促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010178402.6 (22)申请日 2020.03.14 (71)申请人 天津大学青岛海洋技术研究院 地址 266200 山东省青岛市鳌山卫街道青 岛蓝色硅谷核心区莱青路2-2号 (72)发明人 宋浩杨绍梅张国银蔡志刚 (74)专利代理机构 北京开林佰兴专利代理事务 所(普通合伙) 11692 代理人 刘帅帅 (51)Int.Cl. C12N 15/31(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 7/66(2006.01) C12R 1/125(。

2、2006.01) (54)发明名称 促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌 及其基因修饰方法 (57)摘要 本发明公开了一种促进枯草芽孢杆菌合成 甲萘醌-7的基因修饰方法， 包括下列步骤：（一） 出发菌株BSMK_9的构建；（二） 过表达透明颤菌血 红蛋白基因vgb。 本发明以来源于枯草芽孢杆菌 168的BSMK_9为出发菌株， 通过过表达透明颤菌 血红蛋白， 促进细胞胞内氧的传输和提高氧的利 用效率， 考察其对MK-7合成的影响； 并通过优化 碳源组合及上罐发酵， 促进MK-7的最大合成量， 为将来遗传改造及发酵优化纳豆芽孢杆菌构建 MK-7高产菌株提供理论依据。 权利要求书2页 说明书10。

3、页 序列表9页 附图1页 CN 111560383 A 2020.08.21 CN 111560383 A 1.透明颤菌血红蛋白对提供微生物表达甲萘醌-7方面的应用。 2.含有透明颤菌血红蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌。 3.一种提高分泌甲萘醌-7的重组枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 含有透明颤菌血红蛋白 基因。 4.促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法， 其特征在于， 包括下列步骤： (一)出发菌株BSMK_9的构建 (1)在B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因 首先以B.subtilis 168的染色体为模板， 分别用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA。

4、-U2q， yxlA-menA-1q/yxlA-menA-2， yxlA-menA-D1q/yxlA-menA-D2， yxlA-menA-G1q/yxlA-menA- G2扩增片段U(1115bp)、 A(1057bp)、 D(1053bp)、 G(806bp)； 以质粒pUC57-1.8k-P1为模板， 用 引物yxlA-menA-P1/yxlA-menA-P2扩增含有启动子PlapS的片段P(442bp)； 以BS168NUm的染 色体为模板， 用引物yxlA-menA-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)； 然后通过重叠PCR方法， 利 用引物yxlA-menA-U1/yxlA。

5、-menA-2， 将片段U、 P和A拼接成片段UPA(2614bp)； 再利用引物 yxlA-menA-U1/yxlA-menA-D2将片段UPA和片段D拼接成片段UPAD(3667bp)； 最后利用引物 yxlA-menA-U1/yxlA-menA-G2将片段UPAD、 片段CR和片段G拼接成片段UPADCRG(6542bp)； 将 UPADCRG片段转化受体菌BS168NU的感受态细胞， 经过两步筛选， 最终获得menA基因在yxlA 位点整合的重组菌株MK3； 在B.subtilis染色体的yjoB位点过表达dxs基因、 在ydeO位点过 表达dxr基因、 在yqaL位点过表达yacM-。

6、yacN基因、 在pksJ位点过表达glpK基因、 在pksL位点 过表达glpD基因、 在iolI位点过表达aroG基因、 在iolE位点过表达pyrG基因、 在yqaQ位点过 表达hepS基因的方法类似于在yxlA位点过表达menA基因； (2)dhbB基因的敲除 以B.subtilis 168的染色体为模板， 分别用引物dhbB-U1/dhbB-U2、 dhbB-D1q/dhbB-D2 和dhbB-G1q/dhbB-G2扩增片段U(1003bp)、 D(815bp)和G(605bp)； 以BS168NUm的染色体为模 板， 用引物dhbB-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR。

7、)的片段CR(2069bp)； 首先通过重叠 PCR， 利用引物dhbB-U1/dhbB-D2， 将片段U和D拼接成UD(1818bp)； 然后利用引物dhbB-U1/ dhbB-G2， 通过重叠PCR方法， 将上述三个片段UD、 GR和G拼接成UDCRG(4492bp)； 将UDCRG片段 转化受体菌MK3-MEP123的感受态细胞， 最终筛选获得基因dhbB被敲除的重组菌株MK3- MEP123-dhbB； mgsA基因及araM基因的敲除类似于dhbB的敲除； 通过依次过表达上述10个 基因并敲除3个基因后最终获得重组菌株BSMK_9； (二)过表达透明颤菌血红蛋白基因vgb 首先以出发。

8、菌BSMK9的染色体为模板， 分别用引物cyd-vgb-U1/cyd-vgb-U2、 cyd-vgb- D1/cyd-vgb-D2和cyd-vgb-G1q/cyd-vgb-G2扩增片段U， 如SEQ ID No.11所示， 1149 bp； 扩 增片段D如SEQ ID No.12所示， 1028bp； 和扩增片段G， 如SEQ ID No.13所示， 1163bp； 以 BS168NUm的染色体为模板， 用引物cyd-vgb-CR1q/CR2扩增片段CR， 如SEQ ID No.14所示， 2069bp； 以质粒pUC57-Simple-VHb为模板， 用引物cyd-vgb-1/cyd-vgb。

9、-2扩增含有启动子 TP2表达盒及透明颤菌血红蛋白基因vgb的片段PV， 如SEQ ID No.15所示， 689bp； 然后通过 重叠PCR方法， 拼接成UPVDCRG， 6058bp； 用UPVDCRG片段转化受体菌BSMK_9的感受态细胞， 最 终筛选获得vgb基因在cyd位点整合的重组菌株BSMK_11； UPVDCRG片段序列如SEQ ID No.16 所示； 权利要求书 1/2 页 2 CN 111560383 A 2 PCR引物序列如下： Primer Number Sequence(53) cyd-vgb-U1 SEQ ID No.1 GTGACAGAACCGACAATAAG 。

10、cyd-vgb-U2 SEQ ID No.2 CCATCAACGCAACCATAAAC cyd-vgb-D1 SEQ ID No.3 CAGGAGCAGATTAGAGGAAA cyd-vgb-D2 SEQ ID No.4 TGGATGGTAGATGCGAATG cyd-vgb-G1q SEQ ID No.5 GCACGAAAACTGAATGAATAAGGAATCACAACCGATGAAA cyd-vgb-G2 SEQ ID No.6 CACACCGCCAAGTATAGAA cyd-vgb-CR1q SEQ ID No.7 ACATTCGCATCTACCATCCATCTTCAACTAAAGCAC。

11、CCAT CR2 SEQ ID No.8 TTATTCATTCAGTTTTCGTG cyd-vgb-1 SEQ ID No.9 GTTTATGGTTGCGTTGATGG cyd-vgb-2 SEQ ID No.10 TTTCCTCTAATCTGCTCCTG 。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111560383 A 3 促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法 技术领域： 0001 本发明涉及一种促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法及其重组菌， 属 于生物 基因工程领域。 背景技术： 0002 天然的脂溶性维生素K包括植物来源的维生素K1(又称叶绿醌， PK)和细菌来源。

12、的 维生 素K2(又称甲萘醌， MK)。 根据侧链中异戊二烯单元数量的不同， 共有14种甲萘醌， 记为 MK-n， 常见的有MK-4和MK-7等。 在原核生物中， MK-n参与呼吸链的电子传递。 对于人类和 其 他哺乳动物， 由于维生素K是血液和骨骼中特定蛋白的谷氨酸残基翻译转化为-羧基谷 氨酸(Gla)的重要辅因子， 因此用来维持钙稳态、 抑制血管壁钙化、 支持内皮完整性、 促进 骨矿化， 并参与组织更新和细胞生长控制。 常见的维生素K依赖性蛋白包括凝血因子(II、 VII、 IX、 X和凝血酶原)、 蛋白C和蛋白S、 骨钙蛋白、 基质Gla蛋白(MGP)、 骨膜素等。 有研究表 明， 尽管。

13、食物中的PK含量较高， 但与MK-n(尤其是MK-7)相比， PK的生物活性较 差； 长链MK-n 如MK-7对正常凝血的作用比PK和MK-4更持久。 因此， 由于其半衰期长、 生 物利用度好， MK-7 在食品、 制药和保健行业更受欢迎， 被广泛用作膳食补充剂或药物， 用于 治疗骨质疏松症、 动脉钙化、 心血管疾病、 癌症和帕金森精神病等。 0003 传统的MK-7生产方法包括化学合成法和微生物发酵法。 虽然化学合成法生产MK-7 的工 艺在不断地创新， 但是产率低、 副产物多、 有机溶剂残留、 生产环境危险、 环保存在隐 患的 缺陷并没有彻底解决， 制约了MK-7的生产和应用。 而微生物大。

14、规模、 高密度连续深层 发酵(主 要以纳豆芽孢杆菌发酵为主)生产MK-7由于质量可控、 安全、 绿色、 天然等特点而 更具优势。 Sato等从日本食物纳豆中分离出菌株B.subtilis， 通过传统诱变筛选出甲萘醌 抗性菌株， 在7L罐中发酵4天可产35mg/L的MK-7； 筛选出的二苯胺抗性菌株， 上罐37发酵 1天， 45发酵5天可产60mg/L的MK-7。 Song等筛选出的1-羟基-2-萘甲酸抗性突变株 B.subtilis natto， 在500mL瓶中发酵72小时可产3.5930.107mg/L的MK-7。 Luo等对分离 出的 菌株Bacillus natto的发酵培养基及发酵条。

15、件和MK-7的萃取方法进行优化， 在5L反 应器 中发酵72小时可产32.2mg/L的MK-7。 最近也有研究通过代谢途径工程的方法， 来提高 解 淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中MK-7的产量。 Xu等从中国豆豉中分离 出6 株产纤维蛋白原酶的B.amyloliquefaciens菌株， 发现菌株B.amyloliquefaciens Y-2 能 够产生7.10.5mg/L的MK-7。 序列分析表明以下六个酶经历了错义突变： MenA， MenC， MenD， MenE， MenH， HepS。 通过在枯草芽孢杆菌168中过表达菌株Y-2的这六个酶， 发。

16、现MenA 的过表达使得MK-7的含量增加1.6倍， 优于其它酶； 在解淀粉芽孢杆菌Y-2中过表达自身的 这六个酶， 发现HepS的过表达导致MK-7的产量最高， 达到2735.4克/干细胞重量(DCW)。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是， 提供一种基因修饰方法， 具体是将透明颤菌血红蛋 白 (Vitreoscilla Hemoglobin， VHb)基因克隆到枯草芽孢杆菌内， 并考察对菌株生长及 说明书 1/10 页 4 CN 111560383 A 4 MK-7 产量的影响。 0005 本发明提供的促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法， 包括下列步骤： 0006 (一。

17、)出发菌株BSMK_9的构建 0007 (1)在B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因 0008 首先以B.subtilis 168的染色体为模板， 分别用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA- U2q， yxlA-menA-1q/yxlA-menA-2， yxlA-menA-D1q/yxlA-menA-D2， yxlA-menA-G1q/yxlA- menA-G2 扩增片段U(1115bp)、 A(1057bp)、 D(1053bp)、 G(806bp)； 以质粒pUC57-1.8k-P1 为 模板， 用引物yxlA-menA-P1/yxlA-menA-P2扩。

18、增含有启动子PlapS的片段P(442bp)； 以 BS168NUm的染色体为模板， 用引物yxlA-menA-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)。 然后通过 重 叠PCR方法， 利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-2， 将片段U、 P和A拼接成片段UPA(2614 bp)； 再利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-D2将片段UPA和片段D拼接成片段UPAD (3667bp)； 最后利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-G2将片段UPAD、 片段CR和片段G拼接成 片段UPADCRG (6542bp)。 将UPADCRG片段转化受体菌。

19、BS168NU的感受态细胞， 经过两步筛选， 最终获得 menA基因在yxlA位点整合的重组菌株MK3。 在B.subtilis染色体的yjoB位点过表 达dxs 基因、 在ydeO位点过表达dxr基因、 在yqaL位点过表达yacM-yacN基因、 在pksJ位点过 表 达glpK基因、 在pksL位点过表达glpD基因、 在iolI位点过表达aroG基因、 在iolE位点 过 表达pyrG基因、 在yqaQ位点过表达hepS基因的方法类似于在yxlA位点过表达menA基因。 0009 (2)dhbB基因的敲除 0010 以B.subtilis 168的染色体为模板， 分别用引物dhbB-U。

20、1/dhbB-U2、 dhbB-D1q/ dhbB-D2 和dhbB-G1q/dhbB-G2扩增片段U(1003bp)、 D(815bp)和G(605bp)； 以BS168NUm的 染色体为模板， 用引物dhbB-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR)的片段CR(2069bp)。 首 先通过重叠PCR， 利用引物dhbB-U1/dhbB-D2， 将片段U和D拼接成UD(1818bp)； 然 后利用引 物dhbB-U1/dhbB-G2， 通过重叠PCR方法， 将上述三个片段UD、 GR和G拼接成UDCRG (4492bp)。 将UDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123的感受态细胞。

21、， 最终筛选获得基因dhbB 被敲除的重组 菌株MK3-MEP123-dhbB。 mgsA基因及araM基因的敲除类似于dhbB的敲除。 通过依次过表 达上述10个基因并敲除3个基因后最终获得重组菌株BSMK_9。 0011 (二)过表达透明颤菌血红蛋白基因vgb 0012 首先以出发菌BSMK9的染色体为模板， 分别用引物cyd-vgb-U1/cyd-vgb-U2、 cyd- vgb-D1/cyd-vgb-D2和cyd-vgb-G1q/cyd-vgb-G2扩增片段U(如SEQ ID No.11所示， 1149 bp)、 D(如SEQ ID No.12所示， 1028bp)和G(如SEQ ID。

22、 No.13所示， 1163bp)； 以BS168NUm 的 染色体为模板， 用引物cyd-vgb-CR1q/CR2扩增片段CR(如SEQ ID No.14所示， 2069bp)； 以 质粒pUC57-Simple-VHb为模板， 用引物cyd-vgb-1/cyd-vgb-2扩增含有启动子TP2表达盒 及透明颤菌血红蛋白基因vgb的片段PV(如SEQ ID No.15所示， 689bp)； 然后通过重叠PCR 方法， 拼接成UPVDCRG(6058bp)。 用UPVDCRG片段转化受体菌BSMK_9的感受态细胞， 最终 筛 选获得vgb基因在cyd位点整合的重组菌株BSMK_11。 UPVDC。

23、RG片段序列(如SEQ ID No.16 所 示)。 0013 PCR引物序列如下 0014 Primer Number Sequence(53) cyd-vgb-U1 SEQ ID No.1 GTGACAGAACCGACAATAAG 说明书 2/10 页 5 CN 111560383 A 5 cyd-vgb-U2 SEQ ID No.2 CCATCAACGCAACCATAAAC cyd-vgb-D1 SEQ ID No.3 CAGGAGCAGATTAGAGGAAA cyd-vgb-D2 SEQ ID No.4 TGGATGGTAGATGCGAATG cyd-vgb-G1q SEQ ID No。

24、.5 GCACGAAAACTGAATGAATAAGGAATCACAACCGATGAAA cyd-vgb-G2 SEQ ID No.6 CACACCGCCAAGTATAGAA cyd-vgb-CR1q SEQ ID No.7 ACATTCGCATCTACCATCCATCTTCAACTAAAGCACCCAT CR2 SEQ ID No.8 TTATTCATTCAGTTTTCGTG cyd-vgb-1 SEQ ID No.9 GTTTATGGTTGCGTTGATGG cyd-vgb-2 SEQ ID No.10 TTTCCTCTAATCTGCTCCTG 0015 过表达menA的引物及片段的序列， 。

25、见专利CN108715824A。 0016 本发明的有益效果 0017 本发明以枯草芽孢杆菌168为出发菌， 通过依次过表达1， 4-二羟基-2-萘甲酸七烯 转移 酶(MenA)、 甲基赤藓糖醇-4-磷酸路径的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Dxs)、 1-脱氧 木 酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)、 甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶(YacM)、 甲基赤藓糖 醇2,4-环二磷酸合成酶(YacN)、 甘油激酶(GlpK)、 甘油-1-磷酸脱氢酶(GlpD)、 去反 馈调控 的异源的3-脱氧-D-阿拉伯糖-7-磷酸庚酮糖合成酶(AroG)、 去反馈调控的胞苷三磷 酸合 成酶(PyrG)、 七烯。

26、焦磷酸合成酶I(HepS)， 并敲除基因dhbB(编码异分支酸裂合酶)、 丙酮醛 合成酶(MgsA)、 甘油-1-磷酸合成酶(AraM)， 构建了重组菌株BSMK_9。 本发明以 实验室已构 建的BSMK_9为出发菌， 首先过表达透明颤菌血红蛋白(VHb)， 促进细胞胞内氧 的传输和提 高氧的利用效率， 考察其对MK-7合成的影响； 然后向培养基中额外加入不同碳源： 甘油、 葡 萄糖、 蔗糖、 棉子糖、 山梨糖醇、 甘露醇， 考察它们对MK-7合成的影响； 最终通过 5L罐发酵， 确定所构建的重组菌株所能产生的MK-7的最高产量， 这为将来工业上通过代谢 工程及发 酵手段构建纳豆芽孢杆菌高产M。

27、K-7菌株提供理论依据。 0018 到目前为止， 还未有研究透明颤菌血红蛋白的表达对MK-7合成的影响。 本发明以 申请人 实验室已构建的来源于枯草芽孢杆菌168的BSMK_9为出发菌株， 通过过表达透明颤 菌血红蛋 白(VHb)， 促进细胞胞内氧的传输和提高氧的利用效率， 考察其对MK-7合成的影 响； 并通 过优化碳源组合及上罐发酵， 促进MK-7的最大合成量， 为将来遗传改造及发酵优 化纳豆芽孢 杆菌构建MK-7高产菌株提供理论依据。 附图说明： 0019 图1示出发菌BSMK_9及重组菌BSMK_11的菌体生长情况(图1A)和MK-7产量图(图 1B)。 图2示不同种类的碳源对MK-7。

28、合成的影响(图2A)和不同浓度的蔗糖对MK-7合成的影 响(图 2B)。 0020 图3示在5L罐中发酵重组菌BSMK_11时的菌体生长情况和MK-7产量图。 具体实施方式： 0021 实施例1 0022 本实施例提供一种促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的基因修饰方法， 具体如下： 0023 一、 材料 说明书 3/10 页 6 CN 111560383 A 6 0024 菌株、 质粒和培养基 0025 本发明涉及的所有菌株和质粒信息详见表1。 0026 LB培养基(蛋白胨10g/L、 酵母提取物5g/L、 氯化钠10g/L)用于B.subtilis的一 般 培养， 固体培养基添加15g/L琼脂。

29、粉， 需要时新霉素16 g/mL， 或氯霉素8 g/mL。 发 酵培养 基： 甘油30mL/L， 大豆蛋白胨60g/L， 酵母提取物5g/L， K2HPO4 3g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， pH 7.3。 0027 表1实验中涉及的菌株及质粒 0028 0029 0030 试剂及仪器 0031 FastTaq酶、 Hifi DNA聚合酶、 dNTP均购自北京全式金生物技术有限公司； 标准品 MK-7 购自ChromaDex公司； 其余生化试剂为进口或国产分析纯试剂。 所用仪器： 漩涡混合 器、 真 空离心浓缩仪、 高效液相色谱仪(Shimadzu)。 0032 引物用于PCR的。

30、引物见表2。 0033 表2 PCR引物序列 0034 Primer Number Sequence(53) cyd-vgb-U1 SEQ ID No.1 GTGACAGAACCGACAATAAG cyd-vgb-U2 SEQ ID No.2 CCATCAACGCAACCATAAAC cyd-vgb-D1 SEQ ID No.3 CAGGAGCAGATTAGAGGAAA cyd-vgb-D2 SEQ ID No.4 TGGATGGTAGATGCGAATG cyd-vgb-G1q SEQ ID No.5 GCACGAAAACTGAATGAATAAGGAATCACAACCGATGAAA cyd-v。

31、gb-G2 SEQ ID No.6 CACACCGCCAAGTATAGAA cyd-vgb-CR1q SEQ ID No.7 ACATTCGCATCTACCATCCATCTTCAACTAAAGCACCCAT CR2 SEQ ID No.8 TTATTCATTCAGTTTTCGTG 说明书 4/10 页 7 CN 111560383 A 7 cyd-vgb-1 SEQ ID No.9 GTTTATGGTTGCGTTGATGG cyd-vgb-2 SEQ ID No.10 TTTCCTCTAATCTGCTCCTG 0035 二、 方法 0036 DNA操作 0037 所有DNA片段都来自PCR扩增。

32、； 用于转化的DNA片段均采用重叠PCR方法拼接形成。 B. subtilis感受态细胞的制备及转化采用Spizizen方法。 在染色体上的基因过表达和基 因敲 除均采用无标记修饰方法， 即利用反选择盒(Para-neo)和选择盒(cat-araR)来完成。 引物 合成及DNA测序均由金唯智生物科技有限公司(苏州， 中国)负责。 基因合成由金斯瑞 生物 科技有限公司(南京， 中国)负责。 0038 具体步骤如下 0039 (一)出发菌株BSMK_9的构建 0040 在B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因。 首先以B.subtilis 168的染色 体为模板， 分别用引物y。

33、xlA-menA-U1/yxlA-menA-U2q， yxlA-menA-1q/yxlA-menA-2， yxlA- menA-D1q/yxlA-menA-D2， yxlA-menA-G1q/yxlA-menA-G2扩增片段U(1115bp)、 A(1057 bp)、 D(1053bp)、 G(806bp)； 以质粒pUC57-1.8k-P1为模板， 用引物 yxlA-menA-P1/yxlA-menA-P2 扩增含有启动子PlapS的片段P(442bp)； 以实验室保存的 BS168NUm的染色体为模板， 用引物 yxlA-menA-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)。 然后通过 。

34、重叠PCR方法， 利用引物yxlA-menA- U1/yxlA-menA-2， 将片段U、 P和A拼接成片段UPA(2614 bp)； 再利用引物yxlA-menA-U1/ yxlA-menA-D2将片段UPA和片段D拼接成片段UPAD(3667bp)； 最后利用引物yxlA-menA-U1/ yxlA-menA-G2将片段UPAD、 片段CR和片段G拼接成片段UPADCRG (6542bp)。 将UPADCRG片段 转化受体菌BS168NU的感受态细胞， 经过两步筛选， 最终获得 menA基因在yxlA位点整合的 重组菌株MK3。 在B.subtilis染色体的yjoB位点过表达dxs 基因。

35、、 在ydeO位点过表达dxr基 因、 在yqaL位点过表达yacM-yacN基因、 在pksJ位点过表 达glpK基因、 在pksL位点过表达 glpD基因、 在iolI位点过表达aroG基因、 在iolE位点 过表达pyrG基因、 在yqaQ位点过表达 hepS基因的方法类似于在yxlA位点过表达menA基因。 0041 dhbB基因的敲除。 以B.subtilis 168的染色体为模板， 分别用引物dhbB-U1/dhbB- U2、 dhbB-D1q/dhbB-D2和dhbB-G1q/dhbB-G2扩增片段U(1003bp)、 D(815bp)和G(605 bp)； 以BS168NUm的。

36、染色体为模板， 用引物dhbB-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR) 的片段CR (2069bp)。 首先通过重叠PCR， 利用引物dhbB-U1/dhbB-D2， 将片段U和D拼 接成UD(1818bp)； 然后利用引物dhbB-U1/dhbB-G2， 通过重叠PCR方法， 将上述三个片 段UD、 GR和G拼接成 UDCRG(4492bp)。 将UDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123的感受态细 胞， 最终筛选获得基因 dhbB被敲除的重组菌株MK3-MEP123-dhbB。 mgsA基因及araM基因 的敲除类似于dhbB的敲 除。 通过依次过表达上述10个基因并敲除3个。

37、基因后最终获得重组 菌株BSMK_9。 0042 (二)过表达透明颤菌血红蛋白基因vgb 0043 选择B.subtilis染色体的cyd位点过表达vgb基因， 该位点与MK-7合成路径没有关 系 且本实验室已证明， 其的敲除不影响细胞正常生长特性且对MK-7产量没有影响。 首先以 出发 菌BSMK9的染色体为模板， 分别用引物cyd-vgb-U1/cyd-vgb-U2、 cyd-vgb-D1/cyd- vgb-D2和 cyd-vgb-G1q/cyd-vgb-G2扩增片段U(如SEQ ID No.11所示， 1149bp)、 D(如SEQ ID No.12 所示， 1028bp)和G(如SEQ。

38、 ID No.13所示， 1163bp)； 以BS168NUm的染色体为模板， 说明书 5/10 页 8 CN 111560383 A 8 用 引物cyd-vgb-CR1q/CR2扩增片段CR(如SEQ ID No.14所示， 2069bp)； 以质粒 pUC57- Simple-VHb为模板， 用引物cyd-vgb-1/cyd-vgb-2扩增含有启动子TP2表达盒及透明 颤菌 血红蛋白基因vgb的片段PV(如SEQ ID No.15所示， 689bp)； 然后通过重叠PCR方法， 拼接成 UPVDCRG(6058bp)。 用UPVDCRG片段转化受体菌BSMK_9的感受态细胞， 最终筛选获 。

39、得vgb基 因在cyd位点整合的重组菌株BSMK_11。 UPVDCRG片段序列(如SEQ ID No.16所示)。 0044 实施例2重组菌株BSMK_11的培养 0045 摇瓶发酵培养及菌体生长的测定， 发酵培养基及发酵条件见表3。 0046 表3发酵培养基及发酵条件 0047 参数 范围 甘油 2080mL/L 大豆蛋白胨 60180g/L 酵母提取物 020g/L K2HPO415g/L MgSO47H2O 0.10.8g/L pH 6.57.5 接种量 16 温度 3545 转速 100250r/min 发酵时间 72-144h 0048 500mL摇瓶发酵： 挑取新活化的平板单菌落。

40、接入装有30mL LB培养基的250mL摇瓶 中， 200r/min、 37振荡培养14h； 按1接种量转接装有50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中 (三个平行)， 37、 避光条件下、 220r/min振荡培养120h。 0049 生物量的测定： 发酵6h后取样， 然后24h后取样， 后面每间隔24h取适量发酵液， 13000r/min离心1min沉淀细胞， 洗涤后重悬、 稀释适当倍数， 测定菌悬液的OD600值。 0050 MK-7的提取及HPLC检测： 0051 取96h发酵液750 L， 向其加入1mL的异丙醇和2mL的正己烷， 漩涡震荡2min， 5000r/ min、 4离心6m。

41、in， 取上清1mL进行真空离心浓缩， 最后加入750 L甲醇进行 溶解。 经0.25 m 滤膜过滤， 取滤液进行HPLC检测， 所有过程应尽量避光。 0052 色谱条件： 色谱柱， Shim-pack GIST C18色谱柱(250mm4.6mm， 5 m)； 检测器， ShimadzuSPD-20A； 流动相， 纯甲醇； 柱温， 50； 检测波长为270nm； 流速1.0mL/min。 定量方 法： 使用相同的色谱条件测定标准品MK-7的标准溶液， 绘制浓度-峰面积标准曲线， 对MK-7 定量。 0053 本发明通过过表达透明颤菌血红蛋白， 促进细胞胞内氧的传输和提高氧的利用效 率， 考 。

42、察其对菌体生长及MK-7合成的影响。 由表4可知， 与出发菌相比， 重组菌的生长趋势 基本不 变， 但生长情况有所增加。 由表5可知， 发酵96h后， 出发菌的MK-7产量为80.2mg/L， 重组菌的MK-7产量为86.0mg/L， 较出发菌提高7.2。 研究结果表明过表达透明颤菌血红蛋 白(VHb)可促进重组菌株的生长及MK-7的合成。 具体如图1所示。 0054 表4菌体生长情况 说明书 6/10 页 9 CN 111560383 A 9 0055 0056 注： *示与出发菌BSMK_9相比具有显著差异(P0.05)；#示与出发菌BSMK_9相比具 有极显著 差异(P0.01)。 00。

43、57 表5MK-7产量 0058 0059 注： *示与出发菌BSMK_9相比具有显著差异(P0.05)；#示与出发菌BSMK_9相比具 有极显著 差异(P0.01)。 0060 实施例3碳源优化 0061 由表4可知， 出发菌BSMK_9的生长在发酵48h有所下降， 随后有所下降， 即出现二次 生长 现象， 说明此时碳源甘油已耗尽， 随后大豆蛋白胨除提供氮源外， 还提供碳源来满足 枯草芽 孢杆菌的生长要求。 为了进一步增加MK-7产量， 本发明向发酵培养基中分别加入 1.0甘油、 葡萄糖、 蔗糖、 棉子糖、 山梨糖醇、 甘露醇。 由表6可知， 甘油的加入导致MK-7产 量较初始条 件下降8.。

44、3， 表明发酵培养基中3.0甘油的存在最利于MK-7的合成； 此外， 葡萄糖、 棉子糖 或甘露醇的加入也均导致MK-7产量降低； 然而， 蔗糖及山梨糖醇的加入分 别导致MK-7产量增 加9.5和8.0。 0062 为了确定促进MK-7合成的蔗糖的最佳浓度， 本发明分别向发酵培养基中分别添加 0.5、 1.0、 1.5和2.0的蔗糖。 由表7可知， 当蔗糖浓度为1.0时， MK-7产量最高， 为 94.2mg/L。 研究结果表明发酵培养基中3.0甘油和1.0的存在是MK-7合成的最优碳源 组合。 具体如图2 所示。 0063 表6向发酵培养基中加入1.0的不同碳源对MK-7合成的影响 0064 。

45、碳源种类 MK-7产量(mg/L) 对照 86.01.8 甘油 78.9*0.7 葡萄糖 65.5#0.4 蔗糖 94.2#1.3 说明书 7/10 页 10 CN 111560383 A 10 棉子糖 83.81.3 山梨糖醇 92.9*1.1 甘露醇 85.30.8 0065 注： *示与对照条件相比具有显著差异(P0.05)；#示与对照条件相比具有极显著 差异(P 0.01)。 0066 表7向发酵培养基中加入不同比例的蔗糖对MK-7合成的影响 0067 蔗糖比例 MK-7产量(mg/L) 0.5 86.60.1 1.0 94.21.3 1.5 65.01.5 2.0 56.90.4 0。

46、068 实施例4在5L罐发酵中培养 0069 为了进一步促进MK-7的生产， 选择在5L罐中发酵重组菌BSMK_11。 此时初始发酵培 养基： 甘油30mL/L， 蔗糖10g/L， 大豆蛋白胨60g/L， 酵母提取物5g/L， K2HPO4 3g/L， MgSO4 7H2O 0.5g/L， pH 7.3； 接种量为10； 发酵温度为37； 转速为800r/min； 发酵时间为144h。 由表8可知， 发酵14h后， 菌体进入生长稳定期， 此时开始进行补料， 补料培养基： 甘油135mL/ L， 蔗糖45g/L， 大豆蛋白胨270g/L； 发酵至144h后， 细胞生长降低， 此时5L罐中发酵总体。

47、积 约为4L。 由表9可知， 随着发酵时间的延长， MK-7产量逐渐增加， 在发酵132h后， 产量达到 最 大， 为281.4mg/L， 是在500mL摇瓶中发酵产量的近3倍。 具体如图3所示。 0070 分泌到胞外的MK-7测定： 分别取108h、 120h、 132h、 144h的发酵液1mL， 13000r/min 离心8min， 取上清750 L， 向其加入1mL的异丙醇和2mL的正己烷， 漩涡震荡2min， 5000 r/ min、 4离心6min， 再取上清1mL进行真空离心浓缩， 最后加入375 L甲醇进行溶解。 经0.25 m滤膜过滤， 取滤液进行HPLC检测。 所有过程应尽。

48、量避光。 0071 细胞干重的测定： 分别取108h、 120h、 132h、 144h的发酵液1mL， 13000r/min离心 8min， 尽可能的除去上清， 用无菌水洗涤收集的细胞沉淀两次并干燥直至重量不再变化。 0072 曾有研究表明枯草芽孢杆菌及纳豆芽孢杆菌在发酵培养过程中产生的维生素K2 可与特定 的酸性因子结合形成可溶性复合物分泌到胞外。 由表10可知， 在发酵过程中分泌 到胞外的MK-7 量很少， 且随着发酵时间延长， 略有增加； 在发酵132h后， 用细胞干重表示的 MK-7产量为12.0 mg/g DCW。 0073 表8菌体生长情况 说明书 8/10 页 11 CN 11。

49、1560383 A 11 0074 0075 0076 表9 MK-7产量 0077 发酵时间(h) MK-7产量(mg/L) 6 10.20.3 说明书 9/10 页 12 CN 111560383 A 12 12 31.80.3 23.8 58.01.4 35.8 70.01.6 48.1 94.50.6 60 126.20.9 72 169.51.6 84 190.22.5 96 208.62.8 108 230.03.1 120 253.14.4 132 281.45.0 144 272.73.6 0078 表10为重组菌BSMK_11在5L罐中发酵108h、 120h、 132h、 。

50、144h后的分泌到胞外 的 MK-7量、 此时的细胞干重及用细胞干重表示的MK-7产量。 0079 表10 0080 说明书 10/10 页 13 CN 111560383 A 13 序列表 天津大学青岛海洋技术研究院 促进枯草芽孢杆菌合成甲基萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法 16 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 gtgacagaac cgacaataag 20 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 ccatcaacgc aaccataaac 20 3 20 DNA 人。