基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010554846.5 (22)申请日 2020.06.17 (71)申请人 台州市中心医院 （台州学院附属医 院） 地址 318000 浙江省台州市椒江区经济开 发区东海大道999号 (72)发明人 王毅超谢姣贵杨合慧陈晓英 吴波 (74)专利代理机构 北京盛凡智荣知识产权代理 有限公司 11616 代理人 任娜娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名。

2、称 一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法 (57)摘要 本发明公开的属于解脲脲原体检测技术领 域， 具体为一种基于RPA对解脲脲原体的快速检 测方法， 包括以下步骤： 材料准备： S1： 菌株， S2： 试剂； 该种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方 法， 将RPA技术利用于解脲脲原体的快速检测， 同 时具有较高的灵敏度和良好的特异性， 建立的 RPA扩增方法完成对解脲脲原体的快速检测， 与 对照病原体相比， 仅解脲脲原体呈现经典的扩增 曲线； RPA检测解脲脲原体最低检出限为3pg； 用 临床病例样本评估检测效果证明RPA方法具有可 行性， 能满足临床检测的需要， 建立的解脲脲原 体实时。

3、荧光RPA方法具有高特异度、 高灵敏性、 简 便快捷等优点， 可用于解脲脲原体快速检测， 为 进一步的研究提供了可行性以及良好的研究基 础。 权利要求书2页 说明书12页 附图4页 CN 111534624 A 2020.08.14 CN 111534624 A 1.一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 材料准备： S1： 菌株， 临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液； 临床确认且经培养得到的病原 体培养液； 30列临床女性阴道拭子； S2： 试剂； S3： 仪器； 引物、 探针的设计与合成： S1： NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗。

4、原基因特异序列， 应用Oligo7设 计特异性引物和探针， 同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选， 引物交由生 物工程公司合成， 其中， 引物长度： RPA引物比典型的PCR引物更长， 为3035个核苷酸； 引物 序列： 避免引物中存在不寻常的序列， 如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成， 或存在许 多重复的短序列； 扩增产物长度： 对于超快速的RPA分析， 扩增子长度不超过500bp， 理想长 度为100200bp： S2： 引物选择： 选择靶区： GC含量在4060之间； 重复序列； 很少正向/反向重复、 回 文等； 候选引物： 利用PCR软件如Primer 3、 Prime。

5、r-BLAST进行设计： 引物大小最小30， 最大 36； 引物GC最小20， 最大70； 引物Tm最小50， 最大100； 最大允许的单核苷酸重复长度 设定为5； BLAST验证； S3： 探针设计： 探针由寡核苷酸骨架组成， 骨架中包含： 一个脱碱基核苷酸类似物； 一个 侧翼dT-荧光团， 为荧光素， 可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团； 在THF 基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团， 通常是合适的淬灭团BHQ； 一个合适的3 -修饰基团 以阻断探针的聚合酶延伸； 骨架组合物的选择： 根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团， BHQ1作为猝灭团， C3- 间臂作为3 端修。

6、饰基团； S4： 探针长度： 应为4652个核苷酸， 其中30个位于THF位点的5 端， 另外15个位于其的 3 端； S5： 条件优化： 温度： 根据酶的最适温度， 分别设置37、 38、 39、 40、 41的5个温 度梯度下扩增20min， 扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行， 通过凝胶电泳法分析 产物， 39下条带最亮与试剂说明书一致； S6： 探针选择： 将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测， 通过实时荧光 PCR在39下进行检测荧光信号； 模板制备： S1： 将收集到的标本10000转离心1min， 吸净上清， 保留菌体沉淀， 向菌体沉淀中加入 200 l缓冲液G。

7、A， 振荡至沉淀彻底悬浮， 向各管加入20 lProteinase K溶液， 混匀， 各管加入 220 l的GB液， 振荡15sec出现絮状沉淀， 全部EP管在70金属浴放置10min， 溶液变清亮， 瞬 离， 各管加入220 l无水乙醇， 充分振荡15sec需要无沉淀， 瞬离， 将上述所得溶液加入吸附 柱CB3， 吸附柱放入洁净收集管中， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集管 中， 向CB3中加入500 l缓冲液GD， GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇， 12000转离 心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 向CB3中加入600 l漂洗液PW。

8、， PW使用前应先按要求 加入规定量的无水乙醇， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 重复上一步， 将 权利要求书 1/2 页 2 CN 111534624 A 2 装有CB3的收集管放入离心机， 12000转离心2min， 倒掉废液， 将CB3置室温数分钟， 以彻底晾 干吸附材料中残余的漂洗液， CB3放入干净的EP管中， 向吸附膜的中间部分悬空加入60 l洗 脱液TE， 室温放置25分钟， 12000转离心2min， 将核酸溶液收集到EP管中， -20冰冻保存 备用； S2： 筛选RPA最优引物， 按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液： 正向引物(10 M。

9、)2.4 l、 反向引物(10 M)2.4 l、 无引物再水合缓冲液29.5 l、 模板和水13.2 l(总体积 47.5 l)， 振荡并短暂离心， 对于每份样本， 将47.5 l再水合溶液转移至反应微球中， 吹打混 匀直到整个微球重悬， 对于每份样本， 加入2.5 l的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀， 如需 同时如此处理多个样本， 可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中， 小心盖紧管盖， 并通过 离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应， 短暂振荡并再次快速离心， 其中， TwistAmp反 应是靠MgOAc来激活， 在加入MgOAc后， 迅速将样本置于选择的孵育温度下进行。

10、孵育， 将试管 放入合适的恒温仪中孵育20min， 温度为39； S3： 纯化产物。 2.根据权利要求1所述的一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 其特征在于： 所 述病原体培养液为： 沙眼衣原体、 淋球菌、 大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌。 3.根据权利要求1所述的一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 其特征在于： 所 述试剂为： TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒；exo试剂 盒；Basic试剂盒； TIAN GEN 50TAE Buffer； TIAN GEN Agarose LE； BIOTIUM GelRedTM 100。

11、00in water； MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit。 4.根据权利要求1所述的一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 其特征在于： 所 述仪器为： JJ523BC电子天平； Synergy UV系统超纯水仪； DRY BATH金属浴； HFsafe1500TE 生物安全柜； XW80A Vortex振荡器； D1008E离心机； eppendorf 5424R低温离心机； Biospectrum510凝胶成像仪； StepOne Plus实时荧光PCR仪。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111534624 A 3 一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法 。

12、技术领域 0001 本发明涉及解脲脲原体检测技术领域， 具体为一种基于RPA对解脲脲原体的快速 检测方法。 背景技术 0002 解脲支原体是一类主要寄居于人体的泌尿生殖道的病原微生物， 当机体免疫力下 降时， 常引起非淋菌性尿道炎(NUG)、 宫颈炎、 盆腔炎、 睾丸炎、 附睾炎等疾患， 并可引起男女 不孕不育， 孕期感染可导致流产、 早产、 胎膜早破等不良妊娠结局， 加之此类病原体侵袭破 坏泌尿生殖道粘膜上皮细胞， 因此更易引起其它性病的继发感染， 是性传播疾病的重要病 原体之一。 解脲脲原体属于条件致病病原体， 正常人群中的携带者往往不一定出现临床表 征， 这很大程度上掩盖了患者的病情， 。

13、极易造成漏检， 导致患者错过最佳治疗时间。 0003 目前， 临床检测解脲脲原体感染的主要方法有培养法和基于聚合酶链式反应的检 测方法(PCR)， 培养法培养周期较长且容易因为污染造成假阳性结果； PCR需要经历高温变 性、 低温退火、 中温延伸等热循环过程， 需要有专门温控设备， 而且对实验条件以及操作人 员的要求都较高， 比较难以在基层及偏远地区广泛应用。 0004 近年来， 恒温扩增技术由于在某一特定的温度条件就可以进行扩增， 因此备受青 睐， 现在常见的恒温扩增技术主要包括主要包括环介导恒温扩增、 链置换恒温扩增、 滚环恒 温扩增、 依赖解旋酶恒温扩增和重组酶聚合酶恒温扩增等， 恒温扩。

14、增技术相对于传统方法 和PCR而言能够摆脱精密的温度循环系统， 实现了在缺乏完善的高精密设备的情况下也能 进行快速和准确检测， RPA是一项基于PCR技术发展而来的等温核酸扩增技术， 具有较高灵 敏性和特异性； 操作便捷； 检测耗时短； 结果读取多样化以及能够在等温条件下对靶DNA进 行扩增的优点。 0005 RPA技术以T4噬菌体核酸复制机制为原理,利用重组酶uvsX以及辅助蛋白uvsY和 单链结合蛋白在常温下实现引物和模板的特异结合,从而实现目标序列的扩增， 在RPA反应 中， 重组酶uvsX以及辅助蛋白uvsY(uvsY可以提高与ssDNA的亲和力， 提高uvsX-ssDNA相互 作用的。

15、稳定性)与上下游引物结合形成核酸蛋白复合体， 该复合体会寻找同源的双链DNA， 接着， 复合体侵入5 端位点形成D环状， 单链绑定蛋白(SSB)和亲本链结合， 阻止其与脱离的 另一条模板链发生相互作用， 同时， 重组酶uvsX离开引物， 降解后被DNA聚合酶利用， 之后 DNA聚合酶结合在上下游引物的3 端启动模板合成， 进行链的延伸， 形成新的互补链， 新合 成的互补链和原始模板链形成双链DNA， 以上步骤循环进行， 即可实现DNA的指数增长， 若引 入逆转录酶， 即可建立RT-RPA。 0006 现有的解脲脲原体检测RPA方法还存在一些缺点， 如低特异度、 低灵敏性、 繁琐复 杂等缺点， 。

16、难以快速检测解脲脲原体， 在用于解脲脲原体快速检测的过程中存在提升空间。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 以解决上述 说明书 1/12 页 4 CN 111534624 A 4 背景技术中提出的现有的解脲脲原体检测RPA方法还存在一些缺点， 如低特异度、 低灵敏 性、 繁琐复杂等缺点， 难以快速检测解脲脲原体， 在用于解脲脲原体快速检测的过程中存在 提升空间的问题。 0008 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种基于RPA对解脲脲原体的快速检 测方法， 包括以下步骤： 0009 材料准备： 0010 S1： 菌株， 临床经培养方法。

17、确认UU阳性的病原体培养液； 临床确认且经培养得到的 病原体培养液； 30列临床女性阴道拭子； 0011 S2： 试剂； 0012 S3： 仪器； 0013 引物、 探针的设计与合成： 0014 S1： NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列， 应用 Oligo7设计特异性引物和探针， 同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选， 引 物交由生物工程公司合成， 其中， 引物长度： RPA引物比典型的PCR引物更长， 为3035个核 苷酸； 引物序列： 避免引物中存在不寻常的序列， 如一段长序列全由一种特定的核苷酸组 成， 或存在许多重复的短序列； 扩增产物长。

18、度： 对于超快速的RPA分析， 扩增子长度不超过 500bp， 理想长度为100200bp： 0015 S2： 引物选择： 选择靶区： GC含量在4060之间； 重复序列； 很少正向/反向重 复、 回文等； 候选引物： 利用PCR软件如Primer 3、 Primer-BLAST进行设计： 引物大小最小30， 最大36； 引物GC最小20， 最大70； 引物Tm最小50， 最大100； 最大允许的单核苷酸重复 长度设定为5； BLAST验证； 0016 S3： 探针设计： 探针由寡核苷酸骨架组成， 骨架中包含： 一个脱碱基核苷酸类似物； 一个侧翼dT-荧光团， 为荧光素， 可使用任何作为dT偶。

19、联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团； 在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团， 通常是合适的淬灭团BHQ； 一个合适的3 -修 饰基团以阻断探针的聚合酶延伸； 0017 骨架组合物的选择： 根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团， BHQ1作为猝灭 团， C3-间臂作为3 端修饰基团； 0018 S4： 探针长度： 应为4652个核苷酸， 其中30个位于THF位点的5 端， 另外15个位于 其的3 端； 0019 S5： 条件优化： 温度： 根据酶的最适温度， 分别设置37、 38、 39、 40、 41的5 个温度梯度下扩增20min， 扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行， 通过凝胶。

20、电泳法 分析产物， 39下条带最亮与试剂说明书一致； 0020 S6： 探针选择： 将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测， 通过实时 荧光PCR在39下进行检测荧光信号； 0021 模板制备： 0022 S1： 将收集到的标本10000转离心1min， 吸净上清， 保留菌体沉淀， 向菌体沉淀中加 入200 l缓冲液GA， 振荡至沉淀彻底悬浮， 向各管加入20 lProteinase K溶液， 混匀， 各管加 入220 l的GB液， 振荡15sec出现絮状沉淀， 全部EP管在70金属浴放置10min， 溶液变清亮， 瞬离， 各管加入220 l无水乙醇， 充分振荡15sec需要无沉淀，。

21、 瞬离， 将上述所得溶液加入吸 说明书 2/12 页 5 CN 111534624 A 5 附柱CB3， 吸附柱放入洁净收集管中， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集 管中， 向CB3中加入500 l缓冲液GD， GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇， 12000转 离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 向CB3中加入600 l漂洗液PW， PW使用前应先按要 求加入规定量的无水乙醇， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 重复上一步， 将装有CB3的收集管放入离心机， 12000转离心2min， 倒掉废液， 将CB3置。

22、室温数分钟， 以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液， CB3放入干净的EP管中， 向吸附膜的中间部分悬空加入60 l 洗脱液TE， 室温放置25分钟， 12000转离心2min， 将核酸溶液收集到EP管中， -20冰冻保 存备用； 0023 S2： 筛选RPA最优引物， 按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液： 正向引 物(10 M)2.4 l、 反向引物(10 M)2.4 l、 无引物再水合缓冲液29.5 l、 模板和水13.2 l(总 体积47.5 l)， 振荡并短暂离心， 对于每份样本， 将47.5 l再水合溶液转移至反应微球中， 吹 打混匀直到整个微球重悬， 对于每份样本， 加入2.。

23、5 l的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀， 如需同时如此处理多个样本， 可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中， 小心盖紧管盖， 并 通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应， 短暂振荡并再次快速离心， 其中， TwistAmp反应是靠MgOAc来激活， 在加入MgOAc后， 迅速将样本置于选择的孵育温度下进行 孵育， 将试管放入合适的恒温仪中孵育20min， 温度为39； 0024 S3： 纯化产物。 0025 优选的， 所述病原体培养液为： 沙眼衣原体、 淋球菌、 大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌 和阴道乳酸杆菌。 0026 优选的， 所述试剂为： TIANamp Bact。

24、eria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒； exo试剂盒；Basic试剂盒； TIAN GEN 50TAE Buffer； TIAN GEN Agarose LE； BIOTIUM GelRedTM 10000in water； MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit。 0027 优选的， 所述仪器为： JJ523BC电子天平； Synergy UV系统超纯水仪； DRY BATH金属 浴； HFsafe1500TE生物安全柜； XW80A Vortex振荡器； D1008E离心机； eppendorf 5424R 低温离心机； Biospectrum510凝胶成像。

25、仪； StepOne Plus实时荧光PCR仪。 0028 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 该种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方 法， 将RPA技术利用于解脲脲原体的快速检测， 同时具有较高的灵敏度和良好的特异性， 为 病原体感染领域的快速检测提供了新的方法， 建立的RPA扩增方法在39条件下20min内完 成对解脲脲原体的快速检测， 与对照病原体相比， 仅解脲脲原体呈现经典的扩增曲线； RPA 检测解脲脲原体最低检出限为3pg； 用临床病例样本评估检测效果证明RPA方法具有良好的 可行性， 能够满足临床检测的需要， 建立的解脲脲原体实时荧光RPA方法具有高特异度、 高 灵敏性、 简。

26、便快捷等优点， 可用于解脲脲原体快速检测， 为进一步的研究提供了可行性以及 良好的研究基础。 附图说明 0029 图1为本发明初筛引物的扩增效果示意图； 0030 图2为本发明以解脲脲原体DNA为模板的RPA技术检测UU的扩增时长结果示意图； 0031 图3为本发明以解脲脲原体DNA为模板的RPA检测的扩增曲线示意图； 0032 图4为本发明图3相对应的凝胶电泳结果示意图； 说明书 3/12 页 6 CN 111534624 A 6 0033 图5为本发明以临床培养阳性的解脲脲原体RPA检测的扩增曲线示意图； 0034 图6为本发明图5相对应的凝胶电泳结果示意图； 0035 图7为本发明RPA。

27、检测临床样本的扩增曲线。 具体实施方式 0036 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0037 本发明提供一种技术方案： 一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 包括以下 步骤： 0038 材料准备： 0039 S1： 菌株， 临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液； 临床确认且经培养得到的 病原体培养液； 30列临床女性阴道拭子； 0040 。

28、S2： 试剂； 0041 S3： 仪器； 0042 引物、 探针的设计与合成： 0043 S1： NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列， 应用 Oligo7设计特异性引物和探针， 同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选， 引 物交由生物工程公司合成， 其中， 引物长度： RPA引物比典型的PCR引物更长， 为3035个核 苷酸； 引物序列： 避免引物中存在不寻常的序列， 如一段长序列全由一种特定的核苷酸组 成， 或存在许多重复的短序列； 扩增产物长度： 对于超快速的RPA分析， 扩增子长度不超过 500bp， 理想长度为100200bp： 0044 S。

29、2： 引物选择： 选择靶区： GC含量在4060之间； 重复序列； 很少正向/反向重 复、 回文等； 候选引物： 利用PCR软件如Primer3、 Primer-BLAST进行设计： 引物大小最小30， 最大36； 引物GC最小20， 最大70； 引物Tm最小50， 最大100； 最大允许的单核苷酸重复 长度设定为5； BLAST验证； 0045 S3： 探针设计： 探针由寡核苷酸骨架组成， 骨架中包含： 一个脱碱基核苷酸类似物； 一个侧翼dT-荧光团， 为荧光素， 可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团； 在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团， 通常是合适的淬灭团BHQ； 。

30、一个合适的3 -修 饰基团以阻断探针的聚合酶延伸； 0046 骨架组合物的选择： 根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团， BHQ1作为猝灭 团， C3-间臂作为3 端修饰基团； 0047 S4： 探针长度： 应为4652个核苷酸， 其中30个位于THF位点的5 端， 另外15个位于 其的3 端； 0048 S5： 条件优化： 温度： 根据酶的最适温度， 分别设置37、 38、 39、 40、 41的5 个温度梯度下扩增20min， 扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行， 通过凝胶电泳法 分析产物， 39下条带最亮与试剂说明书一致； 0049 S6： 探针选择： 将设计好的两条探针分别同。

31、时对多个阳性样本进行检测， 通过实时 说明书 4/12 页 7 CN 111534624 A 7 荧光PCR在39下进行检测荧光信号； 0050 模板制备： 0051 S1： 将收集到的标本10000转离心1min， 吸净上清， 保留菌体沉淀， 向菌体沉淀中加 入200 l缓冲液GA， 振荡至沉淀彻底悬浮， 向各管加入20 lProteinaseK溶液， 混匀， 各管加 入220 l的GB液， 振荡15sec出现絮状沉淀， 全部EP管在70金属浴放置10min， 溶液变清亮， 瞬离， 各管加入220 l无水乙醇， 充分振荡15sec需要无沉淀， 瞬离， 将上述所得溶液加入吸 附柱CB3， 吸附。

32、柱放入洁净收集管中， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集 管中， 向CB3中加入500 l缓冲液GD， GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇， 12000转 离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 向CB3中加入600 l漂洗液PW， PW使用前应先按要 求加入规定量的无水乙醇， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 重复上一步， 将装有CB3的收集管放入离心机， 12000转离心2min， 倒掉废液， 将CB3置室温数分钟， 以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液， CB3放入干净的EP管中， 向吸附膜的中间部分悬空加入60。

33、 l 洗脱液TE， 室温放置25分钟， 12000转离心2min， 将核酸溶液收集到EP管中， -20冰冻保 存备用； 0052 S2： 筛选RPA最优引物， 按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液： 正向引 物(10 M)2.4 l、 反向引物(10 M)2.4 l、 无引物再水合缓冲液29.5 l、 模板和水13.2 l(总 体积47.5 l)， 振荡并短暂离心， 对于每份样本， 将47.5 l再水合溶液转移至反应微球中， 吹 打混匀直到整个微球重悬， 对于每份样本， 加入2.5 l的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀， 如需同时如此处理多个样本， 可将MgOAc加到反应管(8联。

34、排管)的盖子中， 小心盖紧管盖， 并 通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应， 短暂振荡并再次快速离心， 其中， TwistAmp反应是靠MgOAc来激活， 在加入MgOAc后， 迅速将样本置于选择的孵育温度下进行 孵育， 将试管放入合适的恒温仪中孵育20min， 温度为39； 0053 S3： 纯化产物； 0054 其中， 所述病原体培养液为： 沙眼衣原体、 淋球菌、 大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌和 阴道乳酸杆菌， 所述试剂为： TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒； exo试剂盒；Basic试剂盒； TIAN GEN 50TAE Buffer；。

35、 TIAN GEN Agarose LE； BIOTIUM GelRedTM 10000in water； MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit， 所述仪器为： JJ523BC电子天平； Synergy UV系统超纯水仪； DRY BATH金属浴； HFsafe 1500TE生物安全柜； XW80A Vortex振荡器； D1008E离心机； eppendorf 5424R低温离心机； Biospectrum510凝胶成像仪； StepOne Plus实时荧光PCR仪。 0055 实施例1 0056 材料准备： 0057 S1： 菌株， 临床经培养方法确认UU阳性的病原体培。

36、养液； 临床确认且经培养得到的 病原体培养液； 30列临床女性阴道拭子； 0058 S2： 试剂； 0059 S3： 仪器； 0060 引物、 探针的设计与合成： 0061 S1： NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列， 应用 Oligo7设计特异性引物和探针， 同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选， 引 说明书 5/12 页 8 CN 111534624 A 8 物交由生物工程公司合成， 其中， 引物长度： RPA引物比典型的PCR引物更长， 为30个核苷酸； 引物序列： 避免引物中存在不寻常的序列， 如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成， 或存 。

37、在许多重复的短序列； 扩增产物长度： 对于超快速的RPA分析， 扩增子长度不超过500bp， 理 想长度为100bp： 0062 S2： 引物选择： 选择靶区： GC含量在40之间； 重复序列； 很少正向/反向重复、 回文 等； 候选引物： 利用PCR软件如Primer 3、 Primer-BLAST进行设计： 引物大小最小30， 最大36； 引物GC最小20， 最大70； 引物Tm最小50， 最大100； 最大允许的单核苷酸重复长度设定 为5； BLAST验证； 0063 S3： 探针设计： 探针由寡核苷酸骨架组成， 骨架中包含： 一个脱碱基核苷酸类似物； 一个侧翼dT-荧光团， 为荧光素，。

38、 可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团； 在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团， 通常是合适的淬灭团BHQ； 一个合适的3 -修 饰基团以阻断探针的聚合酶延伸； 0064 骨架组合物的选择： 根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团， BHQ1作为猝灭 团， C3-间臂作为3 端修饰基团； 0065 S4： 探针长度： 应为46个核苷酸， 其中30个位于THF位点的5 端， 另外15个位于其的 3 端； 0066 S5： 条件优化： 温度： 根据酶的最适温度， 分别设置37、 38、 39、 40、 41的5 个温度梯度下扩增20min， 扩增后的产物立即放在冰上以中止反应。

39、的进行， 通过凝胶电泳法 分析产物， 39下条带最亮与试剂说明书一致； 0067 S6： 探针选择： 将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测， 通过实时 荧光PCR在39下进行检测荧光信号； 0068 模板制备： 0069 S1： 将收集到的标本10000转离心1min， 吸净上清， 保留菌体沉淀， 向菌体沉淀中加 入200 l缓冲液GA， 振荡至沉淀彻底悬浮， 向各管加入20 lProteinase K溶液， 混匀， 各管加 入220 l的GB液， 振荡15sec出现絮状沉淀， 全部EP管在70金属浴放置10min， 溶液变清亮， 瞬离， 各管加入220 l无水乙醇， 充分振荡15。

40、sec需要无沉淀， 瞬离， 将上述所得溶液加入吸 附柱CB3， 吸附柱放入洁净收集管中， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集 管中， 向CB3中加入500 l缓冲液GD， GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇， 12000转 离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 向CB3中加入600 l漂洗液PW， PW使用前应先按要 求加入规定量的无水乙醇， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 重复上一步， 将装有CB3的收集管放入离心机， 12000转离心2min， 倒掉废液， 将CB3置室温数分钟， 以彻底 晾干吸附材料中残余的。

41、漂洗液， CB3放入干净的EP管中， 向吸附膜的中间部分悬空加入60 l 洗脱液TE， 室温放置2分钟， 12000转离心2min， 将核酸溶液收集到EP管中， -20冰冻保存备 用； 0070 S2： 筛选RPA最优引物， 按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液： 正向引 物(10 M)2.4 l、 反向引物(10 M)2.4 l、 无引物再水合缓冲液29.5 l、 模板和水13.2 l(总 体积47.5 l)， 振荡并短暂离心， 对于每份样本， 将47.5 l再水合溶液转移至反应微球中， 吹 打混匀直到整个微球重悬， 对于每份样本， 加入2.5 l的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分。

42、混匀， 如需同时如此处理多个样本， 可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中， 小心盖紧管盖， 并 说明书 6/12 页 9 CN 111534624 A 9 通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应， 短暂振荡并再次快速离心， 其中， TwistAmp反应是靠MgOAc来激活， 在加入MgOAc后， 迅速将样本置于选择的孵育温度下进行 孵育， 将试管放入合适的恒温仪中孵育20min， 温度为39； 0071 S3： 纯化产物； 0072 其中， 所述病原体培养液为： 沙眼衣原体、 淋球菌、 大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌和 阴道乳酸杆菌， 所述试剂为： TIANamp Bacteri。

43、a DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒； exo试剂盒；Basic试剂盒； TIAN GEN 50TAE Buffer； TIAN GEN Agarose LE； BIOTIUM GelRedTM 10000in water； MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit， 所述仪器为： JJ523BC电子天平； Synergy UV系统超纯水仪； DRY BATH金属浴； HFsafe 1500TE生物安全柜； XW80A Vortex振荡器； D1008E离心机； eppendorf 5424R低温离心机； Biospectrum510凝胶成像仪； StepOne Plu。

44、s实时荧光PCR仪。 0073 实施例2 0074 一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法， 包括以下步骤： 0075 材料准备： 0076 S1： 菌株， 临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液； 临床确认且经培养得到的 病原体培养液； 30列临床女性阴道拭子； 0077 S2： 试剂； 0078 S3： 仪器； 0079 引物、 探针的设计与合成： 0080 初步得到的引物序列如表1， 最终选取的引物和探针序列如下表2所示： 0081 说明书 7/12 页 10 CN 111534624 A 10 0082 注： FAM-dT表示以FAM修饰碱基T， THF为四氢呋喃残基， BHQ1-。

45、dT表示以BHQ1修饰碱 基， C3 Spacer为C3-间臂： 0083 S1： NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列， 应用 Oligo7设计特异性引物和探针， 同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选， 引 物交由生物工程公司合成， 其中， 引物长度： RPA引物比典型的PCR引物更长， 为35个核苷酸； 引物序列： 避免引物中存在不寻常的序列， 如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成， 或存 在许多重复的短序列； 扩增产物长度： 对于超快速的RPA分析， 扩增子长度不超过500bp， 理 想长度为200bp： 0084 S2： 引物选择： 选择靶区。

46、： GC含量在60之间； 重复序列； 很少正向/反向重复、 回文 等； 候选引物： 利用PCR软件如Primer 3、 Primer-BLAST进行设计： 引物大小最小30， 最大36； 引物GC最小20， 最大70； 引物Tm最小50， 最大100； 最大允许的单核苷酸重复长度设定 为5； BLAST验证； 0085 S3： 探针设计： 探针由寡核苷酸骨架组成， 骨架中包含： 一个脱碱基核苷酸类似物； 一个侧翼dT-荧光团， 为荧光素， 可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团； 在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团， 通常是合适的淬灭团BHQ； 一个合适的3 -修 饰基团以。

47、阻断探针的聚合酶延伸； 0086 骨架组合物的选择： 根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团， BHQ1作为猝灭 团， C3-间臂作为3 端修饰基团； 0087 S4： 探针长度： 应为52个核苷酸， 其中30个位于THF位点的5 端， 另外15个位于其的 3 端； 0088 S5： 条件优化： 温度： 根据酶的最适温度， 分别设置37、 38、 39、 40、 41的5 个温度梯度下扩增20min， 扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行， 通过凝胶电泳法 分析产物， 39下条带最亮与试剂说明书一致； 0089 S6： 探针选择： 将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测， 通过。

48、实时 荧光PCR在39下进行检测荧光信号； 0090 模板制备： 0091 S1： 将收集到的标本10000转离心1min， 吸净上清， 保留菌体沉淀， 向菌体沉淀中加 入200 l缓冲液GA， 振荡至沉淀彻底悬浮， 向各管加入20 lProteinase K溶液， 混匀， 各管加 入220 l的GB液， 振荡15sec出现絮状沉淀， 全部EP管在70金属浴放置10min， 溶液变清亮， 瞬离， 各管加入220 l无水乙醇， 充分振荡15sec需要无沉淀， 瞬离， 将上述所得溶液加入吸 附柱CB3， 吸附柱放入洁净收集管中， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集 管。

49、中， 向CB3中加入500 l缓冲液GD， GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇， 12000转 离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 向CB3中加入600 l漂洗液PW， PW使用前应先按要 求加入规定量的无水乙醇， 12000转离心30sec， 倒掉废液， 将CB3放回收集管， 重复上一步， 将装有CB3的收集管放入离心机， 12000转离心2min， 倒掉废液， 将CB3置室温数分钟， 以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液， CB3放入干净的EP管中， 向吸附膜的中间部分悬空加入60 l 洗脱液TE， 室温放置5分钟， 12000转离心2min， 将核酸溶液收集到EP管中。

50、， -20冰冻保存备 用； 0092 RPA实时荧光法检测解脲脲原体方法建立： 说明书 8/12 页 11 CN 111534624 A 11 0093 DNA为模板， 采用筛选的最优引物进行RPA扩增， 同时设置超纯水为阴性对照， 测试 反应39反应时长(即扩增循环数)分别为10、 15、 20、 25、 30min时的扩增效果， RPA反应体系 为50 l， 其中， 2.1 l正反向引物(10 M)， 0.6 lexo探针， 29.5 l无引物再水 合缓冲液， 3 lDNA模板和10.2 lddH2O， 充分振荡混匀并且瞬离， 最后加入2.5 l的280mM醋 酸镁(MgOAc)， 将反应。