： 包括以下步骤： 0011 (1)免洗免疫分析试剂的制备 0012 将单体碱性磷酸酶phoX基因分裂成N-phoX和C-phoX两个半酶基因， 获取与待检测 物相匹配的抗体载体， 即Antibody_1-A、 Antibody_2-B； 0013 将N-phoX克隆到Antibo。

12、dy_1的表达载体Antibody_1-A上， 融合表达在重链的C段， 转染到CHO细胞中， 表达纯化获得半酶N-phoX-Antibody_1； 0014 将半酶基因C-phoX克隆到Antibody_2的表达载体上， 融合表达在重链的C段， 转染 到CHO细胞中， 表达纯化获得半酶C-phoX-Antibody_2； 0015 将N-phoX-Antibody_1和C-phoX-Antibody_2等比例混合， 即得免洗免疫分析试 剂； 0016 (2)免洗免疫分析检测 0017 将步骤(1)中获得的免洗免疫分析试剂加入到待检测样品中， 反应1小时， 然后加 入反应底物， 检测光强度， 根。

13、据待检测物的标准曲线测定样品中待检测物的含量。 0018 进一步的， 所述半酶N-phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 0019 进一步的， 所述半酶C-phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO： 2。 0020 进一步的， 所述免洗免疫分析试剂的反应底物为对硝基笨磷酸盐、 酚酞磷脂酶和 4-MUP中的一种。 0021 进一步的， 所述待检测物为小分子化合物、 脂类和蛋白质。 0022 利用上述的任意一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法在临床诊断和药物开发 领域的应用。 0023 本申请具有的优点和积极效果是： 本申请首次将单体碱性磷酸酶分裂为两个半 酶， 并和免疫检测抗体对分别进行。

14、融合表达， 从而避免了传统的免洗平台进行化学偶联的 方法， 表达产物纯度高， 均一性好， 本申请中该单体酶进行拆分后没有活性， 但是在抗体对 识别抗原将半酶拉到足够近后， 两个半酶就会结合拥有单体酶的活性， 并能成功催化底物， 同时本申请避免了传统免疫检测清洗的过程， 极大的降低了检测时对仪器的依赖， 该检测 方法稳定性好， 反应时间快， 操作方便。 0024 除了上面所描述的本申请解决的技术问题、 构成技术方案的技术特征以及由这些 技术方案的技术特征所带来的优点之外， 本申请所能解决的其他技术问题、 技术方案中包 含的其他技术特征以及这些技术特征所带来的优点， 将在下文中作进一步详细的说明。。

15、 附图说明 0025 图1是本申请实施例提供的phoX单体碱性磷酸酶拆分示意图； 0026 图2是本申请实施例提供的免洗免疫检测示意图； 0027 图3是本申请实施例提供的pcDNA3.1-FKBP载体构建成功的电泳图； 0028 图4是本申请实施例提供的pcDNA3.1-FRB载体构建成功的电泳图； 说明书 2/8 页 4 CN 111505307 A 4 0029 图5是本申请实施例提供的对照组phoX的剂量-反应曲线图； 0030 图6是本申请实施例提供的N-phoX-FKRB和C-phoX-FRB混合组的剂量-反应曲线 图； 0031 图7是本申请实施例二提供的性能指标考核中剂量-反应。

16、曲线验证的第一次测定 曲线； 0032 图8是本申请实施例二提供的性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第二次测定 曲线； 0033 图9是本申请实施例二提供的性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第三次测定 曲线； 0034 图10是本申请实施例提供的健康人血清与性肿瘤病例血清剂量-反应曲线图。 具体实施方式 0035 下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。 可以理解的是， 此处所描 述的具体实施例仅仅用于解释相关发明， 而非对该发明的限定。 另外还需要说明的是， 为了 便于描述， 附图中仅示出了与发明相关的部分。 0036 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本发明中的实施例及实施例中的。

17、特征可以相 互组合。 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 0037 实施例一N-phoX、 C-phoX和N-phoX/C-phoX混合酶的活性检测 0038 (1)phoX、 N-phoX-FKRB、 C-phoX-FRB和N-phoX/C-phoX混合酶的制备 0039 S1、 将Pasteurella multocida中的phoX基因瞬时转染CHO细胞， 收集分泌的上清， 即得单体碱性磷酸酶phoX。 0040 S2、 将Pasteurellamultocida中的phoX基因分裂成N-phoX和C-phoX两个半酶基 因， 如图1所示， 并优化两个半酶基因。 0041 S3。

18、、 如图3所示， 将优化后合成的N-phoX基因克隆到pcDNA3.1-FKBP中， C-phoX基因 克隆到pcDNA3.1-FRB中， 接着瞬时转染CHO细胞， 收集分泌的上清， 即获得N-phoX-FKRB半 酶。 0042 S4、 如图4所示， 将优化后合成的C-phoX基因克隆到pcDNA3.1-FRB中， 接着瞬时转 染CHO细胞， 收集分泌的上清， 即获得C-phoX-FRB半酶。 0043 本实施例中， 在雷帕霉素的作用下， 将介导FKBP蛋白和FRB蛋白结合 【Choi,J., Chen,J.Science 273,239242(1996). 】 ， FKBP蛋白和FRB蛋白。

19、结合将导致N-phoX和C-phoX 结合， 从而拥有完整碱性磷酸酶phoX的活性。 0044 (2)phoX、 N-phoX-FKRB、 C-phoX-FRB和N-phoX/C-phoX混合酶活性的检测 0045 S5、 将phoX、 N-phoX-FKRB、 C-phoX-FRB稀释至10pg/ml， 100pg/ml,1ng/ml,10ng/ ml,100ng/ml备用 0046 S6、 用稀释液(0.5mol PBS+1BSA)将雷帕霉素配置1mMol/L备用 0047 S7、 将各组样本加入空白反应杯， 加样方式如表1所示： 0048 表1 说明书 3/8 页 5 CN 111505。

20、307 A 5 0049 0050 (3)加样后37反应1小时， 每个反应杯中加入50微升碱性磷酸酶的底物(购买自 ThermoFisher T2142)， 用中生百克BHP9504化学放光仪检测光强度。 结果如表2所示： 0051 表2 0052 0053 根据表2绘制对照组、 N-phoX-FKRB和C-phoX-FRB混合组剂量-反应曲线， 如图5和 图6所示。 0054 结果由表2， 以及图5和图6所示， N-phoX-FKRB和C-phoX-FRB混合组的酶活性基本 和对照组一致且不同浓度有线性关系， 而单独的N-phoX-FKRB及C-phoX-FRB没有活性。 0055 实施例二。

21、VEGF免洗检测试剂的制备 0056 1、 N-phoX-VEGF1和C-phoX-VEGF2的制备 0057 将N-phoX基因克隆到pcDNA3.1-VEGF1-H载体(实验室保存的VEGF标记抗体表达载 体)的C端， 得到pcDNA3.1-VEGF1-H_N-phoX， 质粒大提， 去内毒素， 与pcDNA3.1-VEGF1-L共转 染CHO细胞， 连续补料培养10天后， 将收集的所有上清浓缩， ProteinA亲和纯化， 即得抗体N- phoX-VEGF1。 0058 将C-phoX基因克隆到pcDNA3.1-VEGF2-H载体(实验室保存的VEGF标记抗体表达载 体)的C端， 得到p。

22、cDNA3.1-VEGF2-H_C-phoX。 质粒大提， 去内毒素， 与pcDNA3.1-VEGF2-L共转 染CHO细胞， 连续补料培养10天后， 将收集的所有上清浓缩， ProteinA亲和纯化， 即得抗体C- phoX-VEGF2。 0059 2、 VEGF免洗检测试剂性能指标考核 0060 参照YY/T1175-2010肿瘤标志物定量测定试剂(盒)化学发光法行业标准对VEGF免 洗检测试剂性能指标验证。 0061 (1)VEGF免洗检测试剂的性能验证指标 0062 a、 最低检测限： 应不高于40pg/mL。 0063 b、 剂量-反应曲线的线性： 说明书 4/8 页 6 CN 11。

23、1505307 A 6 0064 在线性区间40pg/mL800pg/mL内， 剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于 0.9900。 0065 c、 准确度 0066 以VEGF免洗检测试剂检测国际标准品， 准确度应在90110范围内。 0067 d、 精密度 0068 精密度(CV)应不大于10。 0069 e、 特异性 0070 20g/ml的人成纤维细胞生长因子2(FGF2)， 30ng/ml的表皮生长因(EGF)， 检测表观 值应不大于50pg/ml。 0071 (2)实验配置 0072 S1、 校准品配置 0073 将VEGF抗原(久丰润达， 20190306， 0.15mg/m。

24、l)用抗原稀释液(0.5mol PBS+1 BSA)稀释6个梯度(0pg/ml、 50pg/ml、 200pg/ml、 800pg/ml、 1600pg/ml、 3200pg/ml)。 0074 S2、 国际标准品(NIBSC 02/286)配置 0075 将用抗原稀释液(0.5mol PBS+1BSA)稀释6个梯度(0pg/ml、 50pg/ml、 200pg/ml、 800pg/ml、 1600pg/ml、 3200pg/ml)。 0076 S3、 质控品配置 0077 将VEGF抗原(购自久丰润达， 20190306， 0.15mg/ml)用抗原稀释液(0.5mol PBS+ 1BSA)。

25、稀释成QC1(200pg/ml10),QC2(1750pg/ml10)。 0078 S4、 特异性样本配置 0079 将FGF2(NIBSC 91/550)和EGF(NIBSC 90/712)用稀释液(0.5mol PBS+1BSA)分 别稀释成20 g/ml和30ng/ml。 0080 S5、 将N-phoX-VEGF1用稀释液(0.5mol PBS+1BSA)稀释至10ng/ml。 0081 S6、 将C-phoX-VEGF2用稀释液(0.5mol PBS+1BSA)分别稀释至10ng/ml。 0082 (3)加样操作 0083 分别取上述配置的S1-S4的VEGF校准品、 国际标准品， 。

26、质控品及标本各50 l加入相 应空白发光板板孔内， 再加上述步骤S5和S6配置好的N-phoX-VEGF1和C-phoX-VEGF2各50ul 加入各孔， 振荡器振荡30秒钟， 使其充分混合均匀， 然后盖上封板膜， 置37温育60分钟， 最 后每孔加入底物液100ul(购买自ThermoFisher T2142)， 用中生百克BHP9504化学发光仪检 测化学发光强度(RLU)。 0084 (4)性能指标考核 0085 S7、 最低检测限 0086平行测定20孔零校准品(0pg/ml)的相对发光强度， 计算发光值平均值和标准偏 差SD， 用剂量-反应曲线计算发光值为时对应的浓度值即为最低检出限。

27、。 0087 表3 说明书 5/8 页 7 CN 111505307 A 7 0088 0089 结果， 最低检测限为4.11pg/ml,不高于40pg/mL， 符合指标。 0090 S8、 剂量-反应曲线的线性 0091 复孔测定试剂盒的参考品(M0M5， 浓度依次为0pg/ml、 50pg/ml、 200pg/ml、 800pg/ml、 1600pg/ml、 3200pg/ml)， 平行测定三次， 用四参数进行拟合， 三次测定的剂量-反 应曲线如图7、 图8和图9所示。 测定的剂量-反应曲线线性相关系数(R)如表4所示。 0092 表4 0093 第一次测第二次测第三次测 线性相关系数R0。

28、.99990.99990.9999 0094 由图7、 图8和图9， 以及表4可知， 连续三次测定0-3200pg/mL浓度范围VEGFA抗原曲 线， 线性相关系数R均大于0.9990， 符合指标。 0095 S9、 准确度 0096 将国际标准品(13ug/支)稀释成理论浓度为50pg/ml、 200pg/ml、 800pg/ml、 1600pg/ml、 3200pg/m标本， 检测3次， 计算测定浓度与理论浓度的比值， 如表5所示： 0097 表5 0098 0099 结果， 连续三次检测由VEGF国际标准品配制的准确性标本， 结果准确度均在95 105范围内， 在90110要求， 符合指。

29、标。 0100 S10、 精密度 0101 平行测定质控品Q1和质控品Q2各10孔， 并记录相应发光强度， 各孔分别按照公式 计算CV， 计算结果如表6所示。 0102 0103式中： 质控品测定浓度值的平均值 0104 SD质控品测定浓度值的标准差 0105 表6 说明书 6/8 页 8 CN 111505307 A 8 0106 0107 0108 结果， 连续三次平行测定QC1、 QC2， 结果均小于2， 不大于10要求， 符合指标。 0109 S11、 特异性 0110 在稀释液中分别加入人成纤维细胞生长因子2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)， 配制 成含20 g/ml的FGF2样。

30、本和30ng/ml的EGF样本， 进行检测， 测定结果如表7所示： 0111 表7 0112 项目发光值浓度值(pg/mL) 人成纤维细胞生长因子2(20 g/mL)1614910.496 表皮生长因子(30ng/mL)104097.235 0113 结果， 人成纤维细胞生长因子2(20 g/mL)和表皮生长因子(30ng/mL)， 检测表观值 分别为10.496pg/ml和7.235pg/ml， 不大于50pg/ml， 符合要求。 0114 本实施例中， VEGF免洗检测试剂的最低检测限、 剂量-反应曲线、 准确性、 精密度和 特异性性能指标均符合现有技术要求并优于市场现有方法学试剂。 01。

31、15 实施例三VEGF免洗检测试剂的临床应用： 检测人血清VEGF的量 0116 选取40份健康人血清标本及10份经确诊的恶性肿瘤病例血清， 用本申请的基于半 酶的免洗免疫分析检测方法及电化学发光法VEGF试剂盒对40份健康人血清标本及10份经 确诊的恶性肿瘤病例血清进行检测， 在临床上健康人血清发光值均小于200； 性肿瘤病例血 清发光值均高于400。 0117 (1)40份健康人血清标本检测发光强度如表8所示： 0118 表8 0119 0120 0121 (2)10份恶性肿瘤血清标本检测发光强度如表9所示： 0122 表9 0123 电化学法免洗检测电化学法免洗检测 说明书 7/8 页 。

32、9 CN 111505307 A 9 1706.09774.835802.98960.932 21429.261609.757732.98803.134 3419.19514.9368895.36921.43 4697.07765.3359702.73729.186 5708.96798.90410586.90596.736 0124 根据表8和表9绘制健康人血清与性肿瘤病例血清剂量-反应曲线， 如图10所示。 0125 结果由表8和表9所示， 基于半酶的免洗免疫分析检测方法与现有的电化学发光法 检测方法临床诊断结果符合率100。 0126 如图10所示， 基于半酶的免洗免疫分析检测方法检测浓。

33、度结果与已有电化学发光 法检测浓度结果相关性R为0.9979， 符合YY/T1175-2010肿瘤标志物定量测定试剂(盒)化学 发光法行业标准。 0127 本实施例中， 临床样本检测结果VEGF免洗检测试剂与市场现有较先进的电化学发 光法检测结果相符， 免洗检测方法相对电化学发光法免去了复杂的洗涤步骤操作更为简单 有效。 0128 以上对本发明的实施例进行了详细说明， 但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。 凡依本发明的申请范围所作的均等变化与改进 等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。 说明书 8/8 页 10 CN 111505307 A 10 序列。

34、表 廊坊天光生物技术有限公司 一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用 2 SIPOSequenceListing 1.0 1 436 PRT Pasteurella multocida 1 Met Thr Asn Ser Val Gln Glu Asn Ile Val Met Asn Pro Ser Asp Asn 1 5 10 15 Cys Leu Met Ser Asp Val Met Lys Val Asn Leu Ser Arg Arg Lys Ile 20 25 30 Leu Gln Phe Gly Gly Ala Met Gly Ala Ile Ala Leu Leu Pro 。

35、Ala Ala 35 40 45 Phe Gly Ser Arg Ser Ala Phe Ala Asn Pro Ser Gln Pro Leu Gln Ile 50 55 60 Arg Lys Ile Thr Asn Leu Thr Phe Thr Ser Ile Pro Phe Ser Thr Glu 65 70 75 80 Asp Arg Val Ile Val Pro Lys Gly Tyr Ser Ala Lys Ala Phe Tyr Ala 85 90 95 Trp Gly Asp Pro Val Gly Leu Glu Asn Asn Asn Pro Gln Phe Lys V。

36、al 100 105 110 Asp Ala Ser Asn Ser Ala Glu Glu Gln Ala Ala Gln Ala Gly Met Asn 115 120 125 His Asp Gly Met Ala Tyr Phe Pro Phe Ala Glu His Gly Asn Glu His 130 135 140 Gly Leu Leu Val Met Asn His Glu Tyr Ile Asp Asn Gly Leu Leu Phe 145 150 155 160 Pro Asp Gly Asp Lys Thr Trp Ser Leu Asp Lys Val Lys L。

37、ys Ser Gln 165 170 175 Asn Ala Met Gly Ile Ser Val Ile Glu Ile Lys Lys Val Asn Gln Gln 180 185 190 Trp Glu Val Val Arg Pro Ser Lys Tyr Ala Arg Arg Ile Thr Pro His 195 200 205 Thr Pro Met Arg Leu Thr Gly Pro Ala Lys His Asn Glu Leu Met Lys 210 215 220 序列表 1/3 页 11 CN 111505307 A 11 Thr Val Ala Asp Pr。

38、o Leu Gly Glu Phe Val Leu Gly Thr Met Gln Asn 225 230 235 240 Cys Ala Asn Gly Glu Thr Pro Trp Arg Thr Tyr Leu Thr Cys Glu Glu 245 250 255 Asn Trp Ser Asp Ile Phe Val Arg Glu Ser Gly Asp Phe Thr Lys Leu 260 265 270 Asp Lys Arg Tyr Gly Ile Met Lys Lys Glu Lys Glu Asp Lys Tyr Arg 275 280 285 Trp Asn Gl。

39、u Phe Asp Glu Arg Phe Asn Thr Asp Lys His Pro Asn Glu 290 295 300 Pro His Arg Phe Gly Trp Val Val Glu Ile Asp Pro Phe Asp Pro Asn 305 310 315 320 Ser Thr Pro Val Lys His Thr Ala Leu Gly Arg Phe Lys His Glu Gly 325 330 335 Ala Met Leu Val Leu Ser Lys Glu Gly His Ala Val Val Tyr Met Gly 340 345 350 As。

40、p Asp Gln Arg Phe Glu Tyr Ile Tyr Lys Phe Val Ser Lys Gly Lys 355 360 365 Tyr Asn Pro Ala Asp Arg Ala Ala Asn Met Tyr Leu Leu Ser Glu Gly 370 375 380 Thr Leu Tyr Val Ala His Phe Asn Glu Asp Asn Thr Gly Glu Trp Arg 385 390 395 400 Pro Leu Val His Asn Gln Asn Gly Leu Thr Ala Glu Asn Gly Phe Leu 405 41。

41、0 415 Asn Gln Gly Asp Val Thr Ile Lys Ala Arg Met Ala Ala Asp Val Val 420 425 430 Gly Gly Thr Lys 435 2 211 PRT Pasteurella multocida 2 Met Asp Arg Pro Glu Trp Ile Ala Val Asp Pro Tyr Gln Thr Gly Ser 1 5 10 15 Val Tyr Cys Thr Leu Thr Asn Asn Ser Gln Arg Gly Thr Glu Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Ile Asp A。

42、la Ala Asn Pro Arg Val Lys Asn Ser Tyr Gly His 35 40 45 序列表 2/3 页 12 CN 111505307 A 12 Ile Ile Arg Trp Gln Glu Asn Asp Gln Asp Tyr Leu Ser Glu Thr Phe 50 55 60 Ser Trp Asp Ile Phe Ala Leu Gly Gly Asn Lys Ser Lys Gly Glu Asn 65 70 75 80 His Val Asn Gly Asp Asp Phe Gly Ser Pro Asp Gly Leu Arg Phe Asp 。

43、85 90 95 Asn His Gly Ile Leu Trp Val Gln Thr Asp Val Ser Ser Ser Thr Leu 100 105 110 Asn Lys Lys Ala Tyr Glu Gly Met Gly Asn Asn Gln Met Leu Ala Val 115 120 125 Ile Pro Glu Gln Gly Glu Phe Lys Arg Phe Leu Thr Ala Pro Asn Gly 130 135 140 Ser Glu Val Thr Gly Ile Ala Phe Thr Pro Asp Asn Lys Thr Met Phe。

44、 145 150 155 160 Ile Asn Ile Gln His Pro Gly Glu Pro Asp Ser Gly Val Thr Glu Pro 165 170 175 Asp Gln Val Thr Ala Ile Ser Thr Trp Pro Asp Arg Gln Gly Lys Thr 180 185 190 Arg Pro Arg Ser Ala Thr Val Val Ile Gln Lys Glu Asp Gly Gly Val 195 200 205 Ile Ser Ser 210 序列表 3/3 页 13 CN 111505307 A 13 图1 图2 说明书附图 1/5 页 14 CN 111505307 A 14 图3 图4 说明书附图 2/5 页 15 CN 111505307 A 15 图5 图6 说明书附图 3/5 页 16 CN 111505307 A 16 图7 图8 图9 说明书附图 4/5 页 17 CN 111505307 A 17 图10 说明书附图 5/5 页 18 CN 111505307 A 18 。