用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf

上传人:龙脉 文档编号:10519158 上传时间:2021-06-22 格式:PDF 页数:12 大小:536.49KB
收藏 版权申诉 举报 下载
用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf_第1页
第1页 / 共12页
用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf_第2页
第2页 / 共12页
用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf_第3页
第3页 / 共12页
文档描述:

《用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf(12页完成版)》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010359968.9 (22)申请日 2020.04.29 (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159号 (72)发明人 尹佟明吴怀通邱宇 (74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务 所(普通合伙) 32274 代理人 邱兴天 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称。

2、 用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物 组及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴定美洲黑杨性别 的SSR分子标记引物组及其应用, 属于分子遗传 育种技术领域。 本申请以提取的美洲黑杨基因组 DNA为模板, 利用SSR分子标记NJFU582、 NJFU600 和NJFU602的引物对进行PCR扩增, 若扩增产物中 含有与SSR分子标记NJFU582、 NJFU600和NJFU602 的分子量相符的条带, 则所述待测美洲黑杨为雄 株, 反之为雌株。 在美洲黑杨育种和栽培管理过 程中, 可以在苗期利用叶片等营养组织提取DNA 进行性别鉴定, 用于美洲黑杨不飞絮雄株的早期 选择, 也可用于。

3、美洲黑杨造林过程中, 对苗木性 别的监测与管理, 从而有效控制苗木达到性成熟 龄后飞絮带来的问题。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 111534628 A 2020.08.14 CN 111534628 A 1.用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组, 其特征在于, 所述SSR分子标记选自 NJFU582、 NJFU600和NJFU602中的至少一个; 所述引物组包括用于扩增SSR分子标记 NJFU582、 NJFU600和NJFU602的引物对; 其中, 用于扩增SSR分子标记NJFU582的引物对如下: NJFU582正向引物: 5 -CAATATTTGTATT。

4、GCCCGTAG-3 ; NJFU582反向引物: 5 -CCACTGTTCCATGTTTTAAGG-3 ; 用于扩增SSR分子标记NJFU600的引物对如下: NJFU600正向引物: 5 -GGACAACACACAAGGCTCTGC-3 ; NJFU600反向引物: 5 -TCGTGGGTTGATGTGTAGAGG-3 ; 用于扩增SSR分子标记NJFU602的引物对如下: NJFU602正向引物: 5 -TGCAAGTACAACAGGAGTTCAA-3 ; NJFU602反向引物: 5 -TCCACCGACAAGAGACAAAGA-3 。 2.含有权利要求1所述的用于鉴定美洲黑杨性别的S。

5、SR分子标记引物组的试剂盒。 3.权利要求1所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨分子标记辅助选择育种中的应用。 4.权利要求1所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨性别鉴定、 监测、 管理中的应用。 5.权利要求4所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨不飞絮雄株选育中的应用。 6.根据权利要求4所述的应用, 其特征在于, 包括以下步骤: 提取待测美洲黑杨的基因 组DNA; 以提取的美洲黑杨基因组DNA为模板, 利用SSR分子标记NJFU582、 NJFU600和NJFU602 的引物对进行PCR扩增, 若扩增产物中含有与SSR分子标记NJFU582、 NJFU600和NJFU602的分 子量相符的。

6、条带, 则所述待测美洲黑杨为雄株, 反之为雌株。 7.根据权利要求6所述的应用, 其特征在于, 所述PCR反应体系为: 每25 L体系中, 20ng/ L DNA模板2 L, 10 mol/ L正、 反向引物各0.5 L, 10PCR buffer 2.5 L, 10mmol/L DNTPs 0.5 L, 25mmol/L MgCl2 1.5 L, 5U/ L Taq酶0.2 L, ddH2O 17.3 L。 8.根据权利要求6所述的应用, 其特征在于, 所述PCR扩增程序为: 94预变性5min; 94 变性45s, 60退火45s, 72延伸60s, 共35个循环; 再72延伸10min,。

7、 最后4保温。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111534628 A 2 用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子遗传育种技术领域, 具体涉及一种用于鉴定美洲黑杨性别 的SSR 分子标记引物组及其应用。 背景技术 0002 杨树(Populus spp.)是世界上分布最广、 栽培面积最大的速生用材树种之 一, 对 经济发展、 环境建设发挥着重要的作用。 我国杨树人工林面积约9000万 亩, 居世界首位, 另 外我国还有3750万亩的杨树天然林。 美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)是杨属 (Populus)黑杨派树种, 。

8、原产于北美洲, 分布于美国 西部、 中部和西南部, 加拿大西南端及 墨西哥西北部。 美洲黑杨是生长迅速的 高大乔木, 是重要的速生用材造林树种之一, 在全 球广泛引种栽培。 美洲黑杨 成具有成材速度快、 抗性好、 生态适应性强的特点。 我国于20世 纪70年代引 进美洲黑杨, 在我国长江中下游和黄淮海平原大面积推广, 已成为我国南方速 生杨的主要栽培品种。 仅以江苏为例, 美洲黑杨栽培面积达1400万亩, 蓄积量 5500万m3, 年 产木材635万m3, 碳汇12587万吨。 但由于杨树飞絮带来严重 环境问题, 引发越来越广泛的 社会关注。 据测算, 一棵成年杨树雌株每年产生 超过1公斤的杨。

9、絮, 以前江苏主推的美洲黑 杨无性系基本上是雌株, 每年产生 超10万吨的飞絮。 0003 杨絮在每年春季漫天飞舞, 已经成为当前制约杨树产业发展重要因素。 杨 树飞絮 会造成严重的环境污染, 并带来火灾隐患等一系列问题。 杨树是雌雄异 株植物, 杨絮是雌 株在性成熟后开花产生的, 它是附着在种子表面的一种絮状 纤维, 由子房底部胎座表层细 胞凸起发育形成。 雄株花序只有花药, 没有子房, 则不会产生种子和杨絮。 目前生产上主要 采用选育和种植杨树雄株来解决这一 问题。 因此, 开发可靠的方法技术, 用于美洲黑杨性 别早期鉴定有重要应用价 值。 0004 美洲黑杨雌雄性别的差异主要体现在花序结。

10、构上, 雌花由三片柱头和子房 构成, 雄花由多个花药簇生在花托上构成。 其它器官包括根、 茎、 叶、 树皮均 不能体现雌雄之间的 差别。 但是, 美洲黑杨的童期较长, 一般为6-7年才达到 开花年龄。 所以在品种的选育过程 中, 由于不能在苗期进行性别鉴定, 往往需 要等到植株开花后才能选育不产生杨絮的雄 株, 因此, 开发出用于苗期性别鉴 定的技术手段, 可以大大缩短育种周期, 提高选育效率。 另外, 在美洲黑杨造 林与推广过程中, 由于缺乏在苗期进行性别鉴定的技术方法, 无法对 美洲黑杨 苗木的性别进行有效管理, 一旦雌株混入, 达到性成熟龄后就会带来飞絮污染。 因此, 开发用于美洲黑杨早。

11、期性别鉴定的分子标记, 对美洲黑杨营林过程中苗 木的性别监 测与管理也有重要应用价值。 发明内容 0005 针对现有技术存在的上述问题, 本发明所要解决的技术问题是提供上述用 于鉴 定美洲黑杨性别的SSR分子标记的引物组; 本发明所要解决的再一问题是 提供上述SSR分 子标记及其引物组在美洲黑杨性别早期鉴定和性别标记辅助选 择育种中的应用。 说明书 1/5 页 3 CN 111534628 A 3 0006 为了解决上述技术问题, 本发明所采用的技术方案如下: 0007 用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组, SSR分子标记选自 NJFU582、 NJFU600和NJFU602中的至少一。

12、个; 引物组包括用于扩增SSR分 子标记NJFU582、 NJFU600和 NJFU602的引物对; 0008 其中, 用于扩增SSR分子标记NJFU582的引物对如下: 0009 NJFU582正向引物: 5 -CAATATTTGTATTGCCCGTAG-3 ; 0010 NJFU582反向引物: 5 -CCACTGTTCCATGTTTTAAGG-3 ; 0011 用于扩增SSR分子标记NJFU600的引物对如下: 0012 NJFU600正向引物: 5 -GGACAACACACAAGGCTCTGC-3 ; 0013 NJFU600反向引物: 5 -TCGTGGGTTGATGTGTAGAGG。

13、-3 ; 0014 用于扩增SSR分子标记NJFU602的引物对如下: 0015 NJFU602正向引物: 5 -TGCAAGTACAACAGGAGTTCAA-3 ; 0016 NJFU602反向引物: 5 -TCCACCGACAAGAGACAAAGA-3 。 0017 上述引物对中的引物经过经过修饰和/或经过标记物标记也在本申请的保 护范 围。 0018 含有上述用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组的试剂盒。 0019 所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨分子标记辅助选择育种中的应用。 0020 所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨性别鉴定、 监测、 管理中的应用。 0021 所述的S。

14、SR分子标记引物组在美洲黑杨不飞絮雄株选育中的应用。 0022 进一步的, SSR分子标记引物组在美洲黑杨性别鉴定、 监测、 管理中的应 用, 包括 以下步骤: 提取待测美洲黑杨的基因组DNA; 以提取的美洲黑杨基因 组DNA为模板, 利用SSR 分子标记NJFU582、 NJFU600和NJFU602的引物对 进行PCR扩增, 若扩增产物中含有与SSR分 子标记NJFU582、 NJFU600和 NJFU602的分子量相符的条带, 则所述待测美洲黑杨为雄株, 反 之为雌株。 0023 进一步的, PCR反应体系为: 每25 L体系中, 20ng/ L DNA模板2 L, 10 mol/ L正。

15、、 反向引物各0.5 L, 10PCR buffer 2.5 L, 10mmol/L DNTPs 0.5 L, 25mmol/L MgCl2 1.5 L, 5U/ L Taq酶0.2 L, ddH2O 17.3 L。 0024 进一步的, PCR扩增程序为: 94预变性5min; 94变性45s, 60退火 45s, 72延 伸60s, 共35个循环; 再72延伸10min, 最后4保温。 0025 有益效果: 相比于现有技术, 本发明的优点为: 0026 本发明通过美洲黑杨全同胞F1群体, 对性别决定位点进行精细定位; 再结 合美洲 黑杨自然群体材料进行性别决定位点关联分析。 最后, 美洲黑。

16、杨的性别 决定位点定位在19 号染色体236Kb区间内。 然后利用第三代高通量测序技术 对美洲黑杨雄株进行de novo全 基因组测序组装, 获得性别紧密连锁区的X染 色体和Y染色体单倍型序列。 通过比对性别定 位区间X和Y染色体单倍型序 列, 结合自然群体位点杂合度分析, 找到了一段42Kb的Y染色 体特异的半合 子序列。 根据这段Y染色体特异的半合子序列开发SSR引物, 对美洲黑杨自 然群体材料进行PCR扩增, 筛选出美洲黑杨雄株特异的三对SSR通用引物 (NJFU582、 NJFU600和NJFU602)。 这三对引物在美洲黑杨雄株中均能扩增 出清晰稳定的PCR产物电泳 谱带, 但在雌株。

17、中不能扩增出任何PCR产物。 利 用本发明开发的通用SSR引物NJFU582、 说明书 2/5 页 4 CN 111534628 A 4 NJFU600和NJFU602可以实现美洲 黑杨性别的早期鉴定, 可以应用于美洲黑杨造林苗木的 性别监测, 在不飞絮杨 树分子标记辅助选择育种和杨树飞絮管理中都有重要应用。 附图说明 0027 图1是美洲黑杨性别决定位点的精细定位图; 图中, 美洲黑杨的性别决定 位点, 利 用全同胞F1群体, 被精细定位在19号染色体的近端粒区; 图A: 通 过72株小群体的初定位结 果; 图B: 通过1077株大群体精细定位在236Kb的 区间内; 图中SLR(Sex-l。

18、inked region)为 性别紧密连锁区; 0028 图2是美洲黑杨性别决定位点的全基因组关联分析(GWAS)结果图; 图 中, 美洲黑 杨的性别关联序列信号均分布在19号染色体的近端粒区; 图中SLR (Sex-linked region) 为性别紧密连锁区; 0029 图3是美洲黑杨性别紧密连锁区X和Y染色体单倍型间的序列比对图; 图 中TCP、 CLC、 MET1为位于半合子区附近的编码基因, Tel为端粒; Y染色体 上的环状片段即美洲黑杨 性别决定区为Y染色体特异的半合子序列; 0030 图4是扩增NJFU582的引物对美洲黑杨自然群体材料进行性别分子鉴定的 凝胶电 泳图; 图A。

19、是36棵雄株扩增产物的电泳谱带; 图B是36棵雌株的扩增 产物电泳结果, 雌株中 均未扩增出任何PCR产物电泳谱带; 0031 图5是扩增NJFU600的引物对美洲黑杨自然群体材料进行性别分子鉴定的 凝胶电 泳图; 图A是36棵雄株扩增产物的电泳谱带; 图B是36棵雌株的扩增 产物电泳结果, 雌株中 均未扩增出任何PCR产物电泳谱带; 0032 图6是扩增NJFU602的引物对美洲黑杨自然群体材料进行性别分子鉴定的 凝胶电 泳图; 图A是36棵雄株扩增产物的电泳谱带; 图B是36棵雌株的扩增 产物电泳结果, 雌株中 均未扩增出任何PCR产物电泳谱带。 具体实施方式 0033 下面结合具体实施例。

20、对本发明进一步进行描述。 以下实施例中未作具体说明 的 分子生物学实验方法, 均可参照 分子克隆实验指南 (第三版)J.萨姆布鲁 克一书中所列 的方法或本领域的常规方法进行, 或者按照试剂盒和产品说明书进 行。 0034 下述实施例中所用的材料、 试剂等, 如无特殊说明, 均可从商业途径得到。 0035 实施例1 0036 (1)美洲黑杨的性别决定位点的精细定位 0037 于2012年构建了美洲黑杨杂交F1群体, 该群体包括1077个杂交子代, 种 植于泗洪 林场。 截止到2019年, 杂交子代已经全部达到性成熟。 获得杂交子代 的性别表型。 首先, 在 杂交群体中随机选择72个子代个体进行性。

21、别决定位点的 初步定位, 结果性别决定点定位 于19号染色体的近端粒区, 在性别位点与SSR 位点N110之间只检测到一个重组单株(图 1A)。 然后, 在目标区间内开发SSR 引物, 并利用全部的杂交子代1077株个体对性别位点进 行精细定位。 结果美洲 黑杨性别决定位点被定位于19号染色体近端粒的236Kb区间内, 在 性别决定 位点和SSR位点N362之间共检测到了4个重组单株, 性别决定位点与SSR位 点 N283和N293完全连锁(图1B)。 说明书 3/5 页 5 CN 111534628 A 5 0038 (2)美洲黑杨性别决定位点的全基因组关联分析 0039 在泗洪林场的美洲黑。

22、杨种质资源圃中, 选择49棵雌株, 46棵雄株进行高 通量的重 测序, 测序深度为杨树基因组的20倍。 以杨树种质创新与品种改良重 点实验室构建的美洲 黑杨基因组为参考序列, 对美洲黑杨的性别决定位点进行 基于SNP的全基因组关联分析。 结果显示, 美洲黑杨的性别决定位点被关联到 19号染色体的近端粒区, 且与性别100的 关联信号全部位于分离群体的精细 定位区间内(SLR区)(图2)。 0040 (3)美洲黑杨性别紧密连锁区的单倍型构建 0041 选择杂交群体的母本和一株雄株子代进行全基因组测序, 测序平台是 PacBio Sequel, 每个个体获得75倍测序深度的原始数据。 通过基因组组。

23、装, 获 得了美洲黑杨雌、 雄 个体的参考基因组。 利用精细定位结果中的连锁引物进行 性别决定区间的锚定。 结果显 示, 通过与性别连锁的SSR引物进行雌、 雄参考 基因组的锚定时, 在雄株参考基因组中得到 X和Y染色体单倍型在性别决定区 间的完整序列。 比对X与Y染色体单倍型序列, 发现Y染色 体上有一段42Kb 半合子序列, 全基因组关联分析中发现的所有与性别100关联的信号全 部位于 该区段内(美洲黑扬性别决定区)。 因此, 这段Y染色体特异的半合子序列, 可以用 于开发鉴定美洲黑杨性别的特异引物(图3)。 0042 (4)美洲黑杨性别鉴定引物开发 0043 根据美洲黑杨Y染色体特异的半。

24、合子序列, 利用BatchPrimer3进行SSR引 物的开 发设计。 设计的参数要求包括扩增产物大小为100-350bp, Tm值为55-65 。 在美洲黑杨种 质资源库中随机选择雌、 雄各5株进行引物的筛选。 最终选 择了3对SSR引物(NJFU582、 NJFU600和NJFU602)在雄株中可以稳定扩增 得到清晰稳定的PCR产物电泳谱带, 而在雌株 中则得不到任何扩增产物。 利用 美洲黑杨种质资源库中性别已知的426株个体, 用于验证 上述3对引物对美洲 黑杨种性别鉴定的准确性。 结果显示, 3对引物的鉴定结果均为100 准确。 图 4、 图5和图6分别是SSR引物NJFU582、 N。

25、JFU600和NJFU602对美洲黑杨种 质材料性 别鉴定的凝胶电泳图, 图4、 图5、 图6中, 图A是36棵雄株扩增产 物的电泳谱带; 图B是36棵雌 株的扩增产物电泳结果, 雌株中均未扩增出任 何PCR产物电泳谱带。 0044 在本申请中使用到的美洲黑杨材料来源于美洲黑杨种质资源库。 该种质资 源库 保存在江苏省泗洪林场, 材料于1994年从美国密西西比河沿岸的美洲黑杨 自然群体中采 集, 美洲黑杨种质资源库于1998年建成。 每年对资源库中的材料 进行生长量测定和性别调 查, 获得了所有植株的准确的性别数据, 为性别鉴定 引物的开发和验证提供了的材料。 目 前主推的美洲黑杨品种, 大多。

26、出自该种质 资源库中的材料或其杂交后代。 因此, 选择该种 质资源库中美洲黑杨材料进行 性别鉴定引物的验证, 有广泛的代表性。 0045 (5)在上述美洲黑杨性别鉴定引物开发和实施过程中, 使用到的关键操作 步骤说 明如下: 0046 1)美洲黑杨基因组DNA提取: 0047 选取美洲黑杨的幼嫩叶片, 保存在-80中备用。 称取0.1g采集的叶片样品 在液 氮中充分研磨, 使用天根生化科技有限公司生产的植物DNA提取试剂盒(目 录号: DP320), 按照说明书中的操作步骤进行DNA提取。 提取获得的DNA溶 液使用Thermo公司生产的 NanoDrop 2000进行浓度测定, 并调整最终模。

27、板浓度 为20ng/ L, 用于后续的PCR扩增检测。 0048 2)PCR反应体系 说明书 4/5 页 6 CN 111534628 A 6 0049 以提取的美洲黑杨基因组DNA为模板, 且模板浓度为20ng/ L, 选择25 L 反应体系 用于PCR反应。 其反应体系包括以下试剂和浓度: 0050 0051 0052 PCR扩增条件如下: 94预变性5min; 94变性45s, 60退火45s, 72 延伸60s, 共35个循环; 再72延伸10min, 最后4保温。 0053 3)PCR反应产物检测 0054 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对于PCR反应产物的检测具有灵敏度高, 检测 通量大。

28、 的优点。 因此, 本发明专利推荐使用该方法电泳对PCR扩增后的产物进 行条带检测。 具体的 凝胶电泳方法如下: 0055 电泳: 扩增产物经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 凝胶浓度30, 凝胶大 小180 1201.5mm, 电泳缓冲液为0.5TBE, 恒压200v, 电泳1-1.5h。 0056 银染: 在电泳结束后, 把凝胶取下, 放置在AgNO3溶液(2.0g AgNO3 溶于1000ml 水中)中银染15min, 溶液倒入废液回收桶中。 0057 显色: 用显色液(20gNaOH, 加水至1000mL)和10mL甲醛(现用现加) 显色, 共5- 8min, 溶液倒入废液回收桶中 005。

29、8 漂洗: 用自来水小心清洗2-3次凝胶, 主要目的是清洗凝胶上的甲醛和 NaOH。 0059 拍照, 读胶: 把凝胶放置在X线胶片观察灯上进行拍照。 根据每个电泳 道上是否 有目的条带进行美洲黑杨植株性别鉴定。 若泳道中存在目的条带, 则该 植株为雄株, 否则 为雌株。 说明书 5/5 页 7 CN 111534628 A 7 序列表 南京林业大学 用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用 1 6 SIPOSequenceListing 1.0 1 21 DNA NJFU582正向引物(artificial) 1 caatatttgt attgcccgta g 21 2 21 DN。

30、A NJFU582反向引物(artificial) 2 ccactgttcc atgttttaag g 21 3 21 DNA NJFU600正向引物(artificial) 3 ggacaacaca caaggctctg c 21 4 21 DNA NJFU600反向引物(artificial) 4 tcgtgggttg atgtgtagag g 21 5 22 DNA NJFU602正向引物(artificial) 5 tgcaagtaca acaggagttc aa 22 6 21 序列表 1/2 页 8 CN 111534628 A 8 DNA NJFU602反向引物(artificial) 6 tccaccgaca agagacaaag a 21 序列表 2/2 页 9 CN 111534628 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 10 CN 111534628 A 10 图4 图5 说明书附图 2/3 页 11 CN 111534628 A 11 图6 说明书附图 3/3 页 12 CN 111534628 A 12 。

展开阅读全文
内容关键字: 用于 鉴定 美洲 性别 SSR 分子 标记 引物 及其 应用
关于本文
本文标题:用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用.pdf
链接地址:https://www.zhuanlichaxun.net/pdf/10519158.html
关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1