慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010377069.1 (22)申请日 2020.05.07 (71)申请人 南京实践医学检验有限公司 地址 210000 江苏省南京市江北新区新锦 湖路3-1中丹生命科学园一期A栋813- 4室 (72)发明人 唐春花张鹏邢宽何志健 谢珍夏统前袁鸣何贵伦 安雪茹李平 (74)专利代理机构 南京瑞华腾知识产权代理事 务所(普通合伙) 32368 代理人 梁金娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) (54。

2、)发明名称 一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试 剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种慢性淋巴细胞白血病基 因突变检测试剂盒， 所述试剂盒用于检测以下基 因突变： BIRC3基因第2-9号外显子， BTK基因第15 号外显子， MYD88基因第5号外显子， NOTCH1基因 第26-28、 34号外显子， PLCG2基因第19-20、 24号 外显子， SF3B1基因第14-15号外显子， TP53基因 第5-9号外显子， WT1基因第7-10号外显子； 所述 试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系， PCR扩增体 系包括PCR扩增引物， 测序体系包括测序引物。 本 发明还提供了一种慢性淋巴。

3、细胞白血病基因突 变检测方法。 本发明的试剂盒及检测方法高效快 速且易于操作， 并且经济、 简便， 具有广泛的临床 应用价值。 权利要求书4页 说明书19页 序列表15页 附图1页 CN 111549132 A 2020.08.18 CN 111549132 A 1.一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 所述试剂盒用于检测以下基因突 变： BIRC3基因第2-9号外显子， BTK基因第15号外显子， MYD88基因第5号外显子， NOTCH1基因 第26-28、 34号外显子， PLCG2基因第19-20、 24号外显子， SF3B1基因第14-15号外显子， TP53 基因第5-9号外。

4、显子， WT1基因第7-10号外显子； 所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系， 所述PCR扩增体系至少包括以下引物序列： 权利要求书 1/4 页 2 CN 111549132 A 2 所述测序体系至少包括以下引物序列： 权利要求书 2/4 页 3 CN 111549132 A 3 2.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 其中， 所述PCR扩 增体系还包括2TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1及RNase-Free ddH2O， 用于扩 增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及WT1基因， 且。

5、各物质含量为： 2TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1 10 l， PCR引物工作液2 l， RNase-Free ddH2O 6 l。 3.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 其中， 所述PCR扩 增体系还包括2GC buffer I， dNTPs， TaKaRa LA Taq酶及RNase-Free ddH2O， 用于扩增 NOTCH1基因， 且各物质含量为： 2GC buffer I 10 l， PCR引物工作液2 l， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， RNase-Free ddH2O 4.。

6、2 l。 4.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 其中， 所述测序体 系还包括mix， 且各物质含量为：mix 3 l， 测序引物工作液1 l。 5.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 其中， 所述试剂盒 还包括阳性对照， 所述阳性对照为含有上述CLL 8种基因热点突变类型质粒的混合液。 权利要求书 3/4 页 4 CN 111549132 A 4 6.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 其中， 所述试剂盒 还包括阴性对照， 所述阴性对照是体积为4.2 l的RNase-Free ddH2O。 7.一种慢性淋巴细胞白血病基因。

7、突变的检测方法， 所述的方法包括以下步骤： (1)DNA提取： 获取待测样品的DNA， DNA的提取采用The Blood DNA Kit， 购于 北京全式金生物技术有限公司， 检测DNA的浓度和完整性， 将提取的DNA稀释， 使得其浓度在 10ng/ul以上； (2)PCR扩增： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(1)中获取的DNA为模板， 进行PCR扩增， 并收集扩增产物； PCR扩增体系分为两种， 一种用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及WT1基 因， 具体的各个物质及含量为： 2TransTaq High Fidelity PCR Su。

8、permix1 10 l， PCR引 物工作液2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 6 l， 使得体系总体积为20 l； 另一种用 于扩增NOTCH1基因， 具体的各个物质及含量为： 2GC buffer I 10 l， PCR引物工作液2 l， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 4.2 l， 使得体 系总体积为20 l； PCR的反应条件为： 预变性952min， 再进行9530s， 5830s， 7260s共35个循环， 72 10min， 4暂存， 得PCR扩增产物；。

9、 (3)PCR扩增产物的检测： 利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性， 然后对PCR 扩增产物进行消化反应， 向PCR扩增产物中加入1.2 l的消化液(外切酶： 虾碱酶1:1)； 消化反应条件为： 37， 60min； 80， 15min， 4暂存， 得消化产物； (4)消化产物的测序： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(3)中获取的消化产物为模板， 进行一代测序； 一代测序体系为：mix 3 l、 消化产物1 l、 测序引物1 l； 测序反应条件为： 预变性952min， 再进行9520s， 6015s， 7260s共25个循环， 72 5min； (5)测序结果分析。 8.根据权利。

10、要求7所述的检测方法， 其中， 所述步骤(1)中所述DNA的浓度通过NANO300 检测， 其中合格样本DNA的A260/A280值在1.82.0之间； 所述DNA的完整性通过采用琼脂糖 凝胶电泳检测。 9.根据权利要求7所述的检测方法， 其中， 所述步骤(3)中所述琼脂糖凝胶电泳过程为： 配制一定体积的1.5的琼脂糖凝胶， 取2 l 3x loading buffer与4 L PCR产物混匀， 1x的 EDTA缓冲液中用移液器点胶上样， 进行电泳(电压140V， 时间35min)， 琼脂糖凝胶电泳电泳 结束后使用天能成像系统观察， 电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为扩增成功。 10。

11、.根据权利要求7所述的检测方法， 其中， 所述步骤(5)中利用Variant Reporter软 件， 并导入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。 权利要求书 4/4 页 5 CN 111549132 A 5 一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法 技术领域 0001 本发明涉及基因突变检测技术领域， 特别是涉及一种慢性淋巴细胞白血病基因突 变检测试剂盒及方法。 背景技术 0002 白血病是由于造血干或前体细胞基因异常， 导致细胞增殖、 分化或凋亡异常， 是一 类具有高度异质性的恶性血疾病。 血液病的治疗现在已经进入到一个精准治疗时代了， 通 过检测基因的变异状态对疾病进行。

12、鉴别诊断、 预后分层、 靶向治疗， 已经成为一个共识， 目 前专家的共识是应采用MICM的整合诊断方法， 也就是联合形态学、 免疫学、 细胞遗传学、 分 子生物学来诊断与分型， 以达到更全面准确的诊断、 指导精确治疗的目的。 一些恶性血液病 的基因突变包括点突变、 插入/缺失、 拷贝数变异等。 0003 慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种进展缓慢的B淋巴细胞增殖性肿瘤。 患者体内出 现了过多异常淋巴细胞， 聚集在骨髓、 外周血、 淋巴组织及身体其他器官， 进而影响到这些 器官的功能。 一旦CLL诊断明确， 首先应判断是否需要治疗。 一般来说， 1/3患者无需治疗， 1/ 3患者需要即刻治疗， 。

13、另外1/3患者诊断时无需治疗、 但随着病情进展后续需要治疗。 对于 CLL患者来说， 其病程中治疗的起始点也是重要的转折点， 既不应该太早开始， 也不应该过 度等待， 选择适当的时间点开始治疗， 同时选择适当的治疗方法至关重要。 2018年的 中国 慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南 中指出基因突变检测TP53、 NOTCH1(含非编码区)、 SF3B1、 BIRC3等基因， 其中del(17p)和(或)TP53基因突变的患者预后 最差， TP53基因缺失或突变已经纳入了CLL患者危险分层中。 2020v4版NCCN指南提出， 无论 TP53是否缺失和/或突变， 患者的体能状。

14、态如何， 都优先推荐靶向药物一线治疗CLL患者， 对 于在某些极高危的年轻慢淋患者可能需要在前期治疗获得疗效后进行异基因造血干细胞 移植做根治性的治疗以提高生存率。 0004 目前， 分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序(Sanger)、 高通量测序 技术(NGS)、 实时荧光PCR(RQ-PCR)、 数字PCR等， 高通量测序技术(NGS)检测低通量的高昂成 本让很多患者望而却步； 实时荧光PCR(RQ-PCR)及数字PCR仅仅针对已知的基因突变设计引 物探针进行检测。 而一代测序具有高准确性、 简单、 快捷、 测序读长长的优势可以真正满足 临床诊断检测的需求。 0005 本发明专利。

15、中基于2016WHO、 NCCN指南、 ELN指南以及文献报道， 专门开发CLL密切 相关的8种基因进行检测， 具有明确临床意义的8种基因按功能分类， 可以分为信号传导通 路的基因， 如BIRC3、 BTK、 MYD88、 PLCG2； 抑癌基因， 如TP53、 WT1； RNA剪切复合体， 如SF3B1。 近 年来越来越多与CLL相关基因研究报道， 以上8个基因已成为CLL中的热点基因， 因此进行系 统性的检测有助于CLL血液肿瘤微小残留病灶(MRD)监测和预后治疗指导。 0006 根据查阅以上指南及权威数据库中的文献来选取每种套餐里面需要检测的基因 及检测区域， 所选取的基因都是在CLL中。

16、具体明确临床意义的。 再根据GenBank数据库中的 基因序列， 根据目标区域设计特异性的PCR引物及测序引物， 将合成好的特异性PCR引物稀 说明书 1/19 页 6 CN 111549132 A 6 释分别稀释至工作液5pmol/ul， 测序引物稀释分别稀释至工作液3.2pmol/ul， 并进行大量 样本的实验验证及优化， 利用该技术对血液肿瘤相关基因的突变检测在临床上已经得到越 来越广泛的应用。 发明内容 0007 本发明的主要目的在于， 克服现有的技术中存在的缺陷， 提供一种慢性淋巴细胞 白血病基因的突变检测试剂盒及方法。 本发明的试剂盒和检测方法高效快速且易于操作。 0008 本发明。

17、是基于GenBank数据库设计了用于检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)8种基因 多个外显子的引物序列。 0009 本发明所涉及的慢性淋巴细胞白血病(CLL)相关的8种基因及其经典转录本如下： BIRC3(NM_001165.4)、 BTK(NM_000061.2)、 MYD88(NM_002468.4)、 NOTCH1(NM_017617.3)、 PLCG2(NM_002261)、 SF3B1(NM_012433.2)、 TP53(NM_000546.5)、 WT1(NM_024426.4)。 所设计 的PCR引物及测序引物Tm值基本在602， 对所合成的引物母液进行稀释优化， 保证引物 的特异。

18、性以实现目标区域的扩增， 并降低非目标片段的比例。 0010 本发明所设计的与慢性淋巴细胞白血病(CLL)相关的8种基因外显子相关的PCR引 物及测序引物， 主要是针对已知致病基因的突变位点进行扩增测序， 将重点关注以下目标 区域(扩增子)整理如下： 0011 0012 本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。 0013 本发明提供了一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 所述试剂盒用于检 测以下基因突变： BIRC3基因第2-9号外显子， BTK基因第15号外显子， MYD88基因第5号外显 子， NOTCH1基因第26-28、 34号外显子， PLCG2基因第19-20。

19、、 24号外显子， SF3B1基因第14-15 号外显子， TP53基因第5-9号外显子， WT1基因第7-10号外显子； 0014 所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系， 所述PCR扩增体系至少包括以下引物序 列： 说明书 2/19 页 7 CN 111549132 A 7 0015 0016 说明书 3/19 页 8 CN 111549132 A 8 0017 所述测序体系至少包括以下引物序列： 0018 0019 说明书 4/19 页 9 CN 111549132 A 9 0020 0021 在本发明的一些实施方案中， 所述PCR扩增体系还包括2TransTaq High Fideli。

20、tyPCR Supermix 1及RNase-Free ddH2O， 用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及WT1基因， 且各物质含量为： 2TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1 10 l， PCR引物工作液2 l， RNase-Free ddH2O 6 l。 0022 在本发明的一些实施方案中， 所述PCR扩增体系还包括2GC buffer I， dNTPs， TaKaRa LA Taq酶及RNase-Free ddH2O， 用于扩增NOTCH1基因， 且各物质含量为： 2GC buffer I 10 l，。

21、 PCR引物工作液2 l， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， RNase-Free ddH2O 4.2 l。 0023在本发明的一些实施方案中， 所述测序体系还包括Bigdye且各物质含量 为： Bigdye3 l， 测序引物工作液1 l。 0024 在本发明的一些实施方案中， 所述试剂盒还包括阳性对照， 所述阳性对照为含有 上述CLL 8种基因热点突变类型质粒的混合液。 0025 在本发明的一些实施方案中， 所述试剂盒还包括阴性对照， 所述阴性对照是体积 为4.2 l的RNase-Free ddH2O。 0026 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术。

22、方案来实现。 0027 本发明还提供了一种慢性淋巴细胞白血病基因突变的检测方法， 所述的方法包括 以下步骤： 0028(1)DNA提取： 获取待测样品的DNA， DNA的提取采用TheBlood DNAKit， 购于北京全式金生物技术有限公司， 检测DNA的浓度和完整性， 将提取的DNA稀释， 使得其浓 度在10ng/ul以上； 0029 (2)PCR扩增： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(1)中获取的DNA为模板， 进行PCR 扩增， 并收集扩增产物； 0030 PCR扩增体系分为两种， 一种用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及 WT1基因。

23、， 具体的各个物质及含量为： 2TransTaq High Fidelity PCR Supermix1 10 l， PCR引物工作液2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 6 l， 使得体系总体积为20 l； 另一 种用于扩增NOTCH1基因， 具体的各个物质及含量为： 2GC buffer I10 l， PCR引物工作液2 l， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 4.2 l， 使得 体系总体积为20 l； 0031 PCR的反应条件为： 预变性952min， 再进行953。

24、0s， 5830s， 7260s共35个循 环， 7210min， 4暂存， 得PCR扩增产物； 0032 (3)PCR扩增产物的检测： 利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性， 然后对 PCR扩增产物进行消化反应， 向PCR扩增产物中加入1.2 l的消化液(外切酶： 虾碱酶1:1)； 0033 消化反应条件为： 37， 60min； 80， 15min， 4暂存， 得消化产物； 说明书 5/19 页 10 CN 111549132 A 10 0034 (4)消化产物的测序： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(3)中获取的消化产物为 模板， 进行一代测序； 0035一代测序体系为： Bi。

25、gdye3 l、 消化产物1 l、 测序引物1 l； 0036 测序反应条件为： 预变性952min， 再进行9520s， 6015s， 7260s共25个循 环， 725min； 0037 (5)测序结果分析。 0038 在本发明的一些实施方案中， 所述步骤(1)中所述DNA的浓度通过NANO300检测， 其 中合格样本DNA的A260/A280值在1.82.0之间； 所述DNA的完整性通过采用琼脂糖凝胶电 泳检测。 0039 在本发明的一些实施方案中， 所述步骤(3)中所述琼脂糖凝胶电泳过程为： 配制一 定体积的1.5的琼脂糖凝胶， 取2 l 3x loading buffer与4 L P。

26、CR产物混匀， 1x的EDTA缓 冲液中用移液器点胶上样， 进行电泳(电压140V， 时间35min)， 琼脂糖凝胶电泳电泳结束后 使用天能成像系统观察， 电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为扩增成功。 0040 在本发明的一些实施方案中， 所述步骤(5)中利用Variant Reporter软件， 并导入 该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。 0041 借由上述技术方案， 本发明的试剂盒及检测方法至少具有下列优点： 0042 (1)本发明提供了一种基于一代测序技术的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试 剂盒， 该试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系， 能够同时对样本DNA进行扩。

27、增和测序。 本发明 的试剂盒能够高效快速的对慢性淋巴细胞白血病(CLL)中具有明确临床意义的8种基因突 变BIRC3、 BTK、 MYD88、 NOTCH1、 PLCG2、 SF3B1、 TP53、 WT1进行检测， 并且操作简单。 0043 (2)从时间及经济角度而言， 作为基因突变检测金标准的一代测序技术在一天内 从实验操作到结果的解读， 对于通量不高的基因检测， 运用此方法更加经济实惠， 总而言 之， 运用一代测序技术检测慢性淋巴细胞白血病中8种基因突变(点突变、 插入/缺失)更经 济、 快速、 简便， 因此本发明具有广泛的临床应用价值。 0044 (3)本发明试剂盒进行一代测序操作流程。

28、的时， 会同时做Nuclease-Free Water的 阴性对照及阳性对照， 监测实验过程不被污染， 试剂盒所包含试剂组分可对基因突变定性 检测， 确保数据结果的准确可靠。 0045 上述说明仅是本发明技术方案的概述， 为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施， 以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 0046 本发明的具体实施方式及其结果分析由以下实施例及其附图详细给出。 附图说明 0047 参照附图， 本发明的公开内容将变得更易理解。 本领域技术人员容易理解的是： 这 些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案， 而并非意在对本发明的保护范围构成限制。 图。

29、中： 0048 图1示出了本发明的一代测序检测流程； 0049 图2示出了本发明的MYD88基因突变位点一代测序验证峰图， 具体的基因位点为： MYD88 c.794TC； p.L265P(杂合)； 0050 图3示出了本发明中TP53基因突变位点一代测序验证峰图， 具体的基因位点为： 说明书 6/19 页 11 CN 111549132 A 11 TP53 c.856GA； p.E286K(杂合)。 具体实施方式 0051 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效， 以下结合 附图及较佳实施例， 对本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施方案 仅仅用以。

30、解释本发明， 并不限制本发明。 0052 本发明的实施例提供了慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 所述试剂盒用 于检测以下基因突变： BIRC3基因第2-9号外显子， BTK基因第15号外显子， MYD88基因第5号 外显子， NOTCH1基因第26-28、 34号外显子， PLCG2基因第19-20、 24号外显子， SF3B1基因第 14-15号外显子， TP53基因第5-9号外显子， WT1基因第7-10号外显子； 0053 所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系， 所述PCR扩增体系至少包括以下引物序 列： 0054 说明书 7/19 页 12 CN 111549132 A 12 。

31、0055 0056 所述测序体系至少包括以下引物序列： 0057 说明书 8/19 页 13 CN 111549132 A 13 0058 说明书 9/19 页 14 CN 111549132 A 14 0059 0060 具体地， 上述PCR扩增引物可与其他组分构成PCR反应体系， 也可自身包含有PCR反 应所必须的组分以进行PCR扩增程序。 在上述PCR扩增引物各自单独作为PCR反应体系时， 该 体系中除了各自包含其对应的引物序列之外， 还包含2TransTaq High FidelityPCR Supermix 1及RNase-Free ddH2O， 用于扩增BIRC3， BTK， MY。

32、D88， PLCG2， SF3B1， TP53以及WT1 基因， 且各物质含量为： 2TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1 10 l， PCR引物工作 液2 l， 并可通过加RNase-Free ddH2O补充体积。 该PCR引物工作液是正向引物和反向引物 的混合工作液， 其中， PCR正向引物和反向引物比例为1:1。 0061 或者， 还包含2GC buffer I， dNTPs， TaKaRa LA Taq酶及RNase-Free ddH2O， 用 于扩增NOTCH1基因， 且各物质含量为： 2GC buffer I 10 l， PCR引物工作液2 l。

33、， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， 并可通过加RNase-Free ddH2O补充体积。 该PCR引物工作液 是正向引物和反向引物的混合工作液， 其中， PCR正向引物和反向引物比例为1:1。 0062 具体地， 上述试剂盒的测序引物可与其他组分构成一代测序反应体系， 也可自身 包含有测序反应所必须的组分以进行测序过程。 在上述测序引物各自单独作为测序体系 时， 该体系中除了各自包含其对应的引物序列之外， 还包含Bigdye且各物质含量为： Bigdye3 l， 测序引物工作液1 l。 测序引物中的正向和反向是分开的， 每个测序反应 里面只有1条测序引物。 。

34、0063 具体地， 上述基因外显子的全部PCR引物工作液浓度为5pmol/ul、 测序引物工作液 浓度为3.2pmol/ul。 0064 具体地， 上述试剂盒可添加空白对照， 组成为4.2 l RNase-Free ddH2O； 和阳性对 照， 组成为含有上述CLL 8种基因突变类型质粒的混合液， 用于试剂的质量控制。 0065 具体地， 上述PCR扩增引物和测序反应引物序列分别如表1和表2所示： 0066 表1用于PCR扩增程序中的引物序列 说明书 10/19 页 15 CN 111549132 A 15 0067 0068 说明书 11/19 页 16 CN 111549132 A 16 。

35、0069 表2用于一代测序程序中的引物序列 0070 0071 说明书 12/19 页 17 CN 111549132 A 17 0072 本发明的实施例提供的检测试剂盒特异性好， 灵敏度高， 检测周期短， 操作简便， 实现了对于样品的准确、 快速检测。 0073 本发明的实施例还提供一种慢性淋巴细胞白血病基因突变的检测方法， 所述的方 法包括以下步骤： 0074(1)DNA提取： 获取待测样品的DNA， DNA的提取采用The Blood DNAKit， 购于北京全式金生物技术有限公司， 通过NANO300质检确保DNA所测的OD值A260/A280值在 1.82.0之间， Qubit定量浓。

36、度达10ng/ul以上， 电泳条带无明显拖尾以确保DNA的完整性， 碎片化的样本会导致扩增失败影响实验结果， 故合格的样本质量是结果准确可靠的前提。 对提取的高浓度DNA样本进行适当的浓度稀释， 待测样本、 阳性对照样本浓度均在25-50ng/ ul左右。 0075 (2)PCR扩增： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(1)中获取的基因组DNA浓度稀释 至30ng/ul为模板， 进行PCR扩增， 并收集扩增产物； 0076 PCR扩增体系分为两种， 一种用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及 WT1基因， 具体的各个物质及含量为： 2TransT。

37、aq High Fidelity PCR Supermix1 10 l， PCR引物工作液2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 6 l， 使得体系总体积为20 l； 另一 种用于扩增NOTCH1基因， 具体的各个物质及含量为： 2GC buffer I10 l， PCR引物工作液2 l， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 4.2 l， 使得 体系总体积为20 l； 0077 PCR的反应条件为： 根据20 l扩增体系加样结束后， 在BIO-RAD T100 PCR仪上运行 。

38、程序： 预变性952min， 再进行9530s， 5830s， 7260s共35个循环， 7210min， 4暂 存， 得PCR扩增产物。 0078 (3)PCR扩增产物的检测： 利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性， 具体过 程为： 根据当次实验量配制一定体积的1.5的琼脂糖凝胶， 取2 l 3x loading buffer与4 L PCR产物混匀， 1x的EDTA缓冲液中用移液器点胶上样， 进行电泳(电压140V， 时间35min)， 琼脂糖凝胶电泳电泳结束后使用天能成像系统观察。 电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为 扩增成功； 然后对PCR扩增产物进行消化反应， 向P。

39、CR扩增产物中加入1.2 l的消化液(外切 酶： 虾碱酶1:1)； 0079 消化反应条件为： T100上进行程序： 37， 60min； 80， 15min， 4暂存， 得消化产 物。 0080 (4)消化产物的测序： 目的是引入测序Bigdye利用双脱氧链末端终止法原理进行 测序： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(3)中获取的消化产物为模板， 进行一代测序； 0081一代测序体系为： Bigdye3 l、 消化产物1 l、 测序引物1 l； 0082 测序反应条件为： 预变性952min， 再进行9520s， 6015s， 7260s共25个循 环， 725min； 对测序反应后的产物进。

40、行除目标单链核酸片段之外的杂质， 并上机ABI 3730XL。 0083 (5)测序结果分析-基因变异结果分析： 将峰图导入Variant Reporter软件， 并导 入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。 0084 以下通过具体实施例对本发明进行详细阐述。 0085 实施例1 说明书 13/19 页 18 CN 111549132 A 18 0086 实验所用器材包括： 购自北京全式金生物技术有限公司的血液DNA提取试剂盒、 2.5MmdNTP、 MgCl2、 琼脂糖、 2GC buffer I、 TaKaRa LA Taq、 2TransTaq High FidelityPC。

41、R Supermix 1、 Exonuclease I外切酶、 Alkaline Phosphatase(Shrimp)虾碱 酶、 测序Bigdye、 Bigdye Buffer。 0087 阴性对照为体积为4.2 l的RNase-Free ddH2O。 0088 阳性对照为含有上述CLL 8种基因热点突变类型质粒的混合液。 0089 制备慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒， 具体包括以下步骤： 0090 1.合成引物及探针序列 0091 合成PCR引物序列如上述表1所示， 将上述引物序列配制成浓度为5pmol/ul。 0092 合成测序引物序列如上述表2所示， 将上述引物序列配制成浓度为3。

42、.2pmol/ul。 0093 2.PCR反应体系的制备 0094 分别制备含有上述PCR引物和测序引物的基因突变检测反应体系， 各组分按照以 下表3-5所示进行配比： 0095 表3用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及WT1基因的反应体系 0096 0097 表4用于扩增NOTCH1基因的反应体系 0098 0099 表5用于测序反应体系 说明书 14/19 页 19 CN 111549132 A 19 0100 0101 实施例2 0102 用实施例1制备的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒对待测样品进行检 测。 0103 其中， 加入基。

43、因组DNA后的PCR扩增过程中具有如下组分含量， 见表6和7： 0104 表6用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及WT1基因的组分含量 0105 0106 表7用于扩增NOTCH1基因的组分含量 0107 0108 加入消化产物后的一代测序过程中具有如下组分含量， 见表8。 0109 表8测序体系中各组分含量 说明书 15/19 页 20 CN 111549132 A 20 0110 0111 本实施例中采集20例(编号C1C20)疑似、 初诊或复发的CLL骨髓血或外周血样本 并从中提取基因组DNA， 用实施例1中得到的基因突变检测试剂盒检测待。

44、测样品中是否存在 相应的基因突变， 具体操作步骤为： 0112 (1)样品基因组DNA的提取 0113使用DNA提取试剂盒(TheBlood DNA Kit， 购自北京全式金生物技术有 限公司)提取上述CLL骨髓血或外周血样本的基因组DNA。 通过NANO300质检确保DNA所测的 OD值A260/A280值在1.82.0之间， Qubit定量浓度达10ng/ul以上， 电泳条带无明显拖尾以 确保DNA的完整性， 碎片化的样本会导致扩增失败影响实验结果， 故合格的样本质量是结果 准确可靠的前提。 对提取的高浓度DNA样本进行适当的浓度稀释， 待测样本、 阳性对照样本 浓度均在25-50ng/u。

45、l左右。 0114 (2)PCR扩增： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(1)中获取的基因组DNA浓度稀释 至30ng/ul为模板， 进行PCR扩增， 并收集扩增产物； 0115 PCR扩增体系分为两种， 一种用于扩增BIRC3， BTK， MYD88， PLCG2， SF3B1， TP53以及 WT1基因， 具体的各个物质及含量为： 2TransTaq High Fidelity PCR Supermix1 10 l， PCR引物工作液2 l， 基因组DNA 2 l， RNase-Free ddH2O 6 l， 使得体系总体积为20 l； PCR 引物工作液是正向引物和反向引物的混合工作液，。

46、 PCR正向引物和反向引物比例为1:1； 0116 另一种用于扩增NOTCH1基因， 具体的各个物质及含量为： 2GC buffer I 10 l， PCR引物工作液2 l， dNTPs 1.6 l， TaKaRa LA Taq酶0.2 l， 基因组DNA 2 l， RNase- FreeddH2O 4.2 l， 使得体系总体积为20 l； PCR引物工作液是正向引物和反向引物的混合 工作液， PCR正向引物和反向引物比例为1:1； 0117 PCR的反应条件为： 根据20 l扩增体系加样结束后， 在BIO-RAD T100 PCR仪上运行 程序： 预变性952min， 再进行9530s， 5。

47、830s， 7260s共35个循环， 7210min， 4暂 存， 得PCR扩增产物。 0118 (3)PCR扩增产物的检测： 利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性， 具体过 程为： 根据当次实验量配制一定体积的1.5的琼脂糖凝胶， 取2 l 3x loading buffer与4 L PCR产物混匀， 1x的EDTA缓冲液中用移液器点胶上样， 进行电泳(电压140V， 时间35min)， 琼脂糖凝胶电泳电泳结束后使用天能成像系统观察。 电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为 扩增成功； 然后对PCR扩增产物进行消化反应， 向PCR扩增产物中加入1.2 l的消化液(外切 酶： 虾。

48、碱酶1:1)； 0119 消化反应条件为： T100上进行程序： 37， 60min； 80， 15min， 4暂存， 得消化产 物。 0120 (4)消化产物的测序： 目的是引入测序Bigdye利用双脱氧链末端终止法原理进行 测序： 采用本发明所述的试剂盒， 以步骤(3)中获取的消化产物为模板， 进行一代测序； 说明书 16/19 页 21 CN 111549132 A 21 0121一代测序体系为： Bigdye3 l、 消化产物1 l、 测序引物1 l； 0122 测序反应条件为： 预变性952min， 再进行9520s， 6015s， 7260s共25个循 环， 725min； 对测序。

49、反应后的产物进行除目标单链核酸片段之外的杂质， 并上机ABI 3730XL。 0123 (5)测序结果分析-基因变异结果分析： 将峰图导入Variant Reporter软件， 并导 入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。 0124 具体的检测结果如表9和表10所示： 0125 表9.编号C1C10的患者一代测序的PCR检测方法结果汇总表 0126 0127 0128 表10编号C11C20的患者一代测序的PCR检测方法结果汇总表 说明书 17/19 页 22 CN 111549132 A 22 0129 0130 对20例(编号C1C20)初诊、 难治或复发的慢性淋巴细胞白血患者。

50、用金标准测序 技术检测8个基因目标区域， 经过COSMIC数据库、 ClinVar数据库、 NCCN指南及血液肿瘤国内 专家共识等查询各基因突变位点总结如表11所示： 0131 表11各基因突变位点总结汇总 0132 说明书 18/19 页 23 CN 111549132 A 23 0133 0134 综上结果可以看出， 从时间及经济角度而言， 作为基因突变检测金标准的一代测 序技术在一天内从实验操作到结果的解读， 对于通量不高的基因检测， 运用此方法更加经 济实惠， 总而言之， 运用一代测序技术检测慢性淋巴细胞白血病中8种基因突变(点突变、 插 入/缺失)更经济、 快速、 简便， 因此本发明。