热稳定性提高的角蛋白酶突变体.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010439769.9 (22)申请日 2020.05.22 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 申请人 武汉工控工业技术研究院有限公司 (72)发明人 张娟苗周迪谈沐阳陈坚 郭荣李江华邓小华 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 仇钰莹 (51)Int.Cl. C12N 9/54(2006.01) C12N 15/57(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C。

2、12N 1/15(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体 (57)摘要 本发明公开了一种热稳定性提高的角蛋白 酶突变体， 属于基因工程和酶工程技术领域。 本 发明采用全质粒PCR对携带角蛋白酶基因的质粒 进行定点饱和突变， 构建筛选得到热稳定性突变 重组菌， 得到角蛋白酶突变体T78C和T78E。 热稳 定性研究结果显示角蛋白酶突变体T78C和T78E 在60的半衰期为亲本酶的2.25倍和2.1倍。 权利要求书1页 说明书6页 序列表8页 附图2页 CN 111575265 A 2020。

3、.08.25 CN 111575265 A 1.角蛋白酶突变体， 其特征在于， 以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲 本， 将亲本的第78位进行突变。 2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体， 其特征在于， 所述突变体为以下所述任一： (a)将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为半胱氨酸； (b)将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为谷氨酸。 3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。 4.携带权利要求3所述基因的表达载体。 5.根据权利要求4所述的表达载体， 其特征在于， 所述表达载体为pP43NMK。 6.表达权利要求1或2所述突变体， 或含有权利要求3所述基因的宿主细胞。 7。

4、.根据权利要求6所述的宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主细胞为原核细胞或真核细 胞。 8.一种降解角蛋白的方法， 其特征在于， 所述方法以含有角蛋白的物质为底物， 利用权 利要求1或2所述突变体降解角蛋白。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述含有角蛋白的物质包括皮毛、 弹性蛋 白、 鳞片、 纤维。 10.权利要求1或2所述突变体， 或权利要求3所述基因， 或权利要求4或5所述表达载体， 或权利要求6或7所述宿主细胞， 或权利要求8或9所述方法在畜牧、 饲料、 制革、 医药领域中 降解角蛋白中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111575265 A 2 一种热稳定性提高。

5、的角蛋白酶突变体 技术领域 0001 本发明涉及一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体， 属于基因工程和工程技术领 域。 背景技术 0002 角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如羽毛， 羊毛， 牛羊角等)的特异性角 蛋白酶， 由真菌、 放线菌和细菌等多种微生物产生。 角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛， 水解催化能力强的蛋白酶， 广泛地运用于畜牧行业、 饲料行业、 制革行业、 医药行业中， 具有 巨大的研究与应用价值。 0003 但是， 野生角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。 在工业化应用上对酶的要求苛 刻， 如高温环境会很大程度影响角蛋白酶的酶活。 在实际应用中通常需要加热来加速反应， 提高了能。

6、耗， 且角蛋白酶粉制备时的喷雾干燥过程也需要加热。 因此， 热稳定的角蛋白酶在 实际应用中非常重要。 目前， 提高酶热稳定性的方法主要包括固定化、 化学修饰、 补充添加 剂、 酶的转译后修饰和蛋白质工程等方法。 虽然前两种策略可以提高酶的热稳定性， 但是需 要附加工艺对酶进行处理， 增加了生产成本。 因此， 应用蛋白质工程的手段从分子水平提高 酶的热稳定性将是一个新的研究手段。 0004 随着绿色产业的推动， 迫切需要角蛋白酶产业化的实现， 但目前角蛋白酶的热稳 定性总体仍未达到商业化应用的需求。 课题组前期已经构建获得一株具有高角蛋白水解酶 活的角蛋白酶重组菌， 其在15L发酵罐上角蛋白酶活。

7、力达到426.60KU/mL以上(该角蛋白酶 记载于Biotransformation of keratin waste to amino acids and active peptides based on cell-free catalysis文献中)， 是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高 水平。 但是该角蛋白酶的热稳定性不高， 所以为了进一步提高酶的应用性能， 有必要进一步 提高上述角蛋白酶的热稳定性。 发明内容 0005 为解决上述技术问题， 本发明提供了角蛋白酶突变体， 采用定点饱和突变策略， 对 亲本酶的氨基酸位点进行突变改造， 以提高角蛋白酶的热稳定性。 0006 本发明提。

8、供了角蛋白酶突变体， 所述角蛋白酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲本， 对亲本角蛋白酶的第78位进行突变。 0007 在本发明的一种实施方式中， 将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为半胱氨酸得 到突变体T78C， 所述突变体T78C氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。 0008 在本发明的一种实施方式中， 将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为谷氨酸得到 突变体T78E， 所述突变体T78E氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 0009 本发明还提供了一种编码所述的角蛋白酶突变体的基因。 0010 本发明还提供了一种携带编码所述突变体酶的述基因的重组质粒。 。

9、0011 在本发明的一种实施方式中， 所述重组质粒的载体为pP43NMK质粒。 说明书 1/6 页 3 CN 111575265 A 3 0012 本发明还提供了携带编码所述突变体酶的基因或所述重组质粒的宿主细胞。 0013 在本发明的一种实施方式中， 所述宿主细胞为细菌或真菌。 0014 在本发明的一种实施方式中 ， 所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600。 0015 在本发明的一种实施方式中， 所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体 酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。 0016 本发明提供一种降解角蛋白酶的方法， 所述方法为。

10、以鸡羽毛为底物， 加入突变体 T78C和/或T78E， 进行反应。 0017 在本发明的一种实施方式中， 所述方法为以含角蛋白的物质为底物， 加入纯化后 的突变体T78C和/或T78E， 在37反应4h。 0018 在本发明的一种实施方式中， 所述含角蛋白的物质包括皮毛、 弹性蛋白、 鳞片、 纤 维。 0019 在本发明的一种实施方式中， 所述含角蛋白的物质包括皮肤、 酪蛋白、 毛料、 指甲、 羽毛。 0020 本发明提供了一种所述突变体、 基因、 表达载体或宿主细胞在畜牧业、 饲料业、 制 革业、 医药业中的应用。 0021 本发明还要求保护所述突变体、 基因、 表达载体或宿主细胞在降解皮肤。

11、、 毛发、 酪 蛋白、 弹性蛋白、 毛料、 指甲、 鳞片、 纤维、 毛发角蛋白中的应用。 0022 本发明的有益效果： 本发明采用全质粒PCR构建得到角蛋白酶突变体T78C、 T78E， 热稳定性研究结果显示角蛋白酶突变体T78C和T78E在60的半衰期均为亲本酶的2.25倍 和2.1倍， 更具有应用价值与潜力。 附图说明 0023 图1为角蛋白酶突变体T78C， T78E的枯草芽孢杆菌上清SDS-PAGE凝胶电泳； 其中， M 代表蛋白分子量标准， 不同泳道代表不同的突变蛋白， 箭头指示目的蛋白条带位置。 0024 图2为不同突变体与对照菌在60热稳定性比较。 0025 图3为突变体降解羽毛。

12、图； a为0h的反应体系； b为4h后的反应体系。 具体实施方式 0026 下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自北纳生物； 下述实施例中涉及的pP43NMK 质粒购自丰晖生物； 下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600记载于 公开号为CN102492645A的专利申请文本中。 0027 (一)实施例中涉及的培养基为： 0028 LB液体培养基： 酵母粉5.0gL-1、 胰蛋白胨10.0gL-1、 NaCl 10.0gL-1。 0029 LB固体培养基： 酵母粉5.0gL-1、 胰蛋白胨10.0gL-1、 NaCl 10.0gL-1、 琼脂粉 15g/L。

13、。 0030 发酵培养基： 蛋白胨20gL-1、 酵母粉10gL-1、 蔗糖20gL-1、 KH2PO4 3gL-1、 Na2HPO4 6gL-1、 MgSO4 0.3gL-1。 0031 (二)实施例中涉及的检测方法如下： 说明书 2/6 页 4 CN 111575265 A 4 0032 角蛋白酶酶活的测定： 取50 L适当稀释的发酵上清液， 加入150 L 50mM的Gly/ NaOH溶液作为缓冲液和100 L浓度为2.5的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发 展有限公司， 产品编码： K0043)作为底物， 混匀后于40下反应20min； 加入200 L 4(w/v) 的三氯乙酸。

14、(TCA)终止反应， 室温8000r/min离心3min。 取上清200 L， 加入1mL 4(w/v)的 Na2CO3和200 L的福林酚试剂， 混匀后50下显色10min， 使用0.5cm石英比色皿于660nm下测 定清液吸光值； 实验组3个平行， 空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA， 其余操 作同上； 0033 酶活的定义： 在该条件下OD660每升高0.001所需酶量为一个酶活力单位(1U)。 0034 酶的纯化： 采用AKTAavant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。 由于不同角蛋白酶突 变体都含有组氨酸标签， 所以可以镍离子亲和层析纯化柱进行分离纯化， 具体步骤如下： (。

15、1)平衡： 用5倍体积的20mmol/LpH 7.4Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱； (2)上样： 预先处理好 的样品以0.5ml/min的流速上样， 上样体积一般不超过柱体积的5倍； (3)洗脱： 包括洗脱未 吸附物质、 杂蛋白和目的蛋白， 流速2.0ml/min， 洗脱液为含有50mM咪唑的20mmol/LpH 7.2 的Tris-HCl缓冲液， 进行梯度洗脱， 检测波长为280nm， 分批收集含角蛋白酶酶活的洗脱液； 洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰， 后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现， 无论是原始 酶， 还是突变酶， 峰顶收集的酶液为最纯的部分。 0035 实施例1： 角蛋白。

16、酶定点突变体的构建 0036 本研究中选择氨基酸序列为SEQ ID NO.2的角蛋白酶的氨基酸位点(第1位丙氨 酸、 第78位苏氨酸、 第131位甘氨酸、 第159位丝氨酸、 第240位天冬酰胺、 第275位谷氨酰胺) 进行突变改造研究。 0037 根据角蛋白酶的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)， 分别设计突变引物， 对携带角蛋白酶基因的质粒pP43NMK进行定点饱和突变。 0038 其中， 第1位丙氨酸所用引物如下： 0039 正向引物： 5 -CCATGCCTTGNNKCAAACCGTTCCTTACGGCATTCC-3 (SEQ ID。

17、 NO.5)； 0040 反向引物： 5 -CGGTTTGMNNCAAGGCATGGGCCACATGATC-3 (SEQ ID NO.6)； 0041 第78位苏氨酸所用引物如下： 0042 正向引物： 5-GCTTGACAATNNKACGGGTGTATTAGGCGTTGC-3(SEQ ID NO.7)； 0043 反向引物： 5-CACCCGTMNNATTGTCAAGCGCAGCTACTGTAC-3(SEQ ID NO.8)； 0044 第131位甘氨酸所用引物如下： 0045 正向引物： 5-GGGAGCATCANNKTCGACAGCGATGAAACAGGCAG-3(SEQ ID NO.9。

18、)； 0046 反向引物： 5-CTGTCGAMNNTGATGCTCCCCCAAGGCTCAT-3(SEQ ID NO.10)； 0047 第159位丝氨酸所用引物如下： 0048 正向引物： 5-CAGCGGATCTNNKGGAAACACGAATACAATTGGCTATCCTG-3(SEQ ID NO.11)； 0049 反向引物： 5-TGTTTCCMNNAGATCCGCTGTTCCCTGCT-3(SEQ ID NO.12)； 0050 第240位天冬酰胺所用引物如下： 0051 正向引物： 5-AAAACATCCGNNKCTTTCAGCTTCACAAGTCCGCAAC-3(SEQ ID 。

19、NO.13)； 0052 反向引物： 5-CTGAAAGMNNCGGATGTTTTGACAAGATCAAAGCTG-3(SEQ ID NO.14)； 0053 第275位谷氨酰胺所用引物如下： 说明书 3/6 页 5 CN 111575265 A 5 0054 正向引物： 5-AGCTGCCGCTNNKTAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGT-3(SEQ ID NO.15)； 0055 反向引物： 5-ATCATTAMNNAGCGGCAGCTTCGACAT-3(SEQ ID NO.16)。 0056 PCR反应体系均为： PrimeSTAR Max Premix(2)25 L。

20、， 2.5mM dNTPs 4 L， 10 M正 向引物1 L， 10 M反向引物1 L， 模板DNA 1 L， 2.5U/ LPrimeSTARTaqHS 0.5 L， 加入双蒸水 至50 L； 0057 PCR产物扩增条件均为： 98预变性3min； 随后进行98 10s， 55 5s， 72 2min， 30个循环； 最后72保温10min； 0058 PCR扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测， 检测结束后， 向10 L扩增产物中加 入0.5 L甲基化模板消化酶(DpnI)， 枪头吹吸进行混匀， 于37条件下反应1.5h， 将Dpn I处 理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109， 转化产物。

21、涂布于LB固体培养基， 于37培养810h， 用LB液体培养基将LB固体上的单菌落都转移到摇菌管中， 于37、 220rpm培养23h后提取 质粒， 并送公司测序， 获得含有突变基因的重组质粒。 0059 实施例2： 重组菌的构建 0060 将重组质粒转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600， 转化产物涂布于LB固 体培养基， 于37培养8h， 将获得的大量单菌落接种到含有发酵培养基的96深孔板中， 以原 始菌株为对照， 37、 220rpm培养24h， 得到发酵液； 0061 发酵液于4、 4000rpm离心10min后， 获得发酵上清液。 0062 检测发酵上清液中。

22、的酶活， 保留酶活与原始菌株相近的突变重组菌。 0063 表1 原始酶与突变酶发酵上清液的酶活 说明书 4/6 页 6 CN 111575265 A 6 0064 0065 实施例3： 角蛋白酶突变体的热稳定性 0066 将实施例2中构建保留的突变重组菌经平板划线分离单菌落， 挑取单菌落接入LB 液体培养基(100 g/mL卡那霉素)， 于37、 220rpm培养14h， 获得种子液； 将种子液按照5 (v/v)的接种量接入发酵体培养基， 于37、 220rpm培养28h， 得到发酵液； 将发酵液于4、 12000rpm离心20min后， 收集离心发酵上清液， 进行SDS-PAGE分析， T7。

23、8E与T78C的分子量均 为28kDa(图1)。 将上清液进行纯化。 0067 评价重组酶突变前后半衰期t1/2实验中， 选择重组酶的稳定性较差的60进行检 测。 分别将未突变原始酶和各突变酶在60下进行热处理， 每隔15min取出部分检测残余酶 活， 以未进行热处理的酶活作为100。 选取热稳定性较好的突变体进行测序， 分别得到将 亲本酶第78位突变为半胱氨酸和谷氨酸的突变体， 分别命名为T78C、 T78E。 0068 T78C、 T78E突变酶与初始对照相比， 在60的热稳定性得到了提高， T78C在60的 半衰期t1/2由突变前的20min提高至突变后45min， 为对照的2.5倍， 。

24、T78E在60的半衰期t1/2 由突变前的20min提高至突变后45min， 为对照的2.5倍。 图2， 在30min时突变体酶T78C的酶 活为70.25KU/mL， T78E为66.45KU/mL， WT为36KU/mL， 在60min时突变体酶T78C的酶活为 41.25KU/mL， T78E为39.80KU/mL， WT为15.10KU/mL。 0069 表2 原始酶与突变酶的半衰期 说明书 5/6 页 7 CN 111575265 A 7 0070 0071 实施例4： 突变体在降解角蛋白中的应用 0072 将纯化后的突变体T78C和/或T78E配置成2000U/mL的羽毛降解酶液然。

25、后取50mL羽 毛降解液加入到含0.1g鸡羽毛的50mL离心管中， 将反应体系置于37、 220rpm反应4h， 观察 羽毛的降解情况。 如图3所示， 反应结束后， 发现羽毛被完全降解。 0073 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 6/6 页 8 CN 111575265 A 8 SEQUENCE LISTING 江南大学 武汉工控工业技术研究院有限公司 一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体 16 PatentIn versio。

26、n 3.3 1 1140 DNA 人工序列 1 atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttaatgct cgtgttcacg 60 atggccttca gcgattccgc gtctgctgct cagccggcga aaaatgttga aaaggattat 120 attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatccgtca aaaaggacat catcaaagag 180 agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 2。

27、40 aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 300 gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360 gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 420 caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 480 tataacaccg acggca。

28、acgg acacggcaca catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540 aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 600 aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 660 aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 720 caggcagtcg acaatgcata tgcaagaggg gttg。

29、tcgttg tagctgcagc agggaacagc 780 ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 840 gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 900 gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 960 ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt ga。

30、tcttgtca 1020 aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1080 ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140 2 379 PRT 人工序列 2 Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met 1 5 10 15 Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala A。

31、la Gln Pro 序列表 1/8 页 9 CN 111575265 A 9 20 25 30 Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val 35 40 45 Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys 50 55 60 Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp 65 70 75 80 Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val L。

32、ys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val 85 90 95 Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly 100 105 110 Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly 115 120 125 Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His 130 135 140 Pro Asp Leu Asn Val Val Gly 。

33、Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val 165 170 175 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val 180 185 190 Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr 195 200 205 Ser Gly Ile Val Ser 。

34、Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp 210 215 220 Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys 225 230 235 240 Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala 245 250 255 Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro 260 265 270 Ala Lys Tyr 。

35、Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser 275 280 285 Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala 290 295 300 Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr 305 310 315 320 Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala 325 330 335 序列表 。

36、2/8 页 10 CN 111575265 A 10 Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn 340 345 350 Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly 355 360 365 Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln 370 375 3 379 PRT 人工序列 3 Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr 。

37、Ala Leu Met 1 5 10 15 Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val 35 40 45 Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys 50 55 60 Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu。

38、 Asp 65 70 75 80 Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val 85 90 95 Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly 100 105 110 Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly 115 120 125 Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Se。

39、r His 130 135 140 Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val 165 170 175 Ala Ala Leu Asp Asn Cys Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val 180 185 190 Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Se。

40、r Gly Ser Tyr 195 200 205 Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp 210 215 220 序列表 3/8 页 11 CN 111575265 A 11 Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys 225 230 235 240 Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala 245 250 255 Ala Gly Asn。

41、 Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro 260 265 270 Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser 275 280 285 Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala 290 295 300 Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr 305 310 315 320 Leu。

42、 Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala 325 330 335 Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn 340 345 350 Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly 355 360 365 Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln 370 375 4 379 PRT 人工序列 4 Met Me。

43、t Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met 1 5 10 15 Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val 35 40 45 Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys 50 55 60 Val Asp Lys G。

44、ln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp 65 70 75 80 Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val 85 90 95 Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly 100 105 110 序列表 4/8 页 12 CN 111575265 A 12 Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe L。

45、ys Gly 115 120 125 Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His 130 135 140 Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val 165 170 175 Ala Ala Leu Asp Asn Glu Thr Gly Val Leu Gly Val A。

46、la Pro Ser Val 180 185 190 Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr 195 200 205 Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp 210 215 220 Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys 225 230 235 240 Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly V。

47、al Val Val Val Ala Ala 245 250 255 Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro 260 265 270 Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser 275 280 285 Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala 290 295 300 Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr P。

48、ro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr 305 310 315 320 Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala 325 330 335 Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn 340 345 350 Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly 355 360 365 Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu A。

49、la Ala Ala Gln 370 375 5 36 DNA 人工序列 序列表 5/8 页 13 CN 111575265 A 13 misc_feature (11).(12) n is a, c, g, or t 5 ccatgccttg nnkcaaaccg ttccttacgg cattcc 36 6 31 DNA 人工序列 misc_feature (9).(10) n is a, c, g, or t 6 cggtttgmnn caaggcatgg gccacatgat c 31 7 33 DNA 人工序列 misc_feature (11).(12) n is a, c, g,。

50、 or t 7 gcttgacaat nnkacgggtg tattaggcgt tgc 33 8 33 DNA 人工序列 misc_feature (9).(10) n is a, c, g, or t 8 cacccgtmnn attgtcaagc gcagctactg tac 33 9 35 DNA 人工序列 序列表 6/8 页 14 CN 111575265 A 14 misc_feature (11).(12) n is a, c, g, or t 9 gggagcatca nnktcgacag cgatgaaaca ggcag 35 10 31 DNA 人工序列 misc_feat。