基于介电泳的蛋白质富集方法及多生物探针快速检测系统.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010435943.2 (22)申请日 2020.05.21 (71)申请人 浙江大学 地址 310012 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 曹臻汪业叶宇鑫 (74)专利代理机构 杭州裕阳联合专利代理有限 公司 33289 代理人 姚宇吉 (51)Int.Cl. B01L 3/00(2006.01) G01N 1/40(2006.01) G01N 27/447(2006.01) (54)发明名称 一种基于介电泳的蛋白质富集方法及多生 物探针快速检测系统 (5。

2、7)摘要 本发明涉及一种高灵敏度、 多种分子同时检 测、 自动化微流体检测的基于介电泳的蛋白质富 集方法及多生物探针快速检测系统， 本发明由于 特定的电极结构以及2层纳米棒对电场的影响， 增强了电场的不均匀度， 使得其拥有更低的最小 检测极限值， 实现高灵敏度的生物分子检测； 通 过在不同检测区域内键合不同的生物分子， 然后 用这些特定的生物分子去检测， 本发明有4个检 测区域， 一次性检测多种生物分子， 节约样品与 时间， 提高检测效率； 使用微流控技术， 通过沟道 进样， 由于沟道尺寸较小， 从而所需样品量少， 进 样简单。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 111569962 。

3、A 2020.08.25 CN 111569962 A 1.一种基于介电泳的蛋白质富集方法， 其特征在于， 使用锯齿状检测电极结构和/或梯 形检测电极结构， 实现电势差的非均匀电场， 并且在检测区域生长多层纳米棒结构， 实现对 蛋白质的低电压富集。 2.根据权利要求1所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法， 其特征在于， 检测电极结 构结构可以是中间断开的梯形结构， 也可以是尖齿端一一相对的锯齿状结构； 所述的电极 结构是通过金属剥离lift-off工艺制备的。 3.根据权利要求1所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法， 其特征在于， 所述的多层 纳米棒是通过倾斜角沉积的方法制备的， 通过两次OA。

4、D和一次正面的蒸镀制得： 第一次通过 OAD方法生长出高度为200nm的二氧化硅纳米棒， 然后将沉积源换为银， 沿着二氧化硅纳米 棒生长高度为300nm的银纳米棒， 最后正面蒸镀一层二氧化硅层。 4.一种如权利要求1所述的基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系 统， 其特征在于， 包括基板、 进样口、 出样口、 检测电极、 接线电极、 纳米棒检测区域与提供反 应溶液流动的沟道； 接线电极与电源相连提供了检测区域的电信号； 检测电极位于接线电 极相对的端部。 5.根据权利要求4所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系 统， 其特征在于， 所述检测系统的制备方法是将已经。

5、蒸镀了电极和多层纳米棒的硅片与通 过倒模方式形成沟道的聚二甲基硅氧烷PDMS键合。 6.根据权利要求4所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系 统， 其特征在于， 所述接线电极包括多个电极组， 该电极组由一一对应的正电极与负电极组 成。 7.根据权利要求6所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系 统， 其特征在于， 所述正电极与负电极均为L形， L的长端端部相对处设置检测电极， 形成4个 检测区域。 8.根据权利要求6所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系 统， 其特征在于， 所述正电极与负电极分别为一长一短的L形， 相同朝向的L的上下面。

6、相邻处 设置检测电极， 形成4个检测区域。 9.根据权利要求6所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系 统， 其特征在于， 所述正电极与负电极的形状相同， 一端的端部带有尖角， 正电极与负电极 尖角相邻处设置检测电极， 多个电极组形成米字型。 10.根据权利要求4所述的一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测 系统， 其特征在于， 把带有不同捕获抗体的混合液一起注入沟道， 然后在不同的检测区域的 电极上施加不同的电压信号， 由于不同抗体产生介电泳效应最强的电压频率不同， 使得不 同检测区域富集不同的捕获抗体； 或者分批通入低浓度的捕获抗体溶液， 每次在不同的检测区域。

7、施加相应的电压信号， 每个检测区域富集相应的捕获抗体。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111569962 A 2 一种基于介电泳的蛋白质富集方法及多生物探针快速检测 系统 技术领域 0001 本发明涉及生物检测方法， 具体是一种高灵敏度、 多种分子同时检测、 自动化微流 体检测的基于介电泳的蛋白质富集方法及多生物探针快速检测系统。 背景技术 0002 生物检测领域通常需要针对少量、 低浓度的样品进行操作。 样品的高效富集可有 效减少样品使用量， 降低检出限， 对于疾病早期诊断、 食品安全、 环境污染检测等具有重要 意义。 陈文学等利用生物素亲和素将适配子结合到微流控反应室内进行细胞捕获， 。

8、杨柯利 用微流控芯片产生的浓度梯度从全血中筛选和富集了中性粒细胞， 杜敏等利用微流控芯片 和免疫探针芯片相结合的方法完成了免疫样品的富集。 上述文献中， 都成功对生物分子进 行了富集， 但是仍存在一些不足之处。 首先， 这些检测芯片需要机械部件(微泵、 微阀等)进 行驱动， 增加了与测定部件和进样部件集成的复杂度。 其次， 这些检测芯片的结构大都比较 复杂， 加工成本比较高。 本发明具有结构简单、 制作简便而且无需额外的机械部件等优点。 在生物检测和临床诊断等领域都有广泛的应用价值。 0003 生物分子的富集在生物学研究和临床诊断中有着重要作用。 通常细胞可以通过离 心等方法有效的富集， 而D。

9、NA通过PCR放大来富集， 蛋白质是生命活动中重要的化学物质， 比 如酶催化生物体中很多生化反应， 抗体在免疫中起到重要作用， 一些蛋白质参与细胞信号 传导、 细胞周期调控、 新陈代谢等。 对于蛋白质来说， 目前缺少非常有效的生化富集方法。 通 过蛋白质的富集， 能够有效提高检测的灵敏度， 对目标分子进行高效的分析。 0004 将溶液中的颗粒富集到固体表面有多种方法， 例如： 采用介电泳技术， 可以将标记 生物分子的绝缘体颗粒富集到金属电极表面； 采用激光辅助电泳技术； 采用磁场辅助介电 泳技术。 0005 介电泳通过非均匀电场对粒子的极化实现分子的操控。 介电泳的力与分子直径的 三次方成正比。

10、， 与电场平方的梯度成正比。 由于蛋白质的分子量非常小， 分子直径较小， 因 而介电泳的力较小， 通常的方法是通过提高电压来实现有效的富集。 然而高电压会存在电 化学反应和电极失效(electrode fouling)等缺点。 发明内容 0006 为了解决上述问题， 本发明提出一种基于介电泳效应的蛋白质富集方法， 使用锯 齿状结构和梯形结构， 首先实现较强的非均匀电场， 并且同时在检测区域生长多层纳米棒 结构， 极大地提高该区域电场梯度及介电泳力， 从而在很低的电压下实现高性能蛋白质富 集。 同时本发明提出一种基于该方法的多生物探针快速检测系统， 在芯片不同检测区域固 定不同的捕获抗体(Cap。

11、ture Antibody)， 能够实现对于不同生物标志物的并行化检测。 0007 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0008 一种基于介电泳的蛋白质富集方法， 使用锯齿状检测电极结构和/或梯形检测电 说明书 1/6 页 3 CN 111569962 A 3 极结构， 实现较强的非均匀电场， 并且在检测区域生长多层纳米棒结构， 实现对蛋白质的低 电压富集。 0009 介电泳效应是指电介质在非均匀电场中由于极化效应所产生的的位移现象， 这种 现象只与粒子和所处环境的电学性质和外加电场的梯度相关， 介电泳力的表达式如下： 0010 0011 0012 其中r是电介质粒子的半径， E是外。

12、加电场的电场强度， K是与粒子和环境的电学性 质相关的常数，p是粒子的复介电常数，m是所处环境的复介电常数。 当外加电场不均匀时， 产生的诱导偶极矩会与电场相互作用形成介电泳力， 使得粒子向电场强度较大或较小的方 向移动。 其中基于绝缘体的介电泳效应(iDEP)可以很好地处理小尺度范围内的粒子， 且生 物相容性较好， 其具体原理就是电场在绝缘体和环境中共同形成一个不均匀的电场， 实现 介电泳效应， 然而这种方式形成介电泳力通常需要的电压较高。 0013 进一步的， 所述的电极结构是通过lift-off工艺制备的。 用SU8光刻胶制备出相应 的形状， 后使用蒸镀设备分别蒸镀一层钛和金， 随后使用。

13、丙酮去除光刻胶， 这时光刻胶上面 的钛和金层也会一并移去， 从而留下所需的金电极结构。 0014 进一步的， 所述的多层纳米棒是通过OAD的方法制备的， 通过多次OAD和一次正面 的蒸镀制得： 第一次通过OAD方法生长出高度为200nm的二氧化硅纳米棒， 然后将沉积源换 为银， 沿着二氧化硅纳米棒生长高度为300nm的银纳米棒， 最后正面蒸镀一层二氧化硅层， 一方面增强介电泳效应， 起到绝缘效果， 同时方便后续的等离子体键合。 0015 一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系统， 包括基板、 进样 口、 出样口、 检测电极、 接线电极、 纳米棒检测区域与提供反应溶液流动的沟道； 。

14、接线电极与 电源相连提供了检测区域的电信号； 检测电极位于接线电极相对的端部。 0016 进一步的， 所述检测系统的制备方法是将已经蒸镀了电极和多层纳米棒的硅片与 通过倒模方式形成沟道的聚二甲基硅氧烷PDMS键合。 0017 进一步的， 所述接线电极包括多个电极组， 该电极组由一一对应的正电极与负电 极组成。 0018 见图4， 其中结构1可以提供在不同区域毫无干扰的检测， 但是不能在同一个显微 镜视野中观察到所有的变化。 结构2和结构3都可以在一个显微镜视野下观察多个蛋白质反 应的情况， 其中结构2可以同时观察2组， 结构3可以观察4组。 0019 进一步的， 所述正电极与负电极均为L形， 。

15、L的长端端部相对处设置检测电极， 形成 4个检测区域。 0020 进一步的， 所述正电极与负电极分别为一长一短的L形， 相同朝向的L的上下面相 邻处设置检测电极， 形成4个检测区域。 0021 进一步的， 所述正电极与负电极的形状相同， 一端的端部带有尖角， 正电极与负电 极尖角相邻处设置检测电极， 多个电极组形成米字型。 0022 进一步的， 把带有不同捕获抗体的混合液一起注入沟道， 然后在不同的检测区域 的电极上施加不同的电压信号， 由于不同抗体产生介电泳效应的电压频率不同， 使得不同 说明书 2/6 页 4 CN 111569962 A 4 检测区域富集不同的捕获抗体； 0023 或者分。

16、批通入低浓度的捕获抗体溶液， 每次在不同的检测区域施加相应的电压信 号， 每个检测区域富集相应的捕获抗体。 0024 本发明是基于多层纳米棒的介电泳效应， 这种结构在极化的绝缘体里面还存在一 个导体(银)， 而导体电荷都分布在其表面， 从而一定程度上使得绝缘体内部电场不均匀度 增加， 这样也会影响外边电场的分布， 同样提高了外部电场的不均匀度。 这一结构的提出一 方面在较低电压下同样可以形成介电泳效应吸引蛋白质分子， 另一方面极大地提高了蛋白 质富集的程度， 可以检测更低浓度的生物分子。 0025 本发明具有以下的有益效果： 0026 (1)检测的高灵敏度： 本发明中由于特定的电极结构以及2层。

17、纳米棒对电场的影 响， 增强了电场的不均匀度， 使得其拥有更低的最小检测极限值， 实现高灵敏度的生物分子 检测； 0027 (2)多种分子同时检测： 本发明通过在不同检测区域内键合不同的生物分子， 然后 用这些特定的生物分子去检测， 本发明有4个检测区域， 可以检测四种生物分子， 一次性检 测多种生物分子， 一定程度上节约样品与时间， 提高检测效率。 0028 (3)自动化微流体检测： 本发明使用微流控技术， 通过沟道进样， 由于沟道尺寸较 小(50 m高)， 从而所需样品量少(0.1mL)， 进样简单。 附图说明 0029 图1是本发明的一种结构示意图； 0030 图2是本发明的侧视图； 0。

18、031 图3是本发明检测电极的结构示意图； 0032 图4是本发明接线电极的结构示意图； 0033 图5是本发明的检测示意图； 0034 图6是多层纳米棒的制备流程图； 0035 图7是本发明电极的制备流程图； 0036 图8是本发明的检测系统的制备流程图。 0037 图中， 1.基板； 2.进样口； 3.接线电极； 4.检测电极； 5.出样口； 6.沟道。 具体实施方式 0038 下面结合附图和实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。 以下实施 例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0039 参见图1与图2， 本发明提供了一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快 速检。

19、测系统， 包括基板1， 在该基板1上制备有接线电极3与多层纳米棒区域， 该纳米棒区域 为检测区域， 接线电极3的端部为检测电极4， 基板1上还有提供反应溶液流动的沟道6、 进样 口2与出样口3。 0040 参见图3， 检测电极4可以是中间断开的梯形结构， 也可以是尖齿端一一相对的锯 齿状结构。 0041 参见图4， 接线电极3包括多个电极组， 该电极组由一一对应的正电极与负电极组 说明书 3/6 页 5 CN 111569962 A 5 成。 0042 接线电极可以是第一种结构， 即正电极与负电极均为L形， L的长端端部相对处设 置检测电极， 形成4个检测区域。 0043 接线电极也可以是第二。

20、种结构， 正电极与负电极分别为一长一短的L形， 相同朝向 的L的上下面相邻处设置检测电极， 形成4个检测区域。 0044 接线电极还可以是第三种结构， 正电极与负电极的形状相同， 一端的端部带有尖 角， 正电极与负电极尖角相邻处设置检测电极， 多个电极组形成米字型。 0045 其中结构1可以提供在不同区域毫无干扰的检测， 但是不能在同一个显微镜视野 中观察到所有的变化。 结构2和结构3都可以在一个显微镜视野下观察多个蛋白质反应的情 况， 其中结构2可以同时观察2组， 结构3可以观察4组。 0046 在实际应用中， 接线电极上的检测电极可以是梯形结构， 也可以是锯齿状结构。 0047 参见图5，。

21、 对于不同反应区域键合不同捕获抗体(cAb)， 本发明采用2种方法。 一种 是把带有不同捕获抗体的混合液一起注入沟道， 然后在不同的检测区域的电极上施加不同 的电压信号， 由于不同抗体产生介电泳效应的电压频率不同， 使得不同检测区域富集不同 的捕获抗体。 另外一种是分批通入低浓度的捕获抗体溶液， 每次在不同的检测区域施加相 应的电压信号， 这样每个检测区域就可以富集相应的捕获抗体(如图8)， 由于介电泳效应富 集的抗体浓度远高于溶液内部的， 所以在不加电压信号的情况下， 捕获抗体与芯片的检测 区域键合较少。 0048 其中进出样口提供样品的流入口和流出口， 沟道是提供样品流动的一个通道， 各 。

22、种蛋白质分子溶液留存在沟道中在反应区域反应。 接线电极与电源相连提供了检测区域的 电信号。 反应区域有大量的纳米棒， 在外接交流电源的情况下会在该区域形成很强的电场， 使得蛋白质分子由于介电泳效应聚集到该区域， 聚集后反应区域的蛋白质浓度很高， 且不 同的反应区域可以检测不同的蛋白质分子。 0049 实施例1 0050 参见图7， 首先在4英寸硅片上涂上SU8光刻胶， 掩膜为电极所需形状(锯齿状、 梯 形)， 使用光刻机制作SU8硅片模板。 通过电子束蒸镀的方式蒸镀金电极， 装置下方枪灯丝在 高压下发射电子束(electron beam)蒸发坩埚中原材料源(金、 银、 氧化硅等)。 控制蒸镀仪。

23、 器的蒸镀速度为2A/s蒸镀一层均匀10nm的钛， 改变蒸镀速度为1A/s蒸镀一层均匀25nm的 金。 然后把镀有金层的硅片泡在丙酮中一小时， 通过lift-off工艺除去电极以外的金层， 形 成带有电极的硅片基板。 0051 实施例2 0052 制备带有纳米棒的器件 0053 参见图6， 通过倾斜角层积(OAD)的方法制备电场增强的纳米棒区域。 玻璃衬底法 线方向与蒸汽方向成85 角(蒸镀角)。 原子蒸汽首先在衬底表面成核， 由于有限的表面原子 扩散和阴影效应， 这些表面的成核中心会继续生长为纳米结构。 通过旋转硅片衬底使蒸镀 电子束形成的纳米棒垂直于衬底表面生长， 旋转速度为10rpm。 。

24、调整蒸镀速度为3A/s旋转生 长200nm厚的二氧化硅层， 接着调整蒸镀速度为2.5A/s旋转生长300nm的银层。 最后调整蒸 镀角为0 ， 停止旋转， 垂直生长一层20nm的二氧化硅层， 蒸镀速度为3A/s。 形成带有纳米棒 的多蛋白质选择性检测芯片。 说明书 4/6 页 6 CN 111569962 A 6 0054 实施例3 0055 制备器件沟道在PDMS上的芯片 0056 参见图8， 首先通过在4英寸硅片上光刻SU8光刻胶， 制备出厚度为30-50um的SU8硅 片模板。 将PDMS基本组分与固化剂10:1混合后抽真空。 把抽完真空的纯净清澈的PDMS倒到 SU8硅片模板上， 放置。

25、于热板上80加热2小时。 再把固化后的PDMS从模板上面撕下来， 把整 块PDMS按照器件区域切成小块。 清洗PDMS， 依次用丙酮、 异丙醇、 去离子水清洗5分钟， 接着 用氮气吹干。 将清洗完毕的PDMS与带有纳米棒的硅片都用等离子体清洗(60s)后紧紧贴合 在一起， 实现两者的键合， 键合的方式是使用氧气等离子体分别氧化表面， 再将两者紧密贴 合在一起， 从而制作完成完整的检测芯片。 0057 实施例4 0058 使用芯片富集蛋白质(BSA) 0059 使用注册泵控制注射器速度为1uL/s， 注射100nM的带有荧光标记(Alexa 488)的 BSA溶液(溶剂为PBS buffer)进。

26、入沟道， 放置于显微镜下观察。 通过电极引出的银线连接外 部信号发生器， 其中电信号为20V、 1MHz的正弦波， 观察蛋白质的富集状态。 0060 实施例5 0061 使用芯片对单一蛋白质(羊IgG)的富集与检测 0062 通过注射泵控制注射器速度为1uL/s。 首先注射浓度为1mg/ml的PLL作为连接剂反 应1小时， 然后注入PBS buffer清洗残存在沟道里面和沟道内壁的PLL溶液， 保证连接剂只 在检测芯片上。 放置2小时风干沟道内的PBS buffer。 再注射进入缓冲溶液为PBS buffer浓 度为1ug/ml的羊IgG， 同时将上面两个电极都接通信号发生器， 其中电信号为2。

27、0V， 1MHz的正 弦波， 反应2小时。 再通入带有荧光标记的浓度为2ug/ml兔抗羊IgG， 缓冲溶液为PBS buffer， 反应1小时后， 用PBS buffer清洗并风干， 在显微镜下观察检测区域。 0063 实施例6 0064 使用芯片分两次键合羊IgG和鼠IgG 0065 通过注射泵控制注射器速度为1uL/s， 分别注射进入所需溶液。 首先注射浓度为 1mg/ml的PLL作为连接剂， 然后注入PBS buffer清洗残存在沟道里面和沟道内壁的PLL溶 液， 保证连接剂只在检测芯片上。 放置2小时风干沟道内的PBS buffer。 再注射进入缓冲溶 液为PBS buffer浓度为1。

28、ug/ml的羊IgG， 同时将上面两个电极都接通信号发生器， 其中电信 号为20V， 1MHz的正弦波， 反应2小时。 然后注入PBS buffer清洗5分钟。 风干后再注射进入缓 冲溶液为PBS buffer浓度为1ug/ml的鼠IgG， 同时将下面两个电极都接通信号发生器， 其中 电信号为20V， 1MHz的正弦波， 反应2小时。 然后注入PBS buffer清洗5分钟并风干得到键合 在不同区域的羊IgG和鼠IgG。 再注入缓冲溶液为PBS buffer的5的BSA溶液反应一小时。 注入PBS buffer清洗5分钟并风干。 0066 实施例7 0067 使用芯片同时键合羊IgG和鼠IgG。

29、 0068 设置注射泵为1uL/s的速度。 注射浓度为1mg/ml的PLL作为连接剂反应1小时， 然后 注入PBS buffer清洗并风干。 再注射缓冲溶液为PBS buffer的浓度都为20ug/ml的羊IgG和 鼠IgG混合液， 然后信号发生器分别给上下电极通电反应2小时， 其中上面电极电信号为 20V， 1MHz的正弦波， 下面为20V， 5MHz的正弦波， 分别键合羊IgG到上面电极所在位置的纳米 说明书 5/6 页 7 CN 111569962 A 7 棒， 鼠IgG到下面电极所在位置的纳米棒。 然后用PBS buffer清洗5分钟并风干。 再注入缓冲 溶液为PBS buffer的5。

30、的BSA溶液反应1小时。 注入PBS buffer清洗5分钟并风干。 0069 实施例8 0070 使用芯片检测羊IgG和鼠IgG 0071 设置注射泵为1uL/s的速度。 先通入带有荧光标记的浓度为2ug/ml兔抗羊IgG， 缓 冲溶液为PBS buffer， 反应1小时后， 用PBS buffer清洗并风干， 在显微镜下可以观察到上 面电极所在的检测区域变亮， 下面电极不亮。 再通入缓冲溶液为PBS buffer带有荧光标记 的浓度为2ug/ml的兔抗鼠IgG， 反应1小时后， 用PBS buffer清洗并风干， 在显微镜下观察到 下面电极所在的检测区域变亮。 再取一个已经键合羊IgG和鼠。

31、IgG的芯片， 调换通入兔抗羊 IgG和兔抗鼠IgG的顺序， 上下检测区域变亮的先后顺序也相应调换。 0072 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和优点。 本行业的技术人员应该 了解， 上述实施例不以任何形式限制本发明， 凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的 技术方案， 均落在本发明的保护范围内。 说明书 6/6 页 8 CN 111569962 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 111569962 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 111569962 A 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 111569962 A 11 图7 图8 说明书附图 4/4 页 12 CN 111569962 A 12 。