适合沙棘的DNA提取方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010334913.2 (22)申请日 2020.04.25 (71)申请人 王芳 地址 161000 黑龙江省齐齐哈尔市建华区 文化街道浏园安居社区39号楼4单元 501室 (72)发明人 王芳李伟吴鹏郭茜茜 颜培玉江新杰张珍珠刘林馨 王志刚张智慧赵金波 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 岳泉清 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种适合沙棘的DNA提取方法 (57)摘要 一种适合沙棘。

2、的DNA提取方法， 本发明涉及 一种适合沙棘的DNA提取方法。 本发明的目的是 解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的 问题， 本发明通过研磨前预冷， 去掉了部分糖类 物质， 在研磨加入了PVP， 减少了酚类、 单宁类物 质的影响， 络合多酚和萜类物质， 防止多酚类褐 变而氧化， 去糖缓冲液去除了糖类物质， 为后续 提取高质量DNA打好基础； 用在CTAB缓冲液中加 入蛋白酶K， 在加快细胞膜破裂的同时， 蛋白酶协 同步骤四的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白， 提高了DNA的纯度和产量。 制备出的DNAOD260/ OD280值可达1.92， DNA的纯度较高。 本发明应用 于分子生物。

3、学领域。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 111534508 A 2020.08.14 CN 111534508 A 1.一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于它按以下步骤实现： 一、 取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水， 预冷处理， 取出后自然风干并剪碎， 得到剪碎的叶片； 二、 用液氮将研钵预冷， 加PVP于研钵中， 加剪碎的叶片， 加液氮将叶片研磨至粉末状， 然后转移至离心管中， 每管0.20.4g， 再加入预冷的去糖缓冲液和 -巯基乙醇， 混合后冰 上静止9-15min， 离心3-4min， 弃上清， 收集沉淀； 其中PVP和剪碎的叶片的质量比为： 0.04 0.。

4、06： 1； 三、 在上述沉淀中加入1mL 65预热的CTAB提取缓冲液、 0.10.2mL的2mg/mL蛋白酶K 和7090 l的硼砂， 置于超声波清洗器中65水浴510min， 然后常温下离心， 取上清液并 加入80 l的PVP， 常温下离心， 取上清液； 四、 取步骤三最终得到的上清液至离心管中， 加入等体积的混合溶液， 然后于37水浴 处理30-35min， 并每隔5min颠倒混匀， 常温下离心， 取上清液于EP管中； 混合溶液： 4 6mmol/L盐酸胍、 1020mmol/LTris-HCl和质量浓度2030的乙醇； 五、 向步骤四得到的上清液中加入质量浓度2030的乙醇， 然后再。

5、加入Tris-酚、 氯仿和异戊醇的混合液， 颠倒混匀， 离心， 取上清液； 六、 向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液， 震荡混匀后， 离心， 取上 清液； 七、 向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇， 混匀后于-20沉淀30-35min， 然后4 下离心， 取沉淀， 再用2倍体积的质量浓度为70的乙醇洗涤沉淀23次， 离心， 取沉淀并 自然风干； 八、 向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液， 37水浴处理30-35min， 置于冰箱保存， 即完成沙棘的DNA提取； 其中步骤二中所述去糖缓冲液： 3mol/L KAc， 1mol/L氯化钠， 0.1mol/L Tris-H。

6、Cl， 0.02mol/L EDTA， PH8.0； 步骤三中所述CTAB提取缓冲液： 1.5mol/lNaCl， 0.1mol/L Tris-Hcl， 0.02mol/L EDTA， 2mol/lPVPK-90。 2.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤一中取沙棘幼 嫩叶片两枚， 置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中， 并于4下预处理24h。 3.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤二中加 0.05gPVP于研钵中， 加1g剪碎的叶片， 加液氮将叶片研磨至粉末状， 然后转移至2mL离心管 中， 每管0.3g， 再加入1mL的-18预。

7、冷的去糖缓冲液和10 l的 -巯基乙醇， 混合后冰上静止 10min， 4下5000rpm离心3min， 弃上清， 收集沉淀。 4.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤三中0.15mL的 2mg/mL蛋白酶K和80 l的硼砂。 5.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤三中是在常温 下12500rpm离心10min， 取上清液并加入80 l的PVP， 常温下10000rpm离心8min。 6.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤四中混合溶液 后于37水浴处理30min， 并每隔5min颠倒混匀， 常温下40。

8、0rpm离心10min， 取上清液于 10mLEP管中； 混合溶液： 5mmol/L盐酸胍、 15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25乙醇。 权利要求书 1/2 页 2 CN 111534508 A 2 7.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤五中向步骤四 上清液中加入2mL的质量浓度为30的乙醇， 然后再加入5mL的Tris-酚、 氯仿和异戊醇的混 合液， 颠倒混匀， 4下12000rpm离心5min， 取上清液； 其中Tris-酚、 氯仿和异戊醇的混合液 中Tris-酚、 氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1。 8.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的D。

9、NA提取方法， 其特征在于步骤六向步骤五上 清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液， 震荡混匀后， 4下12000rpm离心8min， 取上 清液； 其中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1。 9.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤七中在-20 下沉淀30min后， 再4下12000rpm离心5min， 取沉淀， 再用2倍体积的质量浓度为70的乙 醇洗涤沉淀23次， 12000rpm离心2min， 取沉淀并自然风干。 10.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法， 其特征在于步骤八中向风干 后的沉淀中加入50 l含RNase的TE溶液； 。

10、其中50 l含RNase的TE溶液中含1 l50mg/mL的 RNase。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111534508 A 3 一种适合沙棘的DNA提取方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域。 背景技术 0002 沙棘为胡颓子科沙棘属， 是一种落叶性灌木， 为药食同源植物， 其根、 茎、 叶、 花、 果， 特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质， 具有止咳化痰、 健胃消食、 活血 散瘀等功效。 现代医学研究， 沙棘可降低胆固醇， 缓解心绞痛发作， 还有防治冠状动脉粥样 硬化性心脏病的作用； 沙棘成长周期较长， 一般34年才开花结果， 为实现其经济价值， 沙 棘在分子。

11、生物学方面的研究亟待展开， 便于后续在其优质种株鉴定， 病虫害防治等方向的 研究。 0003 进行分子生物学分析的关键第一步， 是提取高质量的基因组DNA， 这是获得准确试 验结果的基础。 沙棘组织中富含多糖、 多酚和粗蛋白， 这些次生代谢物会严重的阻扰DNA的 提取纯化。 现有CTAB法提取植物基因组织中的DNA， 是在CTAB缓冲液中加入PVP以去除少许 多糖， 加上用Tris-酚:氯仿:异戊醇来抽提蛋白质， OD260/OD280比值低于1.8， 说明仍有较 多的多糖及蛋白质与DNA混杂在一起， DNA纯度低。 因此需要更加有效的方法来解决提取DNA 中存在多糖和粗蛋白污染的问题， 获得。

12、高纯度DNA。 发明内容 0004 本发明的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题， 而提供一种 适合沙棘的DNA提取方法。 0005 一种适合沙棘的DNA提取方法， 它按以下步骤实现： 0006 一、 取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水， 预冷处理， 取出后自然风干并剪 碎， 得到剪碎的叶片； 0007 二、 用液氮将研钵预冷， 加PVP于研钵中， 加剪碎的叶片， 加液氮将叶片研磨至粉末 状， 然后转移至离心管中， 每管0.20.4g， 再加入预冷的去糖缓冲液和 -巯基乙醇， 混合后 冰上静止9-15min， 离心3-4min， 弃上清， 收集沉淀； 其中PVP和剪碎。

13、的叶片的质量比为： 0.04 0.06： 1； 0008 三、 在上述沉淀中加入1mL 65预热的CTAB提取缓冲液、 0.10.2mL的2mg/mL蛋 白酶K和7090 l的硼砂， 置于超声波清洗器中65水浴510min， 然后常温下离心， 取上 清液并加入80 l的PVP， 常温下离心， 取上清液； 0009 四、 取步骤三最终得到的上清液至离心管中， 加入等体积的混合溶液， 然后于37 水浴处理30-35min， 并每隔5min颠倒混匀， 常温下离心， 取上清液于EP管中； 混合溶液： 4 6mmol/L盐酸胍、 1020mmol/L Tris-HCl和质量浓度2030的乙醇， 0010。

14、 五、 向步骤四得到的上清液中加入质量浓度2030的乙醇， 然后再加入Tris- 酚、 氯仿和异戊醇的混合液， 颠倒混匀， 离心， 取上清液； 0011 六、 向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液， 震荡混匀后， 离心， 说明书 1/5 页 4 CN 111534508 A 4 取上清液； 0012 七、 向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇， 混匀后于-20沉淀30-35min， 然 后4下离心， 取沉淀， 再用2倍体积的质量浓度为70的乙醇洗涤沉淀23次， 离心， 取沉 淀并自然风干； 0013 八、 向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液， 37水浴处理30-35mi。

15、n， 置于冰箱 保存， 即完成沙棘的DNA提取； 0014 其中步骤二中所述去糖缓冲液： 3mol/L KAc， 1mol/L氯化钠， 0.1mol/L Tris-HCl， 0.02mol/L EDTA， PH8.0； 0015 步骤三中所述CTAB提取缓冲液： 1.5mol/lNaCl， 0.1mol/L Tris-Hcl， 0.02mol/L EDTA， 2mol/lPVPK-90。 0016 本发明的优点： 0017 1、 本发明中有效去除沙棘叶片组织中的多糖、 多酚和粗蛋白， 提取效果理想， 所得 DNA的纯度高， DNA片段完整， 能满足于进一步分子生物学实验的要求， 准确度更高。 。

16、0018 2、 本发明通过研磨前预冷， 去掉了部分糖类物质， 在研磨加入了PVP(聚乙烯吡咯 烷酮)， 减少了酚类、 单宁类物质的影响， 可以起到抗氧化作用， 络合多酚和萜类物质， 防止 多酚类褐变而氧化， 还可以去除多糖和色素， 而色素是PCR的强抑制剂； 去糖缓冲液去除了 糖类物质， 为后续提取高质量DNA打好基础； 用在CTAB缓冲液中加入蛋白酶K， 在加快细胞膜 破裂的同时， 蛋白酶K使膜蛋白降解， 使与DNA结合的蛋白质降解， DNA充分游离， 协同步骤四 的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白， 提高了DNA的纯度和产量， 本发明提取的DNA的OD260/ OD280值为1.871.9。

17、2， DNA的纯度较高。 0019 3、 本发明成本低、 操作简便。 0020 本发明适用于提取沙棘DNA， 应用于分子生物学领域。 附图说明 0021 图1为实施例1提取的沙棘DNA的0.75琼脂糖凝胶电泳检测图， 其中泳道1为 Maker， 2-7为实施例1提取的沙棘DNA。 具体实施方式 0022 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0023 具体实施方式一： 本实施方式一种适合沙棘的DNA提取方法， 它按以下步骤实现： 0024 一、 取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水， 预冷处理， 取出后自然风干并剪 碎， 得到剪碎的叶片； 0。

18、025 二、 用液氮将研钵预冷， 加PVP于研钵中， 加剪碎的叶片， 加液氮将叶片研磨至粉末 状， 然后转移至离心管中， 每管0.20.4g， 再加入预冷的去糖缓冲液和 -巯基乙醇， 混合后 冰上静止9-15min， 离心3-4min， 弃上清， 收集沉淀； 其中PVP和剪碎的叶片的质量比为： 0.04 0.06： 1； 0026 三、 在上述沉淀中加入1mL 65预热的CTAB提取缓冲液、 0.10.2mL的2mg/mL蛋 白酶K和7090 l的硼砂， 置于超声波清洗器中65水浴510min， 然后常温下离心， 取上 说明书 2/5 页 5 CN 111534508 A 5 清液并加入80 。

19、l的PVP， 常温下离心， 取上清液； 0027 四、 取步骤三最终得到的上清液至离心管中， 加入等体积的混合溶液， 然后于37 水浴处理30-35min， 并每隔5min颠倒混匀， 常温下离心， 取上清液于EP管中； 混合溶液： 4 6mmol/L盐酸胍、 1020mmol/LTris-HCl和质量浓度2030的乙醇； 0028 五、 向步骤四得到的上清液中加入质量浓度2030的乙醇， 然后再加入Tris- 酚、 氯仿和异戊醇的混合液， 颠倒混匀， 离心， 取上清液； 0029 六、 向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液， 震荡混匀后， 离心， 取上清液； 0030 七、 向步骤。

20、六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇， 混匀后于-20沉淀30-35min， 然 后4下离心， 取沉淀， 再用2倍体积的质量浓度为70的乙醇洗涤沉淀23次， 离心， 取沉 淀并自然风干； 0031 八、 向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液， 37水浴处理30-35min， 置于冰箱 保存， 即完成沙棘的DNA提取； 0032 其中步骤二中所述去糖缓冲液： 3mol/L KAc， 1mol/L氯化钠， 0.1mol/L Tris-HCl， 0.02mol/L EDTA， PH8.0； 0033 步骤三中所述CTAB提取缓冲液： 1.5mol/lNaCl， 0.1mol/L Tris-Hcl。

21、， 0.02mol/L EDTA， 2mol/lPVPK-90。 0034 本实施方式步骤八中DNA的溶液， 经1琼脂糖凝胶电泳检测， 并在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、 280nm处的吸收值和DNA的浓度， 并根据 OD260/OD280值来判断DNA的纯度； 结果OD260/OD280值为1.871.92， DNA的纯度较高。 0035 具体实施方式二： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤一中取沙棘幼嫩 叶片两枚， 置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中， 并于4下预处理24h。 其它步骤及参数与具体 实施方式一相同。 0036 具体。

22、实施方式三： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤二中加0.05gPVP 于研钵中， 加1g剪碎的叶片， 加液氮将叶片研磨至粉末状， 然后转移至2mL离心管中， 每管 0.3g， 再加入1mL的-18预冷的去糖缓冲液和10 l的 -巯基乙醇， 混合后冰上静止10min， 4 下5000rpm离心3min， 弃上清， 收集沉淀。 其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 0037 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤三中0.15mL的 2mg/mL蛋白酶K和80 l的硼砂。 其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 0038 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式一不同。

23、的是， 步骤三中是在常温下 12500rpm离心10min， 取上清液并加入80 l的PVP， 常温下10000rpm离心8min。 其它步骤及参 数与具体实施方式一相同。 0039 具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤四中混合溶液后 于37水浴处理30min， 并每隔5min颠倒混匀， 常温下400rpm离心10min， 取上清液于10mLEP 管中； 混合溶液： 5mmol/L盐酸胍、 15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25乙醇。 其它步骤及参 数与具体实施方式一相同。 0040 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤五中向步骤四上 。

24、清液中加入2mL的质量浓度为30的乙醇， 然后再加入5mL的Tris-酚、 氯仿和异戊醇的混合 液， 颠倒混匀， 4下12000rpm离心5min， 取上清液； 其中Tris-酚、 氯仿和异戊醇的混合液中 说明书 3/5 页 6 CN 111534508 A 6 Tris-酚、 氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1。 其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 0041 具体实施方式八： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤六向步骤五上清 液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液， 震荡混匀后， 4下12000rpm离心8min， 取上清 液； 其中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:。

25、1。 其它步骤及参数与具体实 施方式一相同。 0042 具体实施方式九： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤七中在-20下沉 淀30min后， 再4下12000rpm离心5min， 取沉淀， 再用2倍体积的质量浓度为70的乙醇洗 涤沉淀23次， 12000rpm离心2min， 取沉淀并自然风干。 其它步骤及参数与具体实施方式一 相同。 0043 具体实施方式十： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 步骤八中向风干后的 沉淀中加入50 l含RNase的TE溶液； 其中50 l含RNase的TE溶液中含1 l 50mg/mL的RNase。 其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 0044 。

26、通过以下实施例验证本发明的有益效果： 0045 实施例： 0046 本实施例一种适合沙棘的DNA提取方法， 它按以下步骤实现： 0047 一、 取沙棘幼嫩叶片两枚， 置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中， 并于4下预处理24h， 取出后自然风干并剪碎； 0048 二、 用液氮将研钵预冷， 加0.05gPVP于研钵中， 加1g剪碎的叶片， 加液氮将叶片研 磨至粉末状， 然后转移至2mL离心管中， 每管0.2g， 再加入1mL的-18预冷的去糖缓冲液和 10 l的 -巯基乙醇， 混合后冰上静止10min， 4下5000rpm离心3min， 弃上清， 收集沉淀； 0049 三、 在上述沉淀中加入1m。

27、L65预热的CTAB提取缓冲液、 0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和 80 l的硼砂， 置于超声波清洗器中65水浴8min， 然后常温下12500rpm离心10min， 取上清 液并加入80 l的PVP， 常温下10000rpm离心8min， 取上清液； 0050 四、 取步骤三最终得到的上清液至2mL离心管中， 加入混合溶液， 然后于37水浴 处理30min， 并每隔5min颠倒混匀， 常温下400rpm离心10min， 取上清液于10mLEP管中； 混合 溶液： 5mmol/L盐酸胍、 15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25乙醇； 0051 五、 向步骤四上清液中加入2mL的质量。

28、浓度为30的乙醇， 然后再加入5mL的Tris- 酚、 氯仿和异戊醇的混合液， 颠倒混匀， 4下12000rpm离心5min， 取上清液； 其中Tris-酚、 氯仿和异戊醇的混合液中Tris-酚、 氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1； 0052 六、 向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液， 震荡混匀后， 4下 12000rpm离心8min， 取上清液； 其中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1； 0053 七、 向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇， 混匀后于-20沉淀30min， 再在4 下12000rpm离心5min， 取沉淀， 再用2倍体积的质量浓度为70。

29、的乙醇洗涤沉淀23次， 12000rpm离心2min， 取沉淀并自然风干； 0054 八、 向风干后的沉淀中加入50 l含RNase的TE溶液， 37水浴处理30min， 置于-20 冰箱保存， 即完成沙棘的DNA提取； 0055 其中步骤二中所述去糖缓冲液： 3mol/L KAc， 1mol/L氯化钠， 0.1mol/L Tris-HCl， 0.02mol/L EDTA， PH8.0； 0056 步骤三中所述CTAB提取缓冲液： 1.5mol/LNaCl， 0.1mol/LTris-Hcl， 0.02mol/ 说明书 4/5 页 7 CN 111534508 A 7 LEDTA， 2mol/。

30、LPVPK-90； 0057 步骤八中50 l含RNase的TE溶液中含1 l 50mg/mLRNase。 0058 将本实施例提取的DNA溶液用双蒸水稀释50倍后， 用紫外分光光度计测定其在 260nm和280nm的OD值， 根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度， 然后根据DNA浓度(ng/ L) OD26050稀释倍数， 计算DNA的浓度。 0059 表1DNA纯度和浓度的检测 0060 编号OD260/OD280DNA浓度(ng/ L) 11.89717 21.91823 31.87804 41.91931 51.92929 61.84728 0061 由上述结果可知， 本实施。

31、例提取的DNA OD260/OD280值为1.92， DNA的纯度较高。 将 本实施例提取的沙棘基因组DNA进行0.75琼脂糖凝胶电泳检测， 从电泳图1中可见， 在 750bp和500bp之间有一条明显的亮带(大约619bp)， 这条带亮度高且清晰整齐， 说明无杂质 残留， 说明DNA产量高、 无降解、 完整性好， 纯度高。 0062 对照组采用常规CTAB法提取沙棘DNA,提取的DNA溶液用双蒸水稀释50倍后， 用紫 外分光光度计测定其在260nm和280nm的OD值， 根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度， 对照 组的OD260/OD280值为1.71-1.77， 电泳图上有明显降解现象， 拖尾严重难以区分主带， 由此 可知， 对照组提取的DNA中多糖、 多酚类和蛋白类物质残余量高。 说明书 5/5 页 8 CN 111534508 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 111534508 A 9 。