红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010515399.2 (22)申请日 2020.06.08 (71)申请人 上海市普陀区中心医院 地址 200062 上海市普陀区兰溪路164号 (72)发明人 蒋元烨曹勤韩吉林辉 田继云李美莺冯明丽耿赟 公培强 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 周春洪 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的方 法 (。

2、57)摘要 本发明涉及一种红豆杉枝叶中10-DAB含 量测定的方法， 所述的方法采用水-丙酮(50:50) 混合溶剂超声提取， 所述的方法采用2 .1 100mm,1.7m的苯基柱， 所述的方法采用流速为 0.3-0.6mL/min。 本发明优点在于： 本发明红豆杉 枝叶中10-DAB含量测定的前处理方法中采用 水-丙酮(50:50)混合溶剂超声提取， 既能保证有 效成分的提出， 同时杂质较少， 基线平稳， 分离度 与峰形均有显著性改善。 我们建立的超高效液相 色谱UHPLC具有高效， 快捷， 操作简便的特点， 9分 钟便能完成一个样本分析， 大大节省了时间， 分 析效率提升了近3倍。 将流速。

3、提升为0.6mL/min， 节省了样本的分析时间， 且杂质不干扰样品检 测。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 111505172 A 2020.08.07 CN 111505172 A 1.一种红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的方法， 其特征在于： 所述的方法采用水-丙酮 (50:50)混合溶剂超声提取， 所述的方法采用2.1100mm,1.7 m的苯基柱， 所述的方法采用 流速为0.3-0.6mL/min。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述的流速为0.6mL/min。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述的超声处理条件为功率50W， 频率 53kH。

4、z， 时间30分钟。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 线性关系考察中的回归方程： y 5357700 x-10710， r0.9999， 表明10-DAB在0.01910.609mg/mL线性良好。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111505172 A 2 一种红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的方法 技术领域 0001 本发明涉及红豆杉枝叶含量测定技术领域， 具体地说， 是关于一种红豆杉枝叶中 10-DAB含量测定的方法。 背景技术 0002 红豆杉是一种古老的天然珍稀抗癌植物， 属于红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属 (Taxus genus)， 在地球上已有250万年的。

5、历史。 南方红豆杉为我国特有品种， 是生长最快， 分布最广的红豆杉属植物。 目前从南方红豆杉中发现的紫杉醇(Taxol)是世界上公认的有 效抗癌物质之一。 紫杉醇分布在红豆杉的根、 皮、 茎、 叶中， 但是含量有限。 10-脱乙酰巴卡亭 III(10-DAB)是南方红豆杉的指标性成分， 含量丰富， 可用于合成紫杉醇或活性更强的多烯 紫杉醇， 从一定程度上解决了紫杉醇资源有限的问题。 目前关于南方红豆杉中10-DAB的含 量测定方法存在分析时间长， 样品前处理方法复杂， 色谱图基线漂移， 分离效果差的问题。 本文建立了UPLC测定南方红豆杉中10-Dab含量的方法， 并优化了前处理工艺， 操作简。

6、便， 基 线平稳， 分离效果强， 重复性好。 0003 中国专利文献CN104892550A公开了一种从红豆杉中提取分离10-去乙酰基巴卡丁 (10-DAB)的方法。 中国专利文献CN1473821A公开了一种提取与纯化10去乙酰基巴卡 丁(10DAB)的方法。 但是关于分析时间短， 样品前处理方法简单， 分离效果好的一种 红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的方法目前还未见报道。 发明内容 0004 本发明的第一个目的是， 针对现有技术中的不足， 提供一种红豆杉枝叶中10-DAB 含量测定的方法。 0005 为实现上述第一个目的， 本发明采取的技术方案是： 0006 一种红豆杉枝叶中10-DAB。

7、含量测定的方法， 所述的方法采用水-丙酮(50:50)混 合溶剂超声提取， 所述的方法采用2.1100mm,1.7 m的苯基柱， 所述的方法采用流速为 0.3-0.6mL/min。 0007 所述的流速为0.6mL/min。 0008 所述的超声处理条件为功率50W， 频率53kHz， 时间30分钟。 0009 线性关系考察中的回归方程： y5357700 x-10710， r0.9999， 表明10-DAB在 0.01910.609mg/mL线性良好。 0010 本发明优点在于： 本发明红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的前处理方法中采用 水-丙酮(50:50)混合溶剂超声提取， 既能保证有效。

8、成分的提出， 同时杂质较少， 基线平稳， 分离度与峰形均有显著性改善。 我们建立的超高效液相色谱UHPLC具有高效， 快捷， 操作简 便的特点， 9分钟便能完成一个样本分析， 大大节省了时间， 分析效率提升了近3倍。 将流速 提升为0.6mL/min， 节省了样本的分析时间， 且杂质不干扰样品检测。 说明书 1/4 页 3 CN 111505172 A 3 附图说明 0011 图1 UPLC色谱图(A)红豆杉样品； 0012 图2 UPLC色谱图(B)空白； 0013 图3 UPLC色谱图(C)标准品。 具体实施方式 0014 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0015 实。

9、施例1 0016 1材料 0017 仪器： Waters ACQIUTY UPLC H CLASS； 超声波清洗器； 电子天平； 0018 材料： 10-Dab对照品， 南方红豆杉叶粉末(过18目筛)； 乙腈， 甲酸(色谱纯， Thremo)； 超纯水， 其他分析试剂购自国药。 0019 2方法与结果见图1， 图2和图3。 0020 2.1对照品溶液制备 0021 精密称取10-Dab对照品12.18mg置于20mL的容量瓶中， 加入甲醇定容至刻度混 匀， 制得0.609mg/mL的标准品溶液,并稀释成0.3045,0.1523,0.762,0.381,0.191mg/mL。 0022 2.2。

10、色谱条件及系统适应性试验 0023 色谱柱:Acquity BEH Phenyl(2.1100mm,1.7 m)流动相： 乙腈(A)： 水(B)， 梯度 洗脱条件： 0-0.3 15A,0.3-5.0 22A,5.0-6.0 95A,6.0-9.095A； 流速0.6mLmin -1； 柱温55； 紫外检测波长227nm， 进样体积2 L， 运行时间9min。 0024 2.3供试品提取溶剂选择 0025 (1)称取南方红豆杉叶粉末3.33g置于具塞锥形瓶， 分别添加100.0mL(50丙酮溶 液)(A)、 甲醇(B)、 乙醇(C)、 丙酮(D)， 封闭瓶口于室温下超声提取30mins(功率为。

11、53khz)， 过 0.22 m滤膜后得供试品， 进样2 L分析。 结果发现使用甲醇， 乙醇提取的样品成分复杂， 难以 直接得到单一的10-Dab色谱峰， 需要进一步使用二氯甲烷萃取提纯， 该操作复杂费时， 不 利于样本的快速检测。 而使用丙酮和50的丙酮溶液提取样品快速简便， 均可以直接检测， 且待测成分不受杂质的干扰， 进一步考虑成本因素， 最终选择(A)溶剂进行供试品制备。 0026 2.4线性关系考察 0027 按2.2项下的色谱条件分别进浓度为0.609， 0.3045， 0.1523， 0.0762， 0.0381， 0.0191mg/mL的10-Dab标准品溶液2 L， 以浓度为。

12、横坐标， 峰面积为纵坐标， 绘制标准曲 线。 最终得到回归方程： y5357700 x-10710， r0.9999， 表明10-DAB在0.01910.609mg/ mL线性良好。 0028 2.5精密度试验 0029 将高、 中、 低浓度的标准品溶液按上述色谱条件连续进样5次， RSD为0.3， 0.2， 0.2； 连续5天进样， RSD为0.7， 0.9， 1.1， 表明日内和日间精密度良好。 0030 2.6稳定性试验 0031 取1号样品的供试品溶液分别于0、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24h进样分析， RSD为1.21， 结 果表明在该方法下检测， 样品的稳定性良好。 。

13、0032 表1稳定性实验结果 说明书 2/4 页 4 CN 111505172 A 4 0033 0034 2.7重复性试验 0035 平行取同一批样品6份， 按2.3方法制备后进样分析， 结果发现RSD为1.13。 说明 本方法适用于样品中10-DAB的提取和分析。 0036 表2重复性实验结果 0037 0038 2.8加样回收率试验 0039 精密称定已测定含量的南方红豆杉1号样品枝叶6份， 每份约1.67g， 分别精密加入 10-DAB对照品溶液， 制成供试品溶液， 计算10-DAB的平均回收率为96.07， RSD为 1.42。 0040 表3加样回收率实验 0041 0042 2.。

14、9南方红豆杉枝叶中10-DAB含量测定 0043 精密称取13批不同产地、 类别的红豆杉枝叶粉末(过二号筛)3.3g， 置具塞锥形瓶 中， 精密加入50的丙酮溶液100mL， 密塞， 称定重量， 超声处理(功率50W， 频率53kHz)30分 钟， 放冷后称定重量， 并用提取溶液补足重量， 摇匀离心， 取上清液进样分析， 结果见表4。 不 同种类的红豆杉叶样品中10-DAB的含量差异较大， 其中5号样品含量最高， 为1.483， 8 号样品仅为0.178。 其余批次的红豆杉叶中10-DAB的含量分别在1.1和0.5左右。 除 了10-DAB含量差异外， 不同类别的红豆杉叶化学成分含量也有所不同。

15、， 色谱图也有一定 说明书 3/4 页 5 CN 111505172 A 5 的差异， 然而我们建立的新方法能满足所有红豆杉叶样本的含量分析。 0044 表4含量测定结果 0045 0046 讨论： 0047 1.目前关于红豆杉枝叶中10-DAB含量测定的前处理方法复杂。 现有报道中多采 用甲醇、 乙醇超声提取， 再使用二氯甲烷或正己烷萃取， 然后蒸干定容， 步骤复杂且色谱图 分离度仍然不佳。 本发明采用水-丙酮(50:50)混合溶剂超声提取， 既能保证有效成分的提 出， 同时杂质较少， 基线平稳， 分离度与峰形均有显著性改善。 0048 2.分析方法： 现有关于测定红豆杉叶中10-DAB的分。

16、析方法多采用HPLC， 其分析 时间较长， 一个样品一般需要25分钟才能完成分析。 我们建立的超高效液相色谱UHPLC具有 高效， 快捷， 操作简便的特点， 9分钟便能完成一个样本分析， 大大节省了时间， 分析效率提 升了近3倍。 0049 3.关于仪器参数改良： (1)流速： 我们在实验中进一步对仪器参数进行了改良， 一 般UHPLC流速为0.3mL/min。 在流速为0.3mL/min， 且其他分析条件不变的情况下， 10-DAB 的出峰时间为9分钟左右， 样本的分析时间为20分钟。 在此基础上， 我们进一步追求高效的 样本分析效率， 将流速提升为0.6mL/min， 节省了样本的分析时间。

17、， 且杂质不干扰样品检测。 (2)柱温： 由于该方法采用的流速较高， 使用高柱温可以降低柱子的压力， 提高柱子的寿命。 当流速为0.6mL/min， 流动相为初始比例， 柱温30度时， 柱压高达7400bar左右,在此条件下 长期分析样品对仪器和柱子损害较大。 而柱温升高到55度时， 压力为5700bar左右， 可以正 常分析样本。 0050 4.色谱柱的选择： 本实验采用的色谱柱为Acquity BEH Phenyl(2.1100mm,1.7 m)苯基柱。 此外， 我们在采用传统C18和C8色谱柱进行样本分析时发现， 10-DAB在C18柱上分 析时峰型有严重的拖尾， 在C8色谱柱上则出峰较快， 杂质对检测有极大干扰。 0051 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说明书 4/4 页 6 CN 111505172 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 111505172 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 111505172 A 8 。