五倍子有效部位的分离方法及其用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010527844.7 (22)申请日 2020.06.11 (71)申请人 石河子大学 地址 832003 新疆维吾尔自治区石河子市 北四路221号 (72)发明人 韩博王忠英刘永浩杨文静 陈文张华田星李晓娟 王钰莹李鸿晔田方圆薛芮 刘芦荟 (74)专利代理机构 乌鲁木齐中科新兴专利事务 所(普通合伙) 65106 代理人 李静 (51)Int.Cl. C07H 1/08(2006.01) C07C 67/48(2006.01) C07C 67/56(2006.01) C。

2、07H 13/08(2006.01) C07C 69/84(2006.01) C07C 69/86(2006.01) A61K 35/64(2015.01) A61K 31/235(2006.01) A61K 31/7024(2006.01) A61P 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种五倍子有效部位的分离方法及其用途 (57)摘要 本发明涉及一种五倍子有效部位的分离方 法及其用途， 该方法将五倍子药材粉碎过筛， 回 流提取， 合并提取液， 采用聚酰胺树脂为填料进 行柱层析， 以不同体积比的乙醇-水溶液进行洗 脱， 收集洗脱液并减压浓缩， 经液质联用测定， 得 到含二-O-没食。

3、子酰基葡萄糖， 三-O-没食子酰基 葡萄糖， 没食子酸乙酯， 四-O-没食子酰基葡萄 糖， 双没食子酸乙酯的五倍子有效部位。 经药理 研究表明： 五倍子有效部位对小鼠溃疡性结肠炎 有明显的治疗作用； 可显著提高溃疡组织中超氧 化物歧化酶 （SOD） 的含量， 降低丙二醛 （MDA） 和髓 过氧化物酶 （MPO） 含量， 并降低白介素-6 （IL-6） 、 白介素-1(IL-1)、 肿瘤坏死因子- （TNF- ） 等炎症因子的表达。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 111574571 A 2020.08.25 CN 111574571 A 1.一种五倍子有效部位的分离方法， 其特征在。

4、于按下列步骤进行： a、 选用同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生在红麸杨、 青麸杨、 盐肤木植物的叶 子上形成的虫瘿作为五倍子药材； b、 将选用的五倍子药材粉碎， 过60目筛， 称取80g药材粉末， 以240 mL蒸馏水为溶剂回 流提取3次， 每次提取2.5 h， 合并提取液； c、 将步骤b得到的提取液， 以聚酰胺树脂为填料进行柱层析， 以体积浓度10%， 30%， 70% 的乙醇溶液进行梯度洗脱， 收集70%的洗脱液并减压浓缩， 经液质联用测定， 得到含二-O - 没食子酰基葡萄糖， 三-O-没食子酰基葡萄糖， 没食子酸乙酯， 四-O-没食子酰基葡萄糖， 双 没食子酸乙酯的有效部位。 。

5、2.根据权利要求1所述方法获得的五倍子有效部位在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中 的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111574571 A 2 一种五倍子有效部位的分离方法及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种五倍子有效部位的分离方法及其用途。 背景技术 0002 溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病(IBD)， 一般连续分布， 累及结 肠粘膜和粘膜下层； 临床主要表现为持续性或反复性发作的腹泻、 黏液脓血便伴腹痛、 里急 后重、 体重减轻以及疲劳等症状。 溃疡性结肠炎(UC)与多种致病因素有关， 包括环境变化、 一系列易感基因变异、 肠道菌群和免疫反应失调。 免疫损伤。

6、是发病的主要原因， 作为一种自 身免疫性疾病， 溃疡性结肠炎(UC)主要是遗传易感的宿主对体内外正常刺激产生的异常免 疫反应， 患者的肠黏膜免疫通常被破坏， 且可能出现免疫功能异常等肠外并发症。 目前， 非 甾体类抗炎药(NSAID)、 糖皮质激素、 免疫抑制药物、 生物制剂等治疗炎性疾病的方法已被 广泛研究， 但这些现有的治疗方法有其自身的局限性。 0003 五倍子是同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生在红麸杨、 青麸杨、 盐肤木等 植物的叶子上而形成的虫瘿， 最早记载于 开宝本草 。 它主产于我国陕西、 四川、 贵州等地， 主要成分为没食子酸和鞣质， 其中没食子鞣质含量是50-70。 在临。

7、床上多用于治疗肺虚 肺热痰嗽、 久泻久痢、 盗汗、 消渴、 便血痔血、 外伤出血等。 唐建洲等人公开了一种五倍子提 取物的制备方法及应用(中国专利201810166779.2)； 聂少平等人发现了一种五倍子活性提 取物的制备方法及在抑制幽门螺杆菌中的应用(中国专利： 201510276758.2)； 贺庆等人公 开了一种五倍子有效组分及其制备方法与用途(中国专利： 200710150159.1)。 但有关五倍 子有效部位的分离方法及其在溃疡性结肠炎治疗方面的应用未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于， 提供一种五倍子有效部位的分离方法及其用途， 该方法将五 倍子药材粉碎过筛， 回流提。

8、取， 合并提取液， 采用聚酰胺树脂为填料进行柱层析， 以不同体 积比的乙醇-水溶液进行洗脱， 并收集70洗脱液， 经液质联用测定， 得到五倍子有效部位 二-O-没食子酰基葡萄糖， 三-O-没食子酰基葡萄糖， 没食子酸乙酯， 四-O-没食子酰基葡萄 糖， 双没食子酸乙酯。 经药理研究表明： 五倍子有效部位对溃疡性结肠炎小鼠有明显的治疗 作用； 可显著提高溃疡组织中超氧化物歧化酶(SOD)、 降低丙二醛(MDA)、 髓过氧化物酶 (MPO)的含量， 并显著降低白介素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )炎 症因子的表达。 0005 本发明所述的一种五倍子有。

9、效部位的分离方法， 按下列步骤进行： 0006 a、 选用同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生在红麸杨、 青麸杨、 盐肤木植物 的叶子上形成的虫瘿作为五倍子药材； 0007 b、 将五倍子药材粉碎， 过60目筛， 称取80g药材粉末， 以240mL蒸馏水为溶剂回流提 取3次， 每次提取2.5h， 合并提取液； 0008 c、 将步骤b得到的提取液， 以聚酰胺树脂为填料进行柱层析， 以体积浓度10， 说明书 1/6 页 3 CN 111574571 A 3 30， 70的乙醇溶液进行梯度洗脱， 收集70的洗脱液并减压浓缩， 经液质联用测定， 得 到含二-O-没食子酰基葡萄糖， 三-O-没食子酰基。

10、葡萄糖， 没食子酸乙酯， 四-O-没食子酰基 葡萄糖， 双没食子酸乙酯的有效部位。 0009 所述方法获得的五倍子有效部位在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途。 0010 通过液质联用分析系统分析五倍子水提液中各成分， 表1列出了各成分分析信息。 0011 表1五倍子各成分分析信息 0012 0013 本发明所述的一种五倍子有效部位的分离方法及其用途， 该方法选用的是同翅目 蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生在红麸杨、 青麸杨、 盐肤木等植物的叶子上而形成的虫 瘿作为五倍子药材； 并采用聚酰胺树脂为填料分离出五倍子有效部位后用于治疗溃疡性结 肠炎小鼠， 结果表明五倍子有效部位具有防治炎症性肠病方面。

11、的成药潜力。 0014 为研究五倍子有效部位对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用， 采用葡聚糖硫酸钠 (DSS)构建结肠炎模型， 造模成功后用五倍子有效部位进行治疗， 以小鼠体重、 疾病活动指 数评分(DAI)、 脾重、 结肠长度、 粪便状态的变化作为评价指标， 并检测小鼠结肠组织中超氧 化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)、 髓过氧化物酶(MPO)的含量以及白介素-6(IL-6)、 白介素- 1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )等炎症因子的表达， 并对结肠组织进行HE染色。 试验结 果表明： 五倍子有效部位给药组动物溃疡基本愈合， 与模型动物相比较， 五倍子有效部位给 药动物组织。

12、中的超氧化物歧化酶(SOD)的含量显著增加(P0.001)， 丙二醛(MDA)、 髓过氧化 物酶(MPO)的含量的含量显著降低(P0.001)； 给药组血清中白介素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )等炎症因子的表达水平降低(P0.05)。 0015 本发明所述的一种五倍子有效部位的分离方法及其用途， 将五倍子药材粉碎过 筛， 称取80g药材粉末， 以240mL蒸馏水为溶剂回流提取3次， 每次提取2.5h， 合并提取液， 以 聚酰胺树脂为填料进行柱层析， 以体积浓度10， 30， 70的乙醇溶液进行梯度洗脱， 收 集70的洗脱液并减压浓缩， 经液质联。

13、用测定， 得到五倍子有效部位二-O-没食子酰基葡萄 糖， 三-O-没食子酰基葡萄糖， 没食子酸乙酯， 四-O-没食子酰基葡萄糖， 双没食子酸乙酯成 分。 经药理研究表明， 五倍子有效部位对溃疡性结肠炎小鼠有明显的治疗作用； 可显著提高 溃疡组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量， 降低丙二醛(MDA)、 髓过氧化物酶(MPO)的含量， 并显著降低白介素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )等炎症因子的表 达。 说明书 2/6 页 4 CN 111574571 A 4 附图说明 0016 图1为本发明五倍子有效部位的液相色谱图； 0017 图2为本发明五倍。

14、子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠体重 的影响及疾病活动指数评分(DAI)评分图， 其中数据表示为平均值S.D.#与对照组相比 P0.001； *与葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)组相比*P0.05， *P0.01， *P 0.001； a， 空白组； b,模型组； c,阳性药组； d， 五倍子有效部位给药组； 0018 图3为本发明五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠 长度、 粪便状态及脾指数的影响图， 其中数据表示为平均值S.D.#与对照组相比P 0.001； *与葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)组相比*P0.0。

15、5， *P0.01， *P 0.001； a为空白组； b为模型组； c为阳性药组； d为五倍子有效部位给药组； 0019 图4为本发明五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠 组织中超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)含量的影响图， 其中数据 表示为平均值S.D.#与对照组相比P0.001； *与葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠 炎(UC)组相比*P0.05， *P0.01， *P0.001； a为空白组； b为模型组； c为阳性药组； d为五 倍子有效部位给药组； 0020 图5为本发明五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃。

16、疡性结肠炎小鼠血清 中白介素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )的表达的影响图， 其中数 据表示为平均值S.D.#与对照组相比P0.001； *与葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结 肠炎(UC)组相比*P0.05， *P0.01， *P0.001； a为空白组； b为模型组； c为阳性药组； d为 五倍子有效部位给药组； 0021 图6为本发明结肠组织病理学评估(比例尺200 m)图， 其中a为空白组； b为模型组； c为阳性药组； d为五倍子有效部位给药组。 具体实施方式 0022 实施例1 0023 五倍子有效部位的分离： 0024 a、 选用。

17、同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生在红麸杨、 青麸杨、 盐肤木植物 的叶子上形成的虫瘿作为五倍子药材； 0025 b、 将五倍子药材粉碎， 过60目筛， 称取80g药材粉末， 以240mL蒸馏水为溶剂回流提 取3次， 每次提取2.5h， 合并提取液； 0026 c、 将步骤b得到的提取液， 以聚酰胺树脂为填料进行柱层析， 以体积浓度10， 30， 70的乙醇溶液进行梯度洗脱， 收集70的洗脱液并减压浓缩， 经液质联用测定， 得 到9.8g的五倍子有效部位， 即： 二-O-没食子酰基葡萄糖， 三-O-没食子酰基葡萄糖， 没食子 酸乙酯， 四-O-没食子酰基葡萄糖， 双没食子酸乙酯成分。 002。

18、7 实施例2 0028 将实施例1得到的五倍子有效部位在治疗溃疡性结肠炎方面的实验研究： 0029 目的： 研究五倍子有效部位对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用； 0030 方法： 采用葡聚糖硫酸钠(DSS)构建结肠炎模型， 造模成功后随机分空白组、 模型 组、 阳性药组和五倍子有效部位给药组， 小鼠自由饮用4葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液18天后， 说明书 3/6 页 5 CN 111574571 A 5 以小鼠体重、 疾病活动指数评分(DAI)、 脾重、 结肠长度、 粪便状态的变化为评价指标， 检测 小鼠结肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的含量以及白 介素。

19、-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )等炎症因子的表达， 并对结肠 组织HE染色进行病理学评估； 0031 实验材料与方法： 0032 动物及分组： 0033 昆明小鼠(雌雄对半)， 由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供(SCXK(新) 0034 2014-0001)， 食用标准颗粒状饲料， 适应性饲养1周后进行实验。 随机分为空白组 (a)、 模型组(b)、 阳性药组(c)和五倍子有效部位给药组(d)， 每组8只； 0035 药物与试剂： 0036 五倍子药材购买于陕西汉中， 由韩博教授(石河子大学药学院)鉴定为五倍子 (Rhus chinensi。

20、s Mill.)， 乙腈(色谱级， Fisher Scientific)； 甲酸(优级， 天津光复精细 化工研究所)； 肿瘤坏死因子- ELISA kit(Cat.#m1002095-C， 上海酶联生物科技有限公 司)； 白介素-6ELISA kit(Cat.#m1002293-C， 上海酶联生物科技有限公司)； 白介素-1 ELISA kit(Cat.#m1063132-C， 上海酶联生物科技有限公司)； 髓过氧化物酶MPO ELISA Kit (Cat.#m1002070-C， 上海酶联生物科技有限公司)； 葡聚糖硫酸钠DSS(Q3526， 上海拜力生物 科技有限公司)； 5-氨基水杨酸(。

21、A129982-25g， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)； 丙二醛 MDA测试盒(20191221， 南京建成生物工程研究所)； 超氧化物歧化酶SOD测试盒(20191224， 南京建成生物工程研究所)； 0037 液质联用技术分析五倍子有效成分： 0038 使用液质联用对五倍子有效部位进行分析， 其条件为： X Bridge C18柱(19 150mm， 5 m， Waters)； 流动相A为0.2甲酸水溶液， B为乙腈； 梯度洗脱程序为0-4min 93- 93A； 4-35min 93-80A； 35-50min 80-70A； 50-60min 70-0A； 流速： 17mL/ mi。

22、n； 进样量： 1mL； 0039 图1是通过液质联用技术分析五倍子有效部位， 检测含有质荷比为483.2170、 635.2994、 197.0735、 787.1998、 349.1047成分， 结合文献分析可知， 质荷比为483.2170是 二-O-没食子酰基葡萄糖、 质荷比为635 .2994是三-O-没食子酰基葡萄糖、 质荷比为 197.0735是没食子酸乙酯、 质荷比为787.1998是四-O-没食子酰基葡萄糖、 质荷比为 349.1047是双没食子酸乙酯； 0040 葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠模型： 0041 昆明小鼠(雌雄对半)32只， 23-25g，。

23、 分组称重标记， 从造模第一天开始给予模型组 小鼠4的葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液(g/v)自由饮用， 正常组小鼠则饮用无葡聚糖硫酸钠 (DSS)的蒸馏水； 0042 给药： 0043 小鼠随机分为4组， 每组8只： 正常组； 葡聚糖硫酸钠(DSS)组； 5-氨基水杨酸(5- ASA)组(100mgkg-1)； 五倍子有效部位给药组(150mgkg-1)； 造模第7天开始， 给药组以灌 肠方式给予相应药物干预， 葡聚糖硫酸钠(DSS)组和正常组以灌肠方式予以生理盐水进行 对照， 阳性组以灌肠方式予以5-氨基水杨酸(5-ASA)进行对照， 每日1次； 0044 临床评价及组织学分析： 说明书 4。

24、/6 页 6 CN 111574571 A 6 0045 每天记录所有小鼠体重、 粪便特征和便血情况进行疾病活动指数(disease activity index， DAI)评估； 疾病活动指数(DAI)值(体重下降+大便性状+大便隐血)/3， 评价标准见表2， 疾病活动指数(DAI)评分值越高， 表示结肠炎越严重； 0046 表2疾病活动指数评分标准 0047 0048 注： 正常大便:成形大便； 松软大便:不黏附于肛门的糊状、 半成形大便； 稀便:可黏 附于肛门的稀水样便； 0049 图2是五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠体重的影响 及疾病活动指数(DAI)评分：。

25、 与空白组相比， 模型组小鼠第7天体重开始下降， 随着造模天数 的增加， 模型组小鼠体重显著下降(P0.001)， 疾病活动指数评分显著上升(P0.001)。 在给 予溃疡性结肠炎小鼠阳性药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)之后可显著减 轻体重下降的情况和降低疾病活动指数(P0.001)。 0050 图3是五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠长度、 粪 便状态及脾指数的影响： 结肠长度缩短是结肠产生炎症的标志之一， 与空白组相比， 模型组 小鼠结肠明显缩短(P0.001)， 而在阳性药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1) 治疗下明显改。

26、善了结肠缩短的情况(P0.01)； 造模小鼠在第4天开始出现稀便、 血便， 阳性 药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)可以改善结肠炎小鼠稀便、 血便的情况； 结肠炎会导致动物脾脏肿大， 与空白组相比， 模型组脾肿大严重， 脾指数变化存在显著性差 异(P0.001)， 在阳性药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)治疗下能明显减轻 脾肿大(P0.001)。 0051 组织标本的制备及指标检测： 0052 小鼠给药的第19天， 颈椎脱臼处死， 取结肠组织并测量其长度， 随机选取一段结肠 组织置于福尔马林中固定后， 常规组织脱水、 石蜡中包埋、 切片、 用苏木精-伊红。

27、(H&E)染色， 进行组织学分析： 称量结肠组织并加入相应的磷酸盐缓冲液(PBS)1:9(w/v)进行匀浆， 收 集上清液， 测量超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的含量； 处死小 鼠前眼球取血， 分离血清3000r/min离心10min， -20保存备用， 按试剂盒说明书测定白介 素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )的表达； 0053 图4是五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中 超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)含量的影响。 超氧化物歧化酶 (SO。

28、D)和丙二醛(MDA)可间接反映组织中氧化损伤的程度； 髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细 胞炎性浸润的标志。 与空白组比较， 模型组小鼠溃疡组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量显 著降低(P0.001)， 而在阳性药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)给药后明显 提高溃疡组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量(P0.001)； 与空白组比较， 模型组小鼠溃疡 说明书 5/6 页 7 CN 111574571 A 7 组织中丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的表达显著增加(P0.001)， 而在阳性药5-氨基 水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)给药后显著降低溃疡组织。

29、中丙二醛(MDA)和髓过氧 化物酶(MPO)的表达(P0.001)； 0054 图5是五倍子有效部位对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠血清中白介 素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )的表达的影响： 与空白组比较， 模 型组小鼠血清中白介素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )的表达明显 增加(P0.001)， 而阳性药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)给药后降低了溃 疡组织中白介素-6(IL-6)、 白介素-1 (IL-1 )、 肿瘤坏死因子- (TNF- )的表达(P0.05)。

30、； 0055 图6是结肠组织病理学评估(比例尺200 m)； 通过形态学评价观察肠粘膜的炎症情 况： 与正常组相比， 模型组小鼠的肠粘膜存在明显的隐窝变形、 杯状细胞丢失、 黏膜损伤和 炎性细胞浸润。 经阳性药5-氨基水杨酸和五倍子有效部位(150mgkg-1)治疗后显著改善了 隐窝变形的延伸及炎性细胞的浸润； 0056 结果： 五倍子有效部位给药组小鼠的结肠溃疡基本愈合， 与模型组小鼠相比， 五倍 子有效部位治疗后可改善溃疡性结肠炎小鼠腹泻、 体重减轻、 结肠缩短、 脾肿大等情况， 此 外五倍子有效部位给药后小鼠结肠组织中的超氧化物歧化酶(SOD)的含量显著增加(P 0.001)， 丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的含量显著降低(P0.001)， 血清中白介素-6 (IL-6)、 白介素-1(IL-1 )、 肿瘤坏死因子-(TNF- )等炎症因子的表达水平降低(P 0.05)； 0057 结论： 五倍子有效部位对溃疡性结肠炎小鼠有明显的治疗作用。 说明书 6/6 页 8 CN 111574571 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 111574571 A 9 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 10 CN 111574571 A 10 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 111574571 A 11 。