特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和重组载体构建及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010458555.6 (22)申请日 2020.05.27 (71)申请人 深圳市疾病预防控制中心 （深圳市 卫生检验中心、 深圳市预防医学研 究所） 地址 518051 广东省深圳市南山区龙苑路8 号 (72)发明人 徐新云郑凯毛吉炎蔡颖 秦逍云秦双建李柏茹 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 林青中 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 7/01(。

2、2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和重组载 体构建及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种特异抑制K-ras基因表达的 慢病毒和重组载体构建及其应用。 该特异抑制K- ras基因表达的慢病毒可表达特异抑制K-ras基 因表达的RNAi分子， 该特异抑制K-ras基因表达 的RNAi分子包含由反义链和与反义链杂交的由 SEQIDNO.1、 SEQIDNo.3或SEQIDNo.5所代 表的核苷酸序列组成的正义链构成的双链RNA结 构域， 反义链在严格杂交条件下与正义链杂交。 上述特异。

3、抑制K-ras基因表达的RNAi分子能够持 续、 稳定、 高效且特异性地抑制人源细胞中K-ras 基因的表达。 权利要求书2页 说明书11页 序列表5页 附图5页 CN 111534520 A 2020.08.14 CN 111534520 A 1.一种特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子， 其特征在于， 包含由反义链和与所述反义 链杂交的由SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所代表的核苷酸序列组成的正义链 构成的双链RNA结构域， 所述反义链在严格杂交条件下与所述正义链杂交。 2.根据权利要求1所述的特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子， 其特征在。

4、于， 所述RNAi 分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 所述RNAi分子的反义链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示； 或， 所述RNAi分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， 所述RNAi分子的反义链 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示； 或， 所述RNAi分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， 所述RNAi分子的反义链 的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。 3.根据权利要求1或2的特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子， 其特征在于， 所述RNAi分 子的正义链通过茎环结构与所述RNAi分子的反义链连接。 4.一种特异。

5、抑制K-ras基因表达的重组载体， 其特征在于， 包括载体及插入在所述载体 中的核心片段， 所述核心片段包括依次连接的靶序列、 茎环结构序列及所述靶序列的互补 序列及终止位点， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所 示。 5.根据权利要求4所述的特异抑制K-ras基因表达的重组载体， 其特征在于， 所述载体 为慢病毒载体； 所述核心片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示， 所述核心片段的 反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示； 或者， 所述核心片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示， 所述核心片。

6、段的反义 链的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示； 或者， 所述核心片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示， 所述核心片段的反 义链的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。 6.一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提供核心片段， 所述核心片段包括依次连接的靶序列、 茎环结构序列及所述靶序列的 互补序列及终止位点， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示； 及 将所述核心片段插入载体中， 制备所述特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 7.一种重组工程菌， 其特。

7、征在于， 所述重组工程菌内含有如权利要求13任一项所述 的特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子； 或者， 所述重组工程菌内含有如权利要求45任一项所述的特异抑制K-ras基因表达 的重组载体。 8.一种特异抑制K-ras基因表达的慢病毒， 其特征在于， 通过如下步骤制备得到： 将核心片段插入慢病毒后转染宿主细胞， 所述核心片段包括依次连接的靶序列、 茎环 结构序列及所述靶序列的互补序列及终止位点， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示； 及 对转染后的所述宿主细胞扩增， 获得所述特异抑制K-ras基因表达的慢病毒。 9.如权利。

8、要求13任一项所述的特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子、 如权利要求4 5任一项所述的特异抑制K-ras基因表达的重组载体、 如权利要求7所述的重组工程菌或如 权利要求书 1/2 页 2 CN 111534520 A 2 权利要求8所述的特异抑制K-ras基因表达的慢病毒在制备用于治疗K-ras基因异常表达相 关的疾病的药物中的应用。 10.一种药物组合物， 其特征在于， 包括如权利要求13任一项所述的特异抑制K-ras 基因表达的RNAi分子、 如权利要求45任一项所述的特异抑制K-ras基因表达的重组载体、 如权利要求7所述的重组工程菌或如权利要求8所述的特异抑制K-ras基因表达的。

9、慢病毒。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111534520 A 3 特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和重组载体构建及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和 重组载体构建及其应用。 背景技术 0002 K-ras基因是一种原癌基因， 长约35kb， 位于12号染色体， 是ras基因家族成员之 一， K-ras编码的K-ras蛋白具有GTPase活性， 结合GTP时为活化态， 结合GDP时为失活态。 K- ras蛋白主要定位于细胞膜上， 蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)能够使K-ras蛋白磷酸 化， 这。

10、种磷酸化过程导致K-ras蛋白与细胞膜的结合减弱而改变位置， 并移至内质网、 高尔 基体和粒线体等位置。 K-ras蛋白具有分子开关作用， 与肿瘤的生成、 增殖、 迁移、 扩散以及 血管生成均有关系。 0003 近些年， RNA干扰(RNAi)的出现使得可以在转录水平调控基因表达， 以特异抑制基 因的表达。 虽然RNA干扰在K-ras的调控中有应用， 但是存在干扰效果不够明显、 无法长效稳 定地干扰的问题。 发明内容 0004 基于此， 有必要提供一种特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子， 该RNAi分子能够持 续、 稳定、 高效且特异性地抑制K-ras基因表达。 0005 一种特异抑制K。

11、-ras基因表达的RNAi分子， 包含由反义链和与所述反义链杂交的 由SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所代表的核苷酸序列组成的正义链构成的双 链RNA结构域， 所述反义链在严格杂交条件下与所述正义链杂交。 0006 上述特异抑制K-ras基因表达的shRNA能够持续、 稳定、 高效且特异性地抑制K-ras 基因表达。 0007 在其中一个实施例中， 所述RNAi分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 所述RNAi分子的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 0008 或， 所述RNAi分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO。

12、.3所示， 所述RNAi分子的反 义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示； 0009 或， 所述RNAi分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， 所述RNAi分子的反 义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。 0010 在其中一个实施例中， 所述RNAi分子的正义链通过茎环结构与所述RNAi分子的反 义链连接。 0011 一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体， 包括载体及插入在所述载体中的核心 片段， 所述核心片段包括依次连接的靶序列、 茎环结构序列及所述靶序列的互补序列及终 止位点， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SE。

13、Q ID No.5所示。 0012 在其中一个实施例中， 所述载体为慢病毒载体； 及/或， 所述核心片段还包括酶切 位点， 所述酶切位点位于所述核心片段的两端。 说明书 1/11 页 4 CN 111534520 A 4 0013 在其中一个实施例中， 所述核心片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示， 所述核心片段的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示； 0014 或者， 所述核心片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示， 所述核心片段的 反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示； 0015 或者， 所述核心片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID N。

14、o.11所示， 所述核心片段 的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。 0016 一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体的构建方法， 包括以下步骤： 0017 提供核心片段， 所述核心片段包括依次连接的靶序列、 茎环结构序列及所述靶序 列的互补序列及终止位点， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示； 及 0018 将所述核心片段插入载体中， 制备所述特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 0019 一种重组工程菌， 所述重组工程菌内含有上述特异抑制K-ras基因表达的RNAi分 子； 0020 或者， 所述重组工程菌。

15、内含有上述特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 0021 一种特异抑制K-ras基因表达的慢病毒， 通过如下步骤制备得到： 0022 将核心片段插入慢病毒后转染宿主细胞， 所述核心片段包括依次连接的靶序列、 茎环结构序列及所述靶序列的互补序列及终止位点， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示； 及 0023 对转染后的所述宿主细胞扩增， 获得所述特异抑制K-ras基因表达的慢病毒。 0024 上述特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子、 上述特异抑制K-ras基因表达的重组载 体、 上述重组工程菌或上述特异抑制K-ras基因表。

16、达的慢病毒在制备用于治疗K-ras基因异 常表达相关的疾病的药物中的应用。 0025 一种药物组合物， 其特征在于， 包括上述特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子、 上 述特异抑制K-ras基因表达的重组载体、 上述重组工程菌或上述特异抑制K-ras基因表达的 慢病毒。 附图说明 0026 图1为实施例1中重组载体的双酶切电泳图； 0027 图2为实施例1中pLVX-K-ras-shRNA1重组载体的部分测序结果图； 0028 图3为实施例1中pLVX-K-ras-shRNA2重组载体的部分测序结果图； 0029 图4为实施例1中pLVX-K-ras-shRNA3重组载体的部分测序结果图；。

17、 0030 图5为实施例1中pLVX-shRNAC重组载体的部分测序结果图； 0031 图6为实施例2中HBE细胞分别转染四种病毒后所对应的K-ras的mRNA表达情况； 0032 图7为实施例3的qPCR结果； 0033 图8为实施例3中Western blot检测电泳结果图； 0034 图9为实施例3中Western blot检测的定量结果图； 0035 图10图15依次PM2.5对k-ras、 c-fos、 c-myc、 p53、 Caspase-3和Caspase-8表达影 响的结果图。 说明书 2/11 页 5 CN 111534520 A 5 具体实施方式 0036 为了便于理解本。

18、发明， 下面将对本发明进行更全面的描述， 本发明可以以许多不 同的形式来实现， 并不限于本文所描述的实施例。 相反地， 提供这些实施例的目的是使本发 明公开内容更加透彻全面。 0037 除非另有定义， 本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的 技术人员通常理解的含义相同。 本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的， 不是旨在于限制本发明。 0038 本发明一实施方式提供了一种特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子。 该特异抑制 K-ras基因表达的RNAi分子包含由反义链和与反义链杂交的由SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.3 或SEQ 。

19、ID NO.5所代表的核苷酸序列组成的正义链构成的双链RNA结构域， 反义链在严格杂 交条件下与正义链杂交。 该双链RNA结构域能够靶向K-ras基因的特定序列， 并使得K-ras基 因的表达受到抑制。 0039 具体地， 如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为： 5 -GGACGAATATGATCCAACA-3 。 对应 地， 在一个可选地具体示例中， 特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子的反义链的核苷酸如 SEQ ID NO.2所示。 如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为： 5 -TGTTGGATCATATTCGTCC-3 。 0040 具体地， 如SEQ ID NO.3所示。

20、的核苷酸序列为： 5 -GTGCAATGAGGGACCAGTA-3 。 对应 地， 在一个可选地具体示例中， 特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子的反义链的核苷酸如 SEQ ID NO.4所示。 如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为： 5 -TACTGGTCCCTCATTGCAC-3 。 0041 具体地， 如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为： 5 -GCTCTGAAGATGTACCTATG-3 。 对 应地， 在一个可选地具体示例中， 特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子的反义链的核苷酸如 SEQ ID NO.6所示。 如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为： 5 。

21、-CATAGGTACATCTTCAGAGC-3 。 0042 在其中一个实施例中， RNAi分子的正义链通过茎环结构与RNAi分子的反义链连 接。 在一个可选地具体示例中， 茎环结构的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示， 即： 5 - TTCAAGAGA-3 。 当然， 在其他实施方式中， 茎环结构的核苷酸序列不限于上述， 还可以是本 领域常用的其他序列。 当然， 在一些实施例中， 茎环结构也可以省略。 0043 需要说明的是， 本文中使用的 “严格条件” 是公知的， 包括诸如在含400mM NaCl、 40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60杂交1216小时。

22、， 然后在65下用含 0.1SDS、 和0.1SSC的洗涤液洗涤1560分钟。 0044 经验证， 上述特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子能够持续、 稳定、 高效且特异性 地抑制K-ras基因表达。 0045 本发明一实施方式还提供了一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体， 该特异抑 制K-ras基因表达的重组载体包括载体及插入在载体中的核心片段， 核心片段包括依次连 接的靶序列、 茎环结构序列及靶序列的互补序列及终止位点， 靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。 该特异抑制K-ras基因表达的重组载体中的靶 序列的互补序列能。

23、够靶向K-ras基因的特定序列， 从而使得K-ras基因的表达受到抑制。 0046 具体地， 终止位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示， 即为： 5 -TTTTTT-3 。 如SEQ ID NO.1、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的具体核苷酸序列如上文描述， 此处不再赘述。 茎环结构的核苷酸序列如上文描述， 此处不再赘述。 0047 在其中一个实施例中， 核心片段还包括酶切位点， 酶切位点位于核心片段的两端， 说明书 3/11 页 6 CN 111534520 A 6 以便于核心片段插入载体。 进一步地， 酶切位点为BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点。 。

24、当 然， 在其他实施方式中， 酶切位点不限于上述， 可以根据需要插入的载体具有的酶切位点设 计核心片段的酶切位点。 当然， 可以理解的是， 在其他实施方式中， 上述核心片段的酶切位 点也可以用酶切位点黏性末端替代。 此时， 在将核心片段插入载体时可以省略酶切特异抑 制K-ras基因表达的shRNA的步骤。 0048 在一个可选地具体示例中， 核心片段的正义链如SEQ ID No.7所示， 核心片段的反 义链如SEQ ID No.8所示。 如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列为： 5 -GATCCGGACGAATATGATC CAACATTCAAGAGATGTTGGATCATATTCGTCC。

25、TTTTTT-3 ； 如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列为： 5 -AATTAAAAAAGGACGAATATGATCCAACATCTCTTGAATGTTGGATCATATTCGTCCG-3 。 0049 在一个可选地具体示例中， 核心片段的正义链如SEQ ID No.9所示， 核心片段的反 义链如SEQ ID No.10所示。 如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列为： 5 -GATCCGTGCAATGAGGGA CCAGTATTCAAGAGATACTGGTCCCTCATTGCACTTTTTT-3 ； 如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为： 5 -AATTAAAAAAGTGCA。

26、ATGAGGGACCAGTATCTCTTGAATACTGGTCCCTCATTGCACG-3 。 0050 在一个可选地具体示例中， 核心片段的正义链如SEQ ID No.11所示， 核心片段的 反义链如SEQ ID No.12所示。 如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列为： 5 -GATCCGCTCTGAAGA TGTACCTATGTTCAAGAGACATAGGTACATCTTCAGAGTTTTTT-3 ； 如SEQ ID No.12所示的核苷酸序 列为： 5 -AATTAAAAAACTCTGAAGATGTACCTATGTCTCTTGAACATAGGTACATCTTCAGAGCG-3 。。

27、 0051 在本实施方式中， 载体为慢病毒载体。 具体地， 慢病毒载体包括基本序列、 抗性基 因序列、 多克隆位点序列以及启动子序列。 在一个可选地具体示例中， 慢病毒载体选自 pLVX-shRNA1、 plvx-shrna2和PLKO.1-PURO中的一种。 当然， 在其他实施方式中， 载体不限于 慢病毒， 也可以是本领域常用的其他载体。 0052 本发明一实施方式还提供了一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体的构建方 法， 该方法包括步骤S110步骤S120： 0053 步骤S110、 提供上述任意一种核心片段。 0054 具体地， 先合成核心片段的正义链和反义链， 然后将正义链和反义链。

28、混合， 退火形 成核心片段。 当然， 核心片段的正义链和反义链也可以直接通过基因合成的方式获得。 0055 步骤S120、 将核心片段插入载体中， 制备特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 0056 具体地， 载体的选择如上文描述， 此处不再赘述。 0057 具体地， 用限制性内切酶对核心片段和载体分别进行双酶切处理， 然后将酶切处 理后的核心片段插入到酶切处理后的载体中， 得到特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 0058 在一个可选地具体示例中， 载体为慢病毒载体。 进一步地， 慢病毒载体具有BamHI 酶切位点和EcoRI酶切位点， 核心片段上也具有BamHI酶切位点和EcoRI酶切。

29、位点。 此时， 先 分别对慢病毒载体和核心片段进行限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切处理， 打开缺口， 形成慢病毒载体的酶切位点粘性末端和核心片段的粘性末端； 然后使得核心片 段与慢病毒载体的酶切位点粘性末端连接， 从而获得特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 0059 具体地， 用限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切慢病毒载体和核心片 段后， 再用DNA连接酶将双酶切后的核心片段连接到双酶切处理后的慢病毒载体上， 然后扩 增和鉴定， 获得特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 进一步地， DNA连接酶为T4 DNA连接 酶。 具体扩增和鉴定的方式采用本领域。

30、常用的方法即可。 说明书 4/11 页 7 CN 111534520 A 7 0060 上述特异抑制K-ras基因表达的重组载体的构建方法操作简单， 通过将含有靶序 列的核心片段插入载体中， 成功地构建能够特异性抑制K-ras基因的重组载体。 实验结果表 明， 上述特异抑制K-ras基因表达的重组载体能够转染到人源细胞中， 转染效率高， 表达载 体的用量少， 且能够持续、 稳定、 高效且特异性地抑制人源细胞中K-ras基因的表达。 0061 本发明一实施方式还提供了一种特异抑制K-ras基因表达的慢病毒， 通过如下步 骤制备得到： 将上述任意一种核心片段插入慢病毒后转染到宿主细胞后， 对转染后。

31、的宿主 细胞扩增， 获得特异抑制K-ras基因表达的慢病毒。 0062 在一个可选地具体示例中， 宿主细胞为293T细胞。 进一步地， 转染后的293FT细胞 的培养时间为24h48h。 当然， 在其他实施例中， 宿主细胞不限于293T细胞， 还可以是其他 本领域常用的宿主细胞。 0063 上述特异抑制K-ras基因表达的慢病毒能够转染到人源细胞中， 且该慢病毒能够 持续、 稳定、 高效地抑制该人源细胞中K-ras基因表达。 0064 本发明一实施方式还提供了一种K-ras基因表达受抑制的细胞， 通过如下步骤制 备得到： 用上述特异抑制K-ras基因表达的慢病毒感染的HBE细胞(人支气管上皮样。

32、细胞)， 并培养感染后的HBE细胞， 得到K-ras基因表达受抑制的细胞。 0065 具体地， HBE细胞至细胞汇合度至6090， 用上述特异抑制K-ras基因表达的 慢病毒感染HBE细胞， 并于36.538下培养24小时48小时， 得到K-ras基因表达受抑 制的细胞。 0066 上述K-ras基因表达受抑制的细胞中K-ras基因表达被持续、 稳定、 高效地抑制， 可 以作为细胞模型应用于K-ras基因相关的研究。 0067 本发明一实施方式还提供了一种重组工程菌， 该重组工程菌内含有上述任意一种 特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子或上述任意一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体。 。

33、0068 上述重组工程菌内含有上述任意一种特异抑制K-ras基因表达的shRNA或上述任 意一种特异抑制K-ras基因表达的重组载体， K-ras基因的表达被持续、 稳定、 高效地抑制。 0069 本发明一实施方式还提供了一种上述特异抑制K-ras基因表达的RNAi分子、 上述 特异抑制K-ras基因表达的重组载体、 上述重组工程菌、 上述K-ras基因表达受抑制的细胞 或上述特异抑制K-ras基因表达的慢病毒在制备用于治疗K-ras基因异常表达相关的疾病 的药物中的应用。 0070 本发明一实施方式还提供了一种药物组合物， 该药物组合物包括上述特异抑制K- ras基因表达的RNAi分子、 上。

34、述特异抑制K-ras基因表达的重组载体、 上述重组工程菌、 上述 K-ras基因表达受抑制的细胞或上述制K-ras基因表达的慢病毒。 0071 在一个可选地具体示例中， 该药物组合物中还包括药学上可接受的辅助剂。 0072 具体实施例 0073 以下结合具体实施例进行详细说明。 以下实施例如未特殊说明， 则不包括除不可 避免的杂质外的其他组分。 实施例中采用药物和仪器如非特别说明， 均为本领域常规选择。 实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规条件， 例如文献、 书本中所述的条件或者生 产厂家推荐的方法实现。 0074 实施例1 0075 构建用于沉默K-ras基因的载体 说明书 5/11。

35、 页 8 CN 111534520 A 8 0076 (1)获取含有特异抑制K-ras基因表达的shRNA的核心片段 0077 委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备四种核心片段的正义链和反义 链。 四种核心片段为： K-ras-shRNA1、 K-ras-shRNA2、 K-ras-shRNA3及shRNAC， 其中， shRNAC 为对照组， K-ras-shRNA1含有如SEQ ID No.1所示的靶序列； K-ras-shRNA2含有如SEQ ID No.3所示的靶序列； K-ras-shRNA3含有如SEQ ID No.5所示的靶序列。 其中， K-ras-shRNA1 的正义。

36、链(K-ras-shRNA-T1)如SEQ ID No.7所示， K-ras-shRNA1的反义链(K-ras-shRNA- D1)如SEQ ID No.8所示， K-ras-shRNA2的正义链(K-ras-shRNA-T2)如SEQ ID No.9所示， K- ras-shRNA2的反义链(K-ras-shRNA-D2)如SEQ ID No.10所示， K-ras-shRNA3的正义链(K- ras-shRNA-T3)如SEQ ID No.11所示， K-ras-shRNA3的反义链(K-ras-shRNA-D3)如SEQ ID No.12所示， shRNAC的正义链(shRNAC-TC)。

37、如SEQ ID No.15所示， shRNAC的反义链(shRNAC- DC)如SEQ ID No.16所示。 具体序列如表1所示。 0078 表1 0079 0080 (2)双酶切pLVX-shRNA1载体： pLVX-shRNA1用EcoR1和BamH1双酶切， 37酶切 30min后， 再次添加限制性内切酶37酶切30min。 酶切反应体系如下表2： 0081 表2 0082 0083 将酶切后的载体进行琼脂糖凝胶电泳回收， 详细操作见OMEGA的Gel Extration Kit(D2500-01)说明书。 0084 (3)按表3将(1)中的核心片段的双链混合均匀， 然后放置于沸水中，。

38、 让其自然冷却 说明书 6/11 页 9 CN 111534520 A 9 至室温(26)， 退火完成。 接着在退火完成后的核心片段中再加入1mLddH2O。 0085 表3 0086 0087 (4)重组表达载体的构建： 将步骤(3)退火形成的具有粘性末端各核心片段分别与 酶切后pLVX-shRNA1在16连接过夜， 连接的反应体系如表4所示。 0088 表4 0089 0090 0091 (5)转化： 各取6 L连接产物转化100 L JM107感受态细胞： 将连接产物与感受态细 胞混匀后冰浴30min， 42热激70s， 立即置冰上放置2min， 加入预热至室温的150 L TB培养 基。

39、， 250rpm， 37恒温摇床培养1h， 用移液器取100 L均匀的涂在含100 g/mL Ampicillin抗 性的TB平板上， 倒置， 37恒温培养箱培养过夜。 0092 (6)阳性克隆子质粒抽提与酶切鉴定 0093 挑取TB平板上的单克隆， 加入TB培养基培养利用质粒小提试剂盒提取重组质粒， 然后将质粒KpnI+BamHI、 KpnI+EcoRI酶切鉴定， 结果如图1所示。 0094 在图1中， maker泳道对应于DNA Maker； k-ras-1(K+E)泳道对应于pLVX-shRNA1与 K-ras-shRNA1的连接产物经转化， 然后EcoRI、 KpnI双酶切的产物； k。

40、-ras-1(K+B)泳道对应 说明书 7/11 页 10 CN 111534520 A 10 于pLVX-shRNA1与K-ras-shRNA1的连接产物经转化， 然后BamH1、 KpnI双酶切的产物。 k-ras- 2(K+B)泳道对应于pLVX-shRNA1与K-ras-shRNA2的连接产物经转化， 然后BamH1、 KpnI双酶 切的产物； k-ras-2(K+E)泳道对应于pLVX-shRNA1与K-ras-shRNA2的连接产物经转化， 然后 EcoRI、 KpnI双酶切的产物。 k-ras-3(K+B)泳道对应于pLVX-shRNA1与K-ras-shRNA3的连接 产物经转。

41、化， 然后BamH1、 KpnI双酶切的产物； k-ras-3(K+E)泳道对应于pLVX-shRNA1与K- ras-shRNA3的连接产物经转化， 然后EcoRI、 KpnI双酶切的产物； shRNAC(K+B)泳道对应于 pLVX-shRNA1与shRNAC的连接产物经转化， 然后BamH1、 KpnI双酶切的产物； shRNAC(K+E)泳 道对应于pLVX-shRNA1与shRNAC的连接产物经转化， 然后EcoRI、 KpnI双酶切的产物。 0095 pLVX-shRNA1具有BamH1酶切位点、 KpnI酶切位点及EcoRI酶切位点， 但EcoRI酶切 位点与shRNA的EcoR。

42、I的粘性末端结合形成shRNA重组载体后， 该EcoRI酶切位点不能再次被 EcoRI酶切开。 因此， shRNA重组载体在被EcoRI、 KpnI双酶切时， 只有KpnI一个酶切位点被切 开， 电泳时只出现一条条带。 所以， 由图1初步判定K-ras-shRNA1、 K-ras-shRNA2、 K-ras- shRNA3及shRNAC均成功插入pLVX-shRNA1。 0096 (7)测序： 挑取酶切鉴定后的阳性克隆的细菌进行培养， 并将培养后的细菌菌液进 行测序鉴定， 测序由金维智公司进行， 测序鉴定结果如图25所示。 图2为K-ras-shRNA1与 pLVX-shRNA1构成的重组载体。

43、(即pLVX-K-ras-shRNA1)的部分测序图； 图3为K-ras-shRNA2 与pLVX-shRNA1构成的重组载体(即pLVX-K-ras-shRNA2)的部分测序图； 图4为K-ras- shRNA3与pLVX-shRNA1构成的重组载体(即pLVX-K-ras-shRNA3)的部分测序图； 图5为 shRNAC与pLVX-shRNA1构成的重组载体(即pLVX-shRNAC)的部分测序图。 0097 由图2图5可知， K-ras-shRNA1、 K-ras-shRNA2、 K-ras-shRNA3及shRNAC均成功插 入pLVX-shRNA1。 0098 实施例2 0099 。

44、特异抑制K-ras基因表达的慢病毒的制备 0100 (1)慢病毒的包装： 按照Lenti-XTM Lentiviral Expression Systems试剂盒说明 书步骤将pLVX-K-ras-shRNA1、 pLVX-K-ras-shRNA2、 pLVX-K-ras-shRNA3及pLVX-shRNAC分 别包装慢病毒， 得到对应的K-ras-shRNA1病毒、 K-ras-shRNA2病毒、 K-ras-shRNA3病毒及K- ras-C病毒。 具体操作为： 0101 a.在37、 5CO2条件下大量培养293T细胞， 消化下来的细胞均匀铺板。 0102 b.待细胞的融合率在90时， 。

45、准备转染。 充分混匀转染试剂、 包装质粒、 0103 目的质粒后， 滴入培养皿中进行转染。 0104 c.转染48h后取出293T细胞， 收集病毒上清。 0105 (2)将步骤(1)得到的慢病毒浓缩纯化， 每种慢病毒的浓缩纯化均为： 10000RPM、 4 离心病毒10min， 收集病毒上清。 将病毒上清置于超速离心机离心管中， 配平离心管， 50000RPM， 4离心病毒2h， 去掉上清， 保留沉淀的病毒， 加入1mL的PBS溶解病毒， 利用0.22 m的过滤器过滤溶解的病毒。 最后将过滤好的病毒检测滴度， 并分装。 0106 (3)计算步骤(2)得到的每种慢病毒的滴度， 具体为： 0107。

46、 a.细胞准备： 培养293细胞， 将细胞接种到48孔板， 每孔105个细胞， 37， 5CO2继 续培养18h。 0108 b.病毒稀释液的配置： 取20 L的病毒稀释到200 L的DMEM培养基， 依次10稀释病 说明书 8/11 页 11 CN 111534520 A 11 毒即(10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7)， 混匀稀释的病毒， 分别加到48孔中， 每孔100 L， 37， 5 CO2继续培养48h。 0109 c.观察结果并计算滴度： 利用荧光倒置显微镜检测统计各个孔带荧光细胞的数 量， 找出含有荧光细胞数最少的两个稀释浓度的孔计数， 计算出病毒的滴度。 。

47、0110 (4)慢病毒干扰效果检测： 0111 a.接种HBE细胞到六孔板中， 3105个细胞每孔， 培养18h后细胞融合度达到50 左右， 加入10 L滴度为108TU/mL的病毒上清。 0112 b.继续培养细胞24h， 然后去除含慢病毒的培养基， 加入新鲜的RPIM1640完全培养 基再培养24h。 0113 c.提取各组细胞的RNA， 将RNA反转录为cDNA。 0114 d.利用cDNA为模板， 荧光定量检测K-ras基因的相对表达量， 荧光PCR体系见表5。 表5中的PCR Forward primer的核苷酸序列为5 -GCGTAGGCAAGAGTGCCTTGA-3 (SEQ I。

48、D No.17)， PCR Reverse primer的核苷酸序列为5 -GACCTGCTGTGTCGAGAATATCCA-3 (SEQ ID No.18)。 荧光PCR的反应条件： 在5595的区间内进行熔解实验。 9530s， 1循环， 55 30s， 40循环， 955s， 601min， 9515s。 0115 表5 0116 0117 e.反应结束后， 得出标准曲线、 熔解曲线和相对定量值。 根据检测的数据对各组细 胞K-ras基因相对表达量进行分析。 结果如表6及图6所示。 图6中 “c” 组对应于K-ras-C病毒； “r1” 组对应于K-ras-shRNA1病毒；“r2” 组。

49、对应于K-ras-shRNA2病毒；“r3” 组对应于K-ras- shRNA3病毒。 图6的纵坐标为K-ras基因相对表达量。 0118 表6 0119 说明书 9/11 页 12 CN 111534520 A 12 0120 由表6和图6可知， K-ras-shRNA1病毒、 K-ras-shRNA2病毒和K-ras-shRNA3病毒可 以有效的特异抑制K-ras基因表达， 其中K-ras-shRNA3病毒干扰效果最佳。 0121 实施例3 0122 (1)利用K-ras-shRNA3病毒和K-ras-C病毒分别构建对应的K-ras基因沉默细胞 株； 各个K-ras基因沉默细胞株的具体操作。

50、如下： 0123 a.接种HBE细胞六孔板中， 3105个细胞每孔， 培养18h后细胞融合度达到50左 右， 加入10 L(1108TU/mL)的对应病毒上清。 0124 b.继续培养细胞24h， 然后去除含慢病毒的培养基， 加入新鲜的RPIM1640完全培养 基再培养24h。 0125 c.48h后， HBE细胞感染带有绿色荧光蛋白标签的病毒在荧光倒置显微镜下观察病 毒感染效果。 然后向感染病毒的细胞加入1 g/mL嘌呤霉素(Puromycin)。 每隔2d换液一次， 筛选时间为7d。 0126 d.筛选完成后， 去除培养瓶中含嘌呤霉素(Puromycin)的完全培养基， 加入正常的 完全培。