与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010527252.5 (22)申请日 2020.06.11 (71)申请人 广西医科大学第一附属医院 地址 530021 广西壮族自治区南宁市青秀 区双拥路6号 (72)发明人 黄家豪唐卫中张森郭云 韦瑞丽刘海洲赵阳 (74)专利代理机构 广西南宁明智专利商标代理 有限责任公司 45106 代理人 林兴宁 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的 mi。

2、RNA标志物及应用 (57)摘要 本发明提供了一种与结直肠癌患者肿瘤突 变负荷水平相关的miRNA标志物， 该miRNA标志物 为miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224- 5p四种miRNA的一种或多种， 以此miRNA标志物来 构建miRNA分类器， 通过常规活检获取患者少量 的肿瘤组织， 以此miRNA分类器对肿瘤组织进行 检测， 根据miRNA标志物与肿瘤突变负荷的相关 性， 即可推断结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平， 进而在免疫治疗过程中指导医生应用PD-1抑制 剂。 和直接检测直肠癌患者的肿瘤突变负荷水平 相比， 通过此miRNA标志物来间接推断直。

3、肠癌患 者的肿瘤突变负荷水平的应用更简单， 不需要支 付高额的检测费用， 因此更利用推广应用。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图4页 CN 111534598 A 2020.08.14 CN 111534598 A 1.一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物， 其特征是： 所述miRNA 标志物为miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p四种miRNA中的一种或多种。 2.根据权利要求1所述的与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物， 其特 征是： 所述miRNA标志物为miR-625-3p、 miR-552-。

4、5p、 miR-592和miR-224-5p四种miRNA的组 合。 3.一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物的应用， 其特征是： 以 miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p四种miRNA的组合来构建miRNA分类器， 用 于推断结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111534598 A 2 与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物及 应用 技术领域 0001 本发明涉及一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷 （TMB） 水平相关的miRNA标志物及 应用， 属于生物技术的医学应用技术领域。 背。

5、景技术 0002 结直肠癌 （CRC） 是最常见的恶性肿瘤之一。 它是世界上第三大致死性疾病， 5年生 存率约为50%， 10年生存率约为20%。 正常情况下， CRC在发展到晚期之前是无症状的， 高达 25%的患者确诊时已存在远处器官转移， 因此CRC患者迫切需要更为有效的治疗。 0003 免疫治疗是继传统的手术、 化疗、 放疗和靶向治疗后的一种新兴的肿瘤治疗手段。 针对程序性细胞死亡蛋白配体1 （PD-L1） 、 细胞毒性T淋巴细胞抗原4 （CTLA-4） 和程序性细胞 死亡蛋白1 （PD-1） 的免疫检查点抑制剂药物 （ICIs） 在肿瘤临床治疗中取得了突破性进展， 它们通过阻断相关免疫。

6、检查点， 激活肿瘤特异性T细胞对肿瘤的免疫应答效应， 从而达到抗 肿瘤的作用。 0004 肿瘤突变负荷 （Tumor Mutation Burden， TMB） 是指每百万碱基中被检测出的， 体 细胞基因编码错误、 碱基替换、 基因插入或缺失错误的总数。 TMB不仅代表基因组的不稳定 性， 也标志着多种肿瘤类型对免疫治疗的反应。 高度突变的基因具有产生新抗原的潜力， 它 们可以提高免疫治疗的免疫原性反应， 因此TMB越高， 最后能够被T细胞识别的新抗原产生 也越多， 免疫治疗效果越好。 0005 近年来， 免疫治疗已经成功地在包括CRC在内的几种癌症中实现了持久的疗效， 存 在错配修复缺陷 （。

7、dMMR） 或高微卫星不稳定性 （MSI-H） 的转移性结直肠癌 （mCRC） 患者， 可以 接受免疫治疗。 重要的是， 大约15%的CRC患者和5%的转移性结直肠癌患者存在MSI-H， 其特 征是TMB升高。 0006 然而， MSI-H结直肠癌患者对PD-1抑制剂的应答率各不相同。 有研究注意到TMB与 ICIs治疗反应间存在显著的相关性， 但与MSI状态以及PD-L1的表达情况无关。 由于MSI-H结 直肠癌患者对免疫治疗的反应存在差异性， 在对其应用PD-1抑制前应慎重评估并测算患者 的TMB水平。 0007 肿瘤突变负荷 （TMB） 是通过二代测序计算肿瘤组织标本中体细胞突变的数量来。

8、进 行测定的， TMB检测需要通过手术和常规活检获取的组织标本进行检测， 检测费用高昂， 因 此限制了其推广应用。 miRNA是一类在人体内广泛分布的短的内源性非编码RNA， 长度为18- 25个核苷酸， 它们通过与3非翻译区 （3UTR） 的碱基修复结合， 在转录后水平上调节靶基因 的表达， 从而增强了抑制翻译或信使RNA裂解。 miRNA是抗癌免疫反应的关键调节因子， 部分 miRNA的表达水平与患者的肿瘤突变负荷水平具有良好的相关性， 而且miRNA检测流程简单 且费用相对较低， 因此， 我们希望能够开发一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的 miRNA标志物， 通过检测该生物标记物来。

9、推断患者的肿瘤突变负荷水平， 进而可在免疫治疗 过程中指导医生应用PD-1抑制剂。 说明书 1/4 页 3 CN 111534598 A 3 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物 及应用， 我们通过下载来自TCGA和Genomic Data Commons Data Portal数据库的数据集， 并运用生物信息学方法进行分析， 挖掘出与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA 标志物， 然后釆用结直肠癌患者的肿瘤组织标本进行验证， 由此获得基于此miRNA标志物的 分类器在推断结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平的应用。 0009 本发明所。

10、采用的具体技术方案如下： 一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物， 所述miRNA标志物为miR- 625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p四种miRNA中的一种或多种。 0010 优选的， 所述miRNA标志物为miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p四种 miRNA的组合。 0011 所述miRNA标志物的应用为： 以miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p四 种miRNA的组合来构建miRNA分类器， 用于推断结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平。 001。

11、2 本发明提供了一种与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物， 该 miRNA标志物为miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p四种miRNA的一种或多种， 以此miRNA标志物来构建miRNA分类器， 通过常规活检获取患者少量的肿瘤组织， 以此miRNA 分类器对肿瘤组织进行检测， 根据miRNA标志物与肿瘤突变负荷的相关性， 即可推断结直肠 癌患者肿瘤突变负荷水平， 进而在免疫治疗过程中指导医生应用PD-1抑制剂。 和直接检测 直肠癌患者的肿瘤突变负荷水平相比， 通过此miRNA标志物来间接推断直肠癌患者的肿瘤 突变负荷水平的应用更简单。

12、， 不需要支付高额的检测费用， 因此更利用推广应用。 附图说明 0013 图1为27例结直肠癌患者肿瘤组织及正常粘膜样品中四种miRNA的相对表达水平， 图中* P 0.05， * P 0.01， * P 0.001 ， * P0.0001。 0014 图2为TMB-H与TMB-L结直肠癌患者肿瘤组织中miRNA的相对表达水平 （9例TMB-H和 18例TMB-L） ， 图中* P 0.05， * P 0.01， * P 0.001 ， * P0.0001。 0015 图3为四种miRNA的组合的ROC曲线分析 （TCGA数据库数据） 。 0016 图4为四种miRNA的组合的ROC曲线分析 。

13、（27名结直肠癌患者数据） 。 具体实施方式 0017 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。 需要说明的是， 下 述实施方案中所述的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法， 所述的试剂和材料， 如无特 殊说明， 均可从商业途径获得。 0018 一、 与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物的生物信息学分析和 筛选。 0019 下载来自TCGA和Genomic Data Commons Data Portal数据库的数据集， 并建立训 练集及验证集， 比较分析高TMB （TMB-H） 和低TMB （TMB-L） 结直肠癌标本中miRNA的表达差异 情况。 使用套索。

14、算法 （Least Absolute Shrinkage and Selection Operator， LASSO） 和主 成分分析 （Principal Component Analysis， PCA） 从训练集中筛选出以miR-625-3p、 miR- 说明书 2/4 页 4 CN 111534598 A 4 552-5p、 miR-592和miR-224-5p为基础的分类器用于推断CRC患者的肿瘤突变负荷水平。 0020 按照已经发表论文的计算方法， TMB通过按编码区域的大小计算每个肿瘤患者体 突变的数量。 其中包括编码基替换以及每个兆基 （Mb） 被检查序列的插入情况。 排除国家生。

15、 物技术信息中心的单核苷酸多态性数据库 （dbSNP） 的驱动因素突变和生殖系突变。 1.25 Mb 作为TMB编码区域大小。 使用 LASSO 方法， 我们选择了已确定具有非零回归系数的 miRNA。 这些被认为是最佳的miRNA建立基于miRNA的签名分类器的预测TMB。 然后， 我们使用从 LASSO 分析到所选 miRNA 权重表达式值的回归系数为每个样本生成分类器索引。 我们使 用公式： index=miR-592*(-0.2271092)+miR-625-3p*(0.2636113)+miR-552-5p*(-0.1849247) +miR-224-5p*(-0.101137) 计。

16、算了总集中所有样本的分类器索引值， 以及分类器索引值与 TMB 以及三个免疫检 查点的关联。 我们发现， 基于四miRNA的分类器指数值与TMB值 （Pearson R = 0.42，P = 2.2 x 10-16） 高度相关， 与PD-L1表达值 （Pearson R = 0.48，P = 2.2 x 10-16） 和PD-1表达值 （Pearson R = 0.42，P = 2.2 x 10-16）的相关性非常低； 与 CTLA-4表达值没有相关性 （Pearson R = 0.27，P =1.3 x 10-7） 。 根据 starBase， PD-1、 PD-L1 和 CTLA-4 不是。

17、四种 miRNA 的靶标基因。 TMB 水平与 MSI 呈弱正相关 （相关系数 = 0.177，P =0.001） 。 基于4- miRNA的分类器倾向于与TMB水平呈中度正相关 （Pearson相关性= 0.429，P=0.001） 。 0021 如图3所示， ROC曲线分析提示， 本发明的四种miRNA的组合在训练集中的准确度为 0.963； 在测试集中的准确度为0.902； 在所有样本中的准确度为0.946， 显示其区分TMB-H 结直肠癌患者与TMB-L结直肠癌患者的准确性。 与正常组织相比， 肿瘤组织中miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5。

18、p显著上调。 值得注意的是， TMB-H结直肠癌患者中miR- 625-3p和miR-552-5p的表达水平显著高于TMB-L结直肠癌患者； TMB-L结直肠癌患者miR- 592和miR-224-5p的表达水平显著高于TMB-H结直肠癌患者。 此外， 在区分TMB-H与TMB-L结 直肠癌患者时， 由miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p构成的组合具有比任何 单个miRNA具有更高的区分价值。 0022 由此可见， 以miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p构成的组合为基础 的miRNA分类器可用于推断。

19、CRC患者的肿瘤突变负荷水平。 0023 二、 使用独立的验证集对上述结果进行内部验证。 0024 将27例结直肠癌患者的肿瘤组织标本进行二代测序 （Next generation sequencing， NGS） ， 测算独立肿瘤标本的真实肿瘤突变负荷值。 运用实时聚合酶链反应 （Real-time polymerase chain reaction， RT-PCR） 和ROC曲线 （Receiver operating characteristic curve） 验证基于miRNA的分类器推断CRC患者肿瘤突变负荷水平的效能。 具体实施步骤如下： 1、 患者肿瘤组织标本收集 收集于2018。

20、年4月至2019年8月期间在医院就诊的27例结直肠癌患者的活检肿瘤组织 标本， 其中患者中位年龄为53.5岁(波动范围为34-93岁)。 男性15例， 女性12例； 左半结肠10 例， 右半结肠8例， 直肠9例； 临床分期为I+II的有12例， 临床分期III+IV的有15例； 无远处转 移患者22例， 有远处转移患者5例。 通过UICC和AJCC进行临床分期评估。 0025 对患者肿瘤组织进行活检取样时， 首先对大体标本进行观察， 确认肿瘤的部位与 说明书 3/4 页 5 CN 111534598 A 5 范围， 注意与周围正常组织及坏死组织鉴别。 在标本离体后最短时间内使用组织剪和镊子 切。

21、取标本 （30min） ， 将癌组织切取成多块直径为0.5 cm左右的组织块， 分别装入已编号的 灭菌冻存管中， 迅速放入液氮转移罐进行转移。 尽快将液氮转移罐中的冻存管转移入标本 盒中， 标本盒长期存放在-80超低温冰箱中保存。 0026 对27例结直肠癌患者的活检肿瘤组织标本进行二代测序， 测算出肿瘤标本的真实 肿瘤突变负荷值， 结果显示， 27例肿瘤组织标本中有9例为TMB-H水平， 18例为TMB-L水平。 0027 2、 RNA提取 根据制造商的说明， 取200mg肿瘤组织标本浸入RNAlater(RNA稳定试剂中， 之后应用 Trizol试剂(TrizolReagent， Invi。

22、trogen公司)按照其操作说明提取总RNA并用总RNA纯化 试剂盒使用(RNeasy Mini kit， Qiagen公司)按其操作说明进行纯化。 NanoDrop 2000分光 光度计 （Thermo Fisher Scientific， 沃尔瑟姆， 马萨诸塞州， 美国） 用于测量总RNA的浓度 和纯化。 RNA储存在-80 C下， 用于随后的qPCR分析。 0028 3、 RT-PCR验证 取U6作为内参， 根据制造商的说明， 使用miScript II RT试剂盒 （Qiagen， Hilden， 德 国） 将总RNA反转录为cDNA。 根据生产商的说明， 使用带有miScript S。

23、YBR Green PCR试剂盒 （Qiagen） 的Agilent Mx3000 qPCR系统分析RT产物。 每个样品进行三次重复分析。 0029 引物序列如下： 适用于hsa-miR-625-3p的CGGACTATAGAACTTTCCCCCTCA； 适用于hsa-miR-552-5p 的CGGTTTAACCTTTTGCCTGTTGG； 适用于hsa-miR-592的CGCTTGTGTCAATATGCGATGATGT； 适用于hsa-miR-224-5p 的GTCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAG。 0030 qPCR引物由Tiangen Biotech （北京） 设计和生产。 。

24、所有的PCR反应均在Agilent Mx3000系统上进行， 并通过2- Ct方法计算miRNA的相对表达水平。 0031 为确定结直肠癌患者组织中miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR-592和miR-224-5p的在 表达水平是否发生改变， 我们采用了qRT-PCR来评估肿瘤组织和正常粘膜中四种miRNA的表 达水平， 如图1所示， 统计分析表明： 与正常粘膜相比， CRC肿瘤组织中的miR-625-3p、 miR- 552-5p、 miR-592和miR-224-5p表达均升高。 此后， 我们比较了TMB-H结直肠癌患者与TMB-L 结直肠癌患者之间组织四种miRNA的表。

25、达水平， 如图2所示， 统计结果提示， TMB-H结直肠癌 患者中miR-625-3p和miR-552-5p的表达水平显著高于TMB-L结直肠癌患者； TMB-L结直肠癌 患者miR-592和miR-224-5p的表达水平显著高于TMB-H结直肠癌患者。 0032 4、 ROC曲线验证 我们运用ROC曲线验证四种miRNA的表达水平在推断结直肠癌患者TMB水平中的效能， 如图4所示， 受体工作特征 （ROC） 曲线结果提示， 肿瘤组织中miR-625-3p、 miR-552-5p、 miR- 592和miR-224-5p对直肠癌患者TMB水平有良好的推断效能， AUC = 0.947 （95%。

26、CI： 0.871- 0.985） 。 0033 本具体实施方式仅仅是对本发明的解释， 并不是对本发明的限制， 在不背离权利 要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图 例。 说明书 4/4 页 6 CN 111534598 A 6 序列表 广西医科大学第一附属医院 与结直肠癌患者肿瘤突变负荷水平相关的miRNA标志物及应用 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 24 DNA/RNA Homo sapiens 1 cggactatag aactttcccc ctca 24 2 23 DNA/RNA Homo sapiens 2 cggtt。

27、taacc ttttgcctgt tgg 23 3 25 DNA/RNA Homo sapiens 3 cgcttgtgtc aatatgcgat gatgt 25 4 26 DNA/RNA Homo sapiens 4 gtcaagtcac tagtggttcc gtttag 26 序列表 1/1 页 7 CN 111534598 A 7 图 1 说明书附图 1/4 页 8 CN 111534598 A 8 图 2 说明书附图 2/4 页 9 CN 111534598 A 9 图 3 说明书附图 3/4 页 10 CN 111534598 A 10 图 4 说明书附图 4/4 页 11 CN 111534598 A 11 。