SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010392553.1 (22)申请日 2020.05.11 (71)申请人 广州派真生物技术有限公司 地址 510663 广东省广州市高新技术产业 开发区科学城揽月路3号广州国际企 业孵化器G区G304房 申请人 广州中医药大学 （广州中医药研究 院） (72)发明人 周泽鑫刘中秋廖国超李华鹏 张超戚笑笑陈君霖杨德盈 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 郭炜绵 (51)Int.Cl. C07K 14/165(2006.01) C12。

2、N 15/50(2006.01) C12N 15/864(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (54)发明名称 SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒 和在制备疫苗中的应用 (57)摘要 本发明公开了SARS-COV-2抗原多肽及其重 组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用， 所述的抗 原多肽序列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。 所述的 重组腺 相关 病毒是将将pHelper 、 pRep2Cap5和抗原多肽的表达载体共孵育， 在转 染试剂聚乙烯亚胺存在的条件下转染细胞， 培育 细胞后， 经过裂解和纯化， 。

3、得到含有重组腺相关 病毒的纯化液。 本发明的重组腺相关病毒在体内 递送表达产生融合抗原多肽， 诱导产生血清中和 抗体， 对SARS-COV-2新冠病毒具有中和效价， 并 持续表达， 可用于对人进行针对COVID-19新冠肺 炎的免疫接种。 权利要求书1页 说明书6页 序列表7页 附图3页 CN 111518175 A 2020.08.11 CN 111518175 A 1.SARS-COV-2抗原多肽， 其特征在于为以下氨基酸序列中的一种： 、 SEQ.ID.NO.1； 、 在SEQ.ID.NO.1的C段延长一段附加氨基酸， 所述附加氨基酸的序列如SEQ.ID.NO.3 所示； 、 SEQ.I。

4、D.NO.2； 、 与、 或具有至少90序列相似性的氨基酸序列。 2.编码权利要求1所述抗原多肽的核苷酸序列。 3.权利要求1所述抗原多肽的表达载体。 4.根据权利要求3所述的表达载体， 其特征在于： 含有腺相关病毒反向末端重复序列、 编码信号肽的核苷酸序列， 以及编码权利要求1所述抗原多肽的核苷酸序列。 5.根据权利要求4所述的表达载体， 其特征在于： 所述编码抗原多肽的核苷酸序列经过 人源密码子优化。 6.根据权利要求4所述的表达载体， 其特征在于： 所述的ITR序列来自血清型AAV2。 7.一种表达权利要求1所述抗原多肽的重组腺相关病毒。 8.一种表达权利要求1所述抗原多肽的重组腺相关病。

5、毒的制备方法， 其特征在于： 将pHelper、 pRep2Cap5和权利要求3-6任一项所述的表达载体共孵育， 在转染试剂聚乙 烯亚胺存在的条件下转染细胞， 培育细胞后， 离心收集细胞， 经过裂解和纯化， 得到含有重 组腺相关病毒的纯化液。 9.权利要求7所述的重组腺相关病毒在制备预防新冠病毒肺炎疫苗中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于： 所述的疫苗还包含药学上可接受的稀释 剂和/或赋形剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111518175 A 2 SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的 应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体。

6、涉及SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相 关病毒 和在制备疫苗中的应用。 背景技术 0002 冠状病毒(Coronavirus)是自然界中广泛存在的一大类RNA病毒， 仅可感 染脊椎 动物。 在人类中， 冠状病毒可引起感冒、 严重急性呼吸综合征(SARS) 和中东呼吸综合征 (MERS)等严重呼吸道疾病。 0003 新型冠状病毒SARS-COV-2隐匿性和传染性很强， 既可引起无症状感染， 也可引起 病毒性肺炎、 严重呼吸综合征、 肾衰竭及死亡， 研制COVID-19预防 性疫苗的工作极为重要 和紧迫。 0004 SARS-COV-2新冠病毒突刺(Spike)糖蛋白通过结合人体内细胞人血管。

7、紧 张素转 化酶2(ACE2)受体入侵机体， 因此突刺(Spike)糖蛋白是研发疫苗的 关键靶标。 0005 野生型腺相关病毒(AAV)是直径为22nm左右的DNA病毒， 对人不具有 致病性。 对野 生型AAV进行基因工程改造， 重组AAV已成为基因治疗中安全 有效的递送载体。 目前以已有 多款基于AAV载体的基因药物在国外上市。 AAV 载体广泛应用于疫苗、 肿瘤药物、 遗传病药 物的开发。 采用AAV载体来递送抗 原基因的优势在于其具有极低的自身免疫原性和遗传毒 性， 高效递送、 表达时 间长。 采用AAV载体疫苗可以实现内生抗原诱导抗体产生， 抗体的产 生具有持 续性、 稳定性。 发明内。

8、容 0006 本发明的首要目的在于提供新冠病毒(SARS-COV-2)抗原多肽。 0007 本发明的另一目的在于提供一种表达上述抗原多肽的重组腺相关病毒。 0008 本发明的再一目的在于提供上述重组腺相关病毒在制备新冠肺炎疫苗中的 应 用。 0009 本发明的目的由以下技术方案实现： 0010 新冠病毒(SARS-COV-2)抗原多肽， 为以下氨基酸序列中的一种： 0011 、 SEQ.ID.NO.1； 预测发现SARS-COV-2的基因序列(GenBank acces sion no.NC_ 045512.2)的第331-583的氨基酸序列为刺突蛋白受体结构域， 是 诱导产生抗体、 制备疫苗。

9、 的靶标； 0012 、 在SEQ .ID .NO .1的C段延长一段附加氨基酸， 所述附加氨基酸的序 列如 SEQ.ID.NO.3所示； 目的是让C端更富含有原序列自有的半胱氨酸， 有 利于抗原的聚体化； 0013 、 SEQ.ID.NO.2； 预测发现SARS-COV-2的基因序列(GenBank acces sion no.NC_ 045512.2)的第319-541的氨基酸序列为刺突蛋白受体结构域， 是 诱导产生抗体、 制备疫苗 的靶标； 说明书 1/6 页 3 CN 111518175 A 3 0014 、 与、 或具有至少90序列相似性的氨基酸序列， 进一步优选与 或 具有95、 。

10、98相似性的氨基酸序列。 0015 上述抗原多肽的表达载体， 含有腺相关病毒反向末端重复序列(ITR序列)、 编码 信号肽的核苷酸序列， 以及编码上述抗原多肽的核苷酸序列； 0016 所述的表达载体还含有必须的表达调控元件， 比如启动子序列、 上游调节 区域、 编码区、 转录调控元件、 终止子等； 0017 所述编码抗原多肽的核苷酸序列经过人源密码子优化； 0018 所述的ITR序列来自血清型AAV2。 0019 所述的信号肽优选IgE信号肽。 0020 一种表达上述抗原多肽的重组腺相关病毒(rAAV)， 其制备方法包括以下 步骤： 0021 将pHelper、 pRep2Cap5和抗原多肽的。

11、表达载体共孵育， 在转染试剂聚乙烯 亚胺存 在的条件下转染细胞， 培育细胞后， 离心收集细胞， 经过裂解和纯化， 得到含有重组腺相关 病毒的纯化液； 0022 所述的pRep2Cap5对应的是血清型AAV5。 0023 rAAV载体的生产有本领域专业人员通用认知的工艺方法。 本领域人员可以 使用 已知的技术基于HEK293的三质粒系统进行生产， 例如中国发明专利 ZL201710553164.0。 0024 本领域人员还可以基于SF9细胞系的昆虫系统构建表达质粒和血清型质粒生 产 rAAV， 例如中国专利申请CN108699567A。 此外还有基于疱疹病毒辅助或者 腺病毒辅助病毒 的包装系统等。

12、。 0025 rAAV病毒生产后可用多种常规的纯化方法如物理裂解、 化学裂解、 过滤澄 清、 切 向流超滤、 柱层析、 CsCl梯度离心、 碘克沙醇离心等从宿主细胞中纯化。 以上纯化方式的具 体描述可见Nass S,Mattingly M,Woodcock D,et al.Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing SerotypesJ. Molecular therapy.Methods&clinical development,2018:33-46. 0026 上述的重组腺相关病。

13、毒可用于制备预防新冠病毒肺炎的疫苗； 0027 所述的疫苗还包含药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂； 0028 所述的疫苗可制成注射剂， 用于鼻内、 肌肉注射。 0029 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 0030 1、 在蛋白大分子抗原携带的多种特异性的抗原决定簇中， 只有少量抗原部 位对 保护性免疫应答起作用。 免疫原性取决于该物质自身的性质， 如分子量、 化学数学、 分子结 构以及分子构象等。 本发明预测的SARS-COV-2的抗原多肽 序列， 经试验证实具有以下优 点： a、 相对于完整的S蛋白或者S1亚基作为抗 原， 截断的结构域序列由于序列更短、 分子量 更小、 结构更明确。

14、从而更具有特 异性； b、 血清抗体中和试验显示， 本发明的抗原多肽具有 很高的免疫原性， 可 产生强大的保护性中和抗体； c、 第一次报道了SARS-COV-2的抗原多肽 核酸序 列在AAV5型重组腺相关病毒上通过肌肉注射实现基因的递送， 并有效持续的 表达 抗原序列。 0031 2、 本发明的rAAV组合物在体内递送表达产生融合抗原多肽， 诱导产生血 清中和 抗体， 对SARS-COV-2新冠病毒具有中和效价， 并持续表达， 可用于对 人进行针对COVID-19 新冠肺炎的免疫接种。 说明书 2/6 页 4 CN 111518175 A 4 附图说明 0032 图1是pAAV-NS001构。

15、建完成的载体图谱示意图； 示意图中各关键元件描 述如下： ITR是指AAV2的反向末端重复序列； CAG promoter是指强组合人工 启动子， 包含巨细胞病 毒(CMV)的增强子， 鸡beta actin启动子和兔的beta-globin 剪接受体； NS001是指 SEQ.ID.NO.1序列； WPRE是指土拨鼠肝炎病毒转录后 调控元件； SV40polyA是指猴空泡病毒 40(SV40)多聚腺苷酸序列。 0033 图2是pAAV-NS002构建完成的载体图谱示意图； 示意图中NS002是指SEQ. ID.NO.2 序列； 其他关键元件同图1。 0034 图3是21011个基因组颗粒重组。

16、腺相关病毒制剂NS001免疫BaLb/c小鼠后， 采用 ELISA检测对体内抗体表达的影响； 其中， a是对IgM抗体表达的影响， b 是对IgG抗体表达的 影响。 0035 图4是21011个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS001免疫BaLb/c小鼠后 30天进 行血清病毒中和试验的结果。 0036 图5是21011个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS002免疫BaLb/c小鼠后， 采用 ELISA检测对体内抗体表达的影响； 其中， a是对IgM抗体表达的影响， b 是对IgG抗体表达的 影响。 0037 图6是21011个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS001免疫BaLb/c小鼠后 30天进。

17、 行血清病毒中和试验的结果。 具体实施方式 0038 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式 不 限于此。 0039 在本发明的描述中， 将使用以下术语， 简要说明定义如下： 0040 S蛋白， 也称为Spike蛋白或刺突蛋白， 是冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。 新 冠病毒 SARS-COV-2通过S蛋白与人ACE2受体结合并侵入细胞。 S蛋白截短体 为通过预测并截取S蛋 白的部分区域作为抗原。 0041 载体是指遗传物质的递送工具或元件， 例如质粒、 病毒、 病毒类似颗粒、 噬 菌体 等， 该术语还经常根据应用类型或场景称为克隆载体、 表达载体或骨架载体， 以及病毒。

18、载 体。 0042 “rAAV载体” 是指重组非复制型的腺相关病毒， rAAV载体包括血清型蛋白 衣壳， 并 封装着重组的基因组， 基因组包括功能性的5 和3 反向末端重复序列 (ITR序列)， 并侧接 外源核苷酸序列替代野生型AAV的rep或者cap基因。 ITR 序列提供对rAAV功能性拯救、 复 制、 包装。 在一些实施例中， ITR序列来自AAV2。 外源核苷酸序列通常由一系列表达调控元 件和编码区组成。 0043 AAV血清型质粒pREPCAP包括两个开放阅读框(ORF)， 编码Rep和Cap 表达产物。 Cap 是指本领域技术人员熟悉的AAV的衣壳蛋白， 编码衣壳蛋白VP1、 VP。

19、2和VP3及AAP等功能性 蛋白， 不同血清型的AAV有不同的衣壳蛋白序列。 0044 AAV辅助质粒pHelper通常包括腺病毒VA RNA、 E4 ORF6、 E2A、 E1B等 编码区域提供 AAV复制必须的功能。 说明书 3/6 页 5 CN 111518175 A 5 0045 表达调控元件通常为启动子序列、 上游调节区域、 编码区、 转录调控元件 等的集 合， 共同实现在受体细胞中编码区序列的复制、 转录和翻译。 启动子是 RNA聚合酶识别、 结 合和开始转录的一段DNA序列， 它含有RNA聚合酶特 异性结合和转录起始所需的保守序列， 多数位于结构基因转录起始点的上游,启 动子本身。

20、不被转录。 在一些案例里， 启动子序列 选用CAG启动子， 合适的启动 子还包括本领域技术人员已知的启动子， 例如人巨细胞病毒 (CMV)启动子， 泛素C启动子(UbC)、 EF1启动子等， 任选地， 可以选择作为表达调控序列 mRNA的转录。 在一些案例中选用SV40polyA作为转录终止子。 合适的polyA 序列包括不限于 本领域已知的SV40、 BGH、 合成polyA等。 一些案例里还包括 增强转录的调控元件土拨鼠肝 炎病毒转录后调控元件(WPRE)， 增强翻译效率 的序列(Kozak序列)。 0046 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambroo。

21、k等 人， 分子克隆： 实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所 述的条件， 或按照制造厂商提供说明书条件。 0047 实施例中用到的材料如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0048 实施例1、 AAV表达载体质粒pAAV-NS001的构建 0049 通过NCBI数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)获取SARS-COV -2的 基因序列(GenBank accession no.NC_045512.2)， 用NCBI Conserved D omain Search (ht。

22、tps:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测序列内 的保守结构 域。 0050 预测结果显示Spike receptor binding domain(即刺突蛋白受体结构域)为 第 331-583的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)。 基于自有技术认知， 将该结构域 C端序列延长10个 氨基酸(ILDITPCSFG， SEQ.ID.NO.3)， 目的是让C端更 富含有原序列自有的半胱氨酸以有利 于抗原的聚体化。 0051 将获取的序列拼接在IgE信号肽之后， 通过GenSmart Optimization(Version Beta 。

23、1 .0)进行人源密码子优化， 并使用DNAWorks(v3 .2 .4)(https:/hpcwebapp s .cit.nih.gov/dnaworks/)设计引物， 使用HS DNA Polymerase(T akarabio)扩增合成序列， 利用内切酶FastDigestTMEcoRI和FastDigestTMHindIII(T hermoFisher)酶切腺相关病毒骨架载体pAAV-CAG-MCS-WPRE-SV40polyA， 采 用的 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组试剂盒(南京诺唯赞)进行 同源重组连 接反应， 经转化大肠杆菌D。

24、H5， 涂于氨苄抗性的培养皿， 16小时 后挑取菌落检测， 将阳性克 隆送至测序公司(苏州金唯智)进行测序(SEQ.I D.NO.4)， 将测序结果正确的质粒命名为 pAAV-NS001载体， 其各元件组成见 图1。 0052 实施例2、 AAV表达载体质粒pAAV-NS002的构建 0053 通过NCBI数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)获取SARS-COV -2的 基因序列(GenBank accession no .NC_045512.2)， 用Uniprot blast(https: / www.uniprot.org/blast/)通过u。

25、niprotkb_refprotswissprot数据库预测序列内的保 守 结构域。 预测结果显示Spike receptor binding domain(即刺突蛋白受体结构 域)为第 319-541的氨基酸序列。 将获取的序列拼接在IgE信号肽之后， 通过G enSmart Optimization(Version Beta 1.0)进行人源密码子优化， 并使用DNAWor ks(v3.2.4) 说明书 4/6 页 6 CN 111518175 A 6 (https:/hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)设计引物使用HS DNA Polymerase(Taka。

26、rabio)扩增合成序列， 利用内切酶FastDigest T MEc oRI和 FastDigestTMHindIII(ThermoFisher)酶切腺相关病毒骨架载体pAAV-CAG-M CS-WPRE- SV40polyA， 采用的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组 试剂盒(南京诺唯 赞)进行同源重组连接反应， 经转化大肠杆菌DH5， 涂于氨 苄抗性的培养皿， 16小时后挑取 菌落检测， 将阳性克隆送至测序公司(苏州金 唯智)进行测序(SEQ.ID.NO.5)， 将测序结果 正确的质粒命名为pAAV-NS0 02载体， 其各元件组成见图2。。

27、 0054 实施例3、 重组腺相关病毒rAAV-NS001、 rAAV-NS002的制备 0055 293T细胞在转染前24小时以每培养皿1107个细胞的密度在150mm培养 皿中接 种， 并加入12 g pHelper、 8 g pRep2Cap5、 5 g pAAV-NS001(或者5 g pAAV-NS002)和10 g 转染试剂聚乙烯亚胺(25kD)孵育转染， 转染72小时后， 在4以500g离心收获细胞5min。 细胞重悬在含有50mM Tris-HCl(pH值 8.0)、 150mM NaCl的裂解缓冲液中。 收获裂解液在干 冰/乙醇和37水浴中进 行三次冻融循环。 然后加入1un。

28、it/mL核酸酶和0.5脱氧胆酸钠， 细胞悬液在37 下孵育1小时。 在5000g下离心20分钟， 在4收集rAAV上清粗裂解液。 粗裂解液用10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液稀释至10毫升的最终体积， 然后在39 毫升超速 离心管中加入按照15、 25、 40、 60质量体积比梯度加载碘克沙 醇。 在18下用350， 000g离心1小时， 收集3ml的40下层组分和0.5ml 的60上层组分即为纯化液， 用 100kDa截止超滤管(Millipore)进行超滤置换为 病毒保存液。 重组病毒保存液为PBS磷酸 缓冲液(pH值7 .4)， 0 .05普洛沙姆 188。 将纯化的rAA。

29、V标记为NS001、 NS002， 采用 SYBRGreenI qPCR测定病毒 滴度。 使用前在-80冰箱保存。 0056 实施例4、 NS001免疫BALB/c小鼠 0057 随机选取5只5-6周龄BALB/c小鼠进行肌肉注射NS001(滴度为 11012GC/mL， 注射 体积为200 L)。 取免疫前小鼠血清作为阴性对照， 随机选 取5只5-6周龄BALB/c小鼠以重组 绿色荧光蛋白腺相关载体免疫作为载体空白 对照。 0058 采用一次初始免疫和二次增强免疫方案， 分别在第0和30天进行注射； 第 30天和 第40天取血， 每只小鼠取血0.1mL-0.2mL， 在0放置60分钟， 40。

30、00 转/分钟离心15分钟， 取 上层血清用于ELISA检测分析和抗体中和实验。 0059 将第30天小鼠血清免疫效果ELISA检测： 0060 用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)溶解重组刺突蛋白RBD-His， 配制成1 g/mL 溶液， 以每孔100 L的量加入96孔板， 放入4孵育过夜； 第二天37培养箱孵 育一小时； 用PBST (PBS+0.1吐温-20)洗板3次(300 L/孔/次)。 洗板后， 加入2脱脂奶粉； 每孔加入250 L； 常温孵育一小时， 用PBST洗板3次。 同组 5只小鼠血清样品分别用PBS稀释300倍； 将稀释好 的血清以每孔100 L加入96 孔板， 每个。

31、稀释梯度平行做三个副孔； 放置在37培养箱孵育 两个小时， 洗板3 次。 分别将HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG二抗和IgM二抗稀释5000倍， 每 孔加入100 L， 室温孵育一小时； 洗板3次。 加入TMB溶液， 每孔加入100 L， 室温避光显色 20分钟。 加入0.5M H2SO4溶液， 每孔加100 L。 立即用酶标仪检 测吸光度， 检测波长为450nm， 570nm作为背景波长。 稀释300倍血清时IgG和 IgM表达结果以抗体吸光度(OD)值为纵坐标， 不同血清组别为横坐标作柱状 图， 如图3a和图3b所示。 0061 相对于AAV-GFP对照组(ODIgM平均值0.2110。

32、.020)， 本发明实施例 NS001疫苗， 说明书 5/6 页 7 CN 111518175 A 7 NS001组稀释300倍血清IgM抗体的ODIgM平均值为1.4940.024， 证明小鼠体内产生高滴度 的IgM抗体， 呈阳性， 通常在产生自适应性高亲和力 IgG反应之前， IgM抗体在病毒感染期间 提供了第一道防线， 在短期免疫中起到 重要的作用。 0062 相对于AAV-GFP对照组(ODIgG平均值0.2300.018)， 本发明实施例NS001 疫苗， NS001组稀释300倍血清IgG抗体的ODIgG平均值为2.9100.083， 呈阳 性， 证明小鼠体内产 生高滴度的IgG抗。

33、体， 说明疫苗在小鼠体内诱导了强大的 免疫应答， 在长期免疫和免疫记 忆中起着重要作用。 0063 实施例5、 NS001免疫BALB/c小鼠血清中和试验 0064 实验动物分组、 免疫方案及血清获取方法均同实施例4。 0065 以免疫前血清、 AAV-GFP感染后血清为对照， 以NS001血清组为测试组。 将 Vero E6 细胞以2104细胞/孔接种到96孔板中， 在37和5CO2下培养过夜。 第 二天将血清样品在 56加热30分钟灭活， 并用含2FBS的DMEM培养基进行4 倍梯度稀释， 形成一系列稀释梯 度的待测血清。 将100TCID50的SARS-CoV-2(毒 株编号： 2020。

34、XN4276， 广东省疾病预防控制 中心三级生物安全实验室提供并进 行实验)分别与一系列连续4倍梯度稀释的待测血清混 合， 在37孵育1小时， 随后加入培养中的Vero E6细胞。 在每种测定中， 感染了100TCID50 SARS-CoV-2 的细胞为阳性质控孔， 而0.1TCID50的病毒加入的细胞为阴性质控孔， 在感染 后 第3天记录CPE(细胞病变效应)。 第三天阳性质控孔出现病变， 阴性质控孔无 病变， 该实 验的适用性条件成立。 观察计算各实验组病变孔， 通过Reed-Muench 法计算了完全抑制孔 的50CPE的用各组血清的中和效价。 0066 如图4所示， 中和试验显示中和抗。

35、体效价ND50为1/128， 说明了NS001制 剂可产生 针对SARS-COV-2的中和抗体活性， 并保护细胞免受SARS-CoV-2感 染。 体液免疫应答， 具有 强大的中和活性， 并保护细胞免受SARS-CoV-2感染。 0067 实施例6、 NS002免疫BALB/c小鼠及免疫检测 0068 实验动物分组、 免疫方案、 血清获取方法及免疫效果检测方法均同实施例4。 0069 选取5只5-6周龄BALB/c小鼠进行免疫获取血清用于免疫效果的检测。 同 实施例4 检测方法， 将第30天小鼠血清免疫效果进行ELISA检测： 0070 IgG和IgM表达结果OD值柱状图， 如图5a和图5b所示。

36、。 相对于AAV-GFP 对照组(ODIgM 平均值0.2110.020； ODIgG平均值0.2300.018)， 本发明实 施例NS002疫苗， NS002组 稀释300倍血清IgG抗体的ODIgG平均值为2.340 0.205， IgM抗体的ODIgM平均值为1.794 0.045， IgG抗体和IgM抗体皆呈 阳性， 说明疫苗在小鼠体内诱导了强大的免疫应答。 0071 实施例7、 NS002免疫BALB/c小鼠血清中和试验 0072 实验动物分组、 免疫方案及血清获取方法均同实施例4。 0073 同实施例5方法进行血清中和试验， 结果如图6所示， 中和试验显示中和 抗体效价 ND50为。

37、1/64， 说明了NS002疫苗可产生体液免疫应答， 具有强大的 中和活性， 并保护细胞免 受SARS-CoV-2感染。 0074 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施 例 的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替 代、 组合、 简 化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 111518175 A 8 序列表 广州派真生物技术有限公司 广州中医药大学 SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用 5 SIPOSequenceListing 1.0 1 263。

38、 PRT 冠状病毒SARS-COV-2(Coronavirus) 1 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp L。

39、eu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg。

40、 Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu。

41、 Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys 195 200 205 Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu 序列表 1/7 页 9 CN 111518175 A 9 210 215 220 Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala 225 230 235 240 As。

42、p Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp 245 250 255 Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly 260 2 223 PRT 冠状病毒SARS-COV-2(Coronavirus) 2 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala。

43、 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys 。

44、Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro 。

45、Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 序列表 2/7 页 10 CN 。

46、111518175 A 10 210 215 220 3 10 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 3 Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly 1 5 10 4 5023 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 。

47、gcggccattc ggtacaattc acgcgtcgac attgattatt gactagctct 180 ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 240 attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 300 tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 360 gccaagtacg ccccctattg acgtcaatg。

48、a cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 420 gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc 480 ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 540 ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 600 ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcgg。

49、cag ccaatcagag 660 cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 720 gcgaagcgcg cggcgggcgg gagcgggatc agccaccgcg gtggcggccc tagagtcgat 780 cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca 840 ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta 900 c。

50、ttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccgcgg 960 ccgatccacc ggggtaccaa gcttgccacc atggactgga cctggatcct gttcctggtg 1020 gccgccgcta caagagtgca cagcaatatc accaacctgt gccccttcgg cgaagtgttc 1080 aacgccacaa gattcgcctc tgtgtacgcc tggaacagga agcggatctc taactgcgtc 1140 gccgactaca gcgtgct。