用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、H7亚型的引物组及试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010634992.9 (22)申请日 2020.07.03 (71)申请人 广西壮族自治区动物疫病预防控制 中心 地址 530000 广西壮族自治区南宁市友爱 北路51号 (72)发明人 何奇松马琳孔子荣颜健华 熊毅易春华莫胜兰胡丽萍 黄胜斌韩银华周庆安 (74)专利代理机构 广州海心联合专利代理事务 所(普通合伙) 44295 代理人 李哲瑜 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2。

2、006.01) (54)发明名称 用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚 型的引物组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了用于二重PCR同时检测马流感 病毒H3、 H7亚型的引物组， 包含马流感病毒H3亚 型引物对和马流感病毒H7亚型引物对； 其中， 所 述流感病毒H3亚型的引物对包括SEQIDNO.1所 示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物； 所述马流感病毒H7亚型引物对包括SEQIDNO.4 所示的上游引物和SEQIDNO.5所示的下游引 物。 本发明还公开了包含上述引物组的用于二重 PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂盒， 在 包括马流感病毒H3亚型引物对和马流。

3、感病毒H7 亚型引物对的基础上， 包含马流感病毒H3亚型探 针和马流感病毒H7亚型探针。 本发明提供的引物 组和试剂盒可实现一管同时检测H3、 H7两种亚型 的病原， 从而进行马流感亚型鉴别， 其检测灵敏 度高， 特异性强， 且相互之间不发生交叉反应。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 111635963 A 2020.09.08 CN 111635963 A 1.用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的引物组， 其特征是， 包含马流感病毒 H3亚型引物对和马流感病毒H7亚型引物对； 其中， 所述流感病毒H3亚型的引物对包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID。

4、 NO.2所示的下游引物； 所述马流感病毒H7亚型引物对包 括SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。 2.用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂盒， 其特征是， 包括马流感病毒 H3亚型引物对和探针、 以及马流感病毒H7亚型引物对和探针； 其中， 所述流感病毒H3亚型引 物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示， 下游引物序列如SEQ ID NO.2所示， 探针序列如 SEQ ID No.3所示； 所述马流感病毒H7亚型引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示， 下 游引物序列如SEQ ID NO.5所示， 探针序列如SEQ 。

5、ID No.6所示。 3.根据权利要求2所述的用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂盒， 其特 征是， 所述马流感病毒H3亚型的探针和马流感病毒H7亚型的探针的5 端和3 端分别标记发 光基团和非荧光淬灭基团。 4.根据权利要求3所述的用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂盒， 其特 征是， 所述发光基团为FAM、 VIC、 CY5、 JOE或NED， 所述非荧光淬灭基团为BHQ1、 BHQ2、 BHQ或 MGB。 5.根据权利要求2-4任一项所述的用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂 盒， 其特征是， 还包括2One Step RT-PCR缓。

6、冲液、 反转录酶和Taq聚合酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111635963 A 2 用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的引物组及试 剂盒 技术领域 0001 本发明涉及引物及其应用， 具体涉及用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型 的引物组， 同时还涉及了用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂盒。 背景技术 0002 马流行性感冒(简称马流感)是由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属 (Influenza)A型流感病毒引起的一种急性高度接触性呼吸道传染病， 是危害养马业及赛马 业最严重的疾病之一， 现已被世界动物卫生组织(。

7、OIE)列为B类疫病。 马流感病毒在亚型分 类上具有自己的特点， 目前为止， 根据马流感病毒抗原位点的不同只发现存在两个亚型分 别为H7N7和H3N8。 该病存在时间很长， 并在世界各地不同时间段都有暴发和流行的报道。 自 20世纪80年代以来， H7N7亚型EIV在世界各国均未分离到， 事实上马体内仍存在H7亚型的特 异性抗体， 说明H7亚型的病毒仍以亚临床形式存在， 且H3N8亚型马流感频繁暴发。 我国1974 年夏到1975年春首次有马流感暴发的报道， 经证明是由H7N7亚型流感病毒引起的； 1989年 春在我国又发现了由H3N8亚型流感病毒引起的马流行性感冒。 近些年来， 英国、 爱尔。

8、兰、 法 国、 德国、 比利时、 尼日利亚和美国多次报告了马流感爆发； 而在我国养马比较集中的北方 地区也频繁暴发马流感， 并有继续蔓延的趋势， 危害愈趋严重， 给我国养马业及赛马业造成 了很大的经济损失。 因此， 建立快速便捷、 准确可靠、 特异性好、 敏感性高的马流感诊断方法 对养马业及赛马业具有重要意义。 0003 至今为止， 国内外针对马流感病毒的鉴别诊断主要依靠病毒分离鉴定及血清学试 验等， 但这些方法存在一定局限性， 操作比较复杂， 耗时较长不能对病毒进行快速诊断， 不 利于马流感的及时有效防控， 所以目前检测马流感病毒主要是应用分子生物学方法。 分子 生物学尤其是PCR检测方法具。

9、有操作便捷、 特异性好、 敏感性高等优点， 使其在马流感的监 测和诊断中得到广泛应用。 近年来PCR技术在马流感诊断中应用越来越多， 但关于同时能鉴 别H3和H7亚型马流感病毒的二重荧光PCR检测方法还未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的是针对现有技术存在的问题， 提供了用于二重PCR同时检测马流感 病毒H3、 H7亚型的引物组。 0005 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是： 0006 用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的引物组， 包含马流感病毒H3亚型引 物对和马流感病毒H7亚型引物对； 其中， 所述流感病毒H3亚型的引物对包括SEQ ID NO.1所 示的上游。

10、引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物； 所述马流感病毒H7亚型引物对包括SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。 0007 本发明的另一目的是提供包含上述引物组的用于二重PCR同时检测马流感病毒 H3、 H7亚型的试剂盒。 说明书 1/6 页 3 CN 111635963 A 3 0008 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是： 0009 用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、 H7亚型的试剂盒， 包括马流感病毒H3亚型引 物对和探针、 以及马流感病毒H7亚型引物对和探针； 其中， 所述流感病毒H3亚型引物对的上 游引物序列如SEQ ID NO.1。

11、所示， 下游引物序列如SEQ ID NO.2所示， 探针序列如SEQ ID No.3所示； 所述马流感病毒H7亚型引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示， 下游引物序 列如SEQ ID NO.5所示， 探针序列如SEQ ID No.6所示。 0010 马流感病毒H3亚型的探针和马流感病毒H7亚型的探针的5 端和3 端分别标记发 光基团和非荧光淬灭基团。 发光基团如FAM、 VIC、 CY5、 JOE、 NED， 非荧光淬灭基团如BHQ1、 BHQ2、 BHQ、 MGB等。 0011 所述试剂盒还包括2One Step RT-PCR缓冲液(Buffer)及反转录酶 (PrimeScri。

12、pt RT Enzyme Mix)和Taq聚合酶(TaKaRa Ex Taq HS)。 0012 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0013 (1)本发明针对当前马流感病毒的H3、 H7两种亚型的HA基因， 通过序列比对分析， 设计了两对特异性引物对及相应的探针， 引物对之间序列相对保守， 作为同时进行马流感 病毒H3、 H7亚型二重荧光RT-PCR检测的引物组， 可实现一管同时检测H3、 H7两种亚型的病 原， 从而进行马流感亚型鉴别， 其检测灵敏度高， 特异性强， 且相互之间不发生交叉反应。 0014 (2)本发明提供的引物组和相应的探针用于荧光定量PCR同时检测马流感病毒H3、 H。

13、7两种亚型， 可提高检查的灵敏度， 避免假阴性的出现。 所提供的检测试剂盒操作便捷， 自 动化程度高， 可用于替代传统病毒分离的方法来获得检测结果。 该试剂盒所需试剂较少， 可 在一定程度上节约成本， 其操作过程也较为简便， 减少重复操作的过程， 有效避免因操作不 当引起的污染， 节省人力、 物力及时间， 实现了快速筛查， 检测效果好， 敏感性高， 特异性强， 成本低， 扩增效率高等优点。 0015 (3)本发明使用基因特异性引物、 逆转录和荧光PCR反应在一管内完成， 操作简便， 通过直接探测PCR反应过程中荧光信号的变化来获得定量的结果， 不需要进行PCR后处理或 电泳检测， 克服了传统P。

14、CR技术存在的易污染及假阳性问题， 可避免非特异性扩增， 适合大 批量样品的检测。 附图说明 0016 图1为本发明的方法检测马流感病毒H3亚型灵敏度的扩增曲线。 0017 图2为本发明的方法检测马流感病毒H3亚型的标准曲线。 0018 图3为本发明的方法检测马流感病毒H7亚型灵敏度的扩增曲线。 0019 图4为本发明的方法检测马流感病毒H7亚型的标准曲线。 0020 图5为本发明的方法特异性扩增曲线。 具体实施方式 0021 以下结合具体实例对本发明进行更进一步详细说明， 并非对本发明的限定， 本发 明的实施方式也并非只限于此。 下述实例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下 述。

15、实例中的试验材料， 如无特殊说明， 均可从常规生化试剂公司购买得到。 0022 实施例1马流感病毒H3、 H7亚型二重荧光RT-PCR的引物对、 探针的设计 说明书 2/6 页 4 CN 111635963 A 4 0023 根据GenBank上公布的马流感病毒H3、 H7亚型的HA基因的序列进行比对分析， 通过 NCBI Blast进行验证， 设计并合成了两对特异性引物及探针， 用于马流感病毒H3、 H7亚型二 重荧光RT-PCR的检测。 0024 马流感病毒H3亚型特异的扩增引物对及探针： 如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所 示， 探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所。

16、示， 具体如下： 0025 H3-F(SEQ ID No.1)： 5 -atggttgatgggtggtat-3 0026 H3-R(SEQ ID No.2)： 5 -tggttctttcaatcactctg-3 0027 H3-P(SEQ ID No.3)： 5 -ccgataccaaaactctgaaggaac-3 0028 马流感病毒H7亚型特异的扩增引物对及探针： 如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所 示， 探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示， 具体如下： 0029 H7-F(SEQ ID No.4)： 5 -accagcacactattgattt-3 0030。

17、 H7-R(SEQ ID No.5)： 5 -ttctctgtatttgctgtgat-3 0031 H7-P(SEQ ID No.6)： 5 -actagccatacaatcatcgtcaca-3 0032 经过多次实验验证， 采用上述引物对、 探针可对马流感病毒H3亚型及H7亚型进行 单独的检测， 上述2条探针的5 端和3 端分别对应标记FAM-BHQ1和VIC-BHQ2。 即检测马流感 病毒H3亚型的探针其5 端和3 端分别对应标记FAM和BHQ1， 检测马流感病毒H7亚型的探针 其5 端和3 端分别对应标记VIC和BHQ2。 另外， 2条探针5 端和3 端标记可以随意进行组合， 检测结。

18、果不受影响， 而单独检测一个病毒亚型时， 探针也可以选用其他荧光基团如CY5、 JOE、 NED等作为发光基团， 使用BHQ、 MGB等作为非荧光淬灭基团。 0033 实施例2检测试剂盒制备 0034 马流感病毒H3、 H7亚型荧光定量RT-PCR检测试剂盒包括以下成分： 0035 2One Step RT-PCR Buffer； PrimeScript RT Enzyme Mix； 0036 检测马流感病毒H3亚型的上游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示， 探针 的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示， 其中， 探针SEQ ID No.3的5 端和3 端标记为FA。

19、M和 BHQ1。 0037 检测马流感病毒H7亚型的上游引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示， 探针 的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示， 其中， 探针SEQ ID No.6的5 端和3 端标记为VIC和 BHQ2。 0038 其中， 上述所述的2One Step RT-PCR Buffer和PrimeScript RT Enzyme Mix 购自宝生物工程(大连)有限公司； 引物、 探针委托英潍捷基(广州)贸易有限公司合成。 0039 实施例3马流感病毒2种亚型荧光定量RT-PCR检测 0040 采用荧光定量RT-PCR同时检测马流感病毒H3,H7亚型的方法主要。

20、包括以下步骤： 0041 (1)样本的准备 0042 样品的总RNA提取可选用北京天根公司RNAsimple Total RNA Kit提取试剂盒进 行提取。 0043 (2)荧光定量PCR扩增 0044 采用实施例2制备的检测试剂盒配置反应体系， 其组分和体积优化后的配置方式 如表1。 0045 表1反应体系 说明书 3/6 页 5 CN 111635963 A 5 0046 0047 标准对照： H3亚型EIV阳性对照使用广西壮族自治区动物疫病预防控制中心从发 病马肺脏病料组织研磨后离心取上清液接种鸡胚分离得到的A/EQ/Guangxi/01/09(H3N8) 毒株鸡胚尿囊液提取的RNA替。

21、换样品RNA； H7亚型EIV阳性对照参考王秀荣等发表的A/ Equine/Jingfang/74-1(H7N7)毒株HA2基因序列由英潍捷基(广州)贸易有限公司人工合 成， 并已连接至pMD-18T载体， 命名为pMD-H7， -80保存。 阴性对照使用无核酸酶水。 0048 H7亚型EIV HA2基因氨基酸序列如下(SEQ ID No.7)： 0049 ggcctgtttggcgctatagcagggtttattgaaaatggttgggaaggtctggtcgacgggtggtacgg tttcaggcatcagaatgcacaaggagaaggaactgcagcagactacaaaag。

22、cacccaatcggcaattgatcagata accggaaagttaaatagactcattgagaaaaccaaccagcaatttgagctaatagataatgaattcactgaggtgg aaaagcagactggcaatttaattaactggaccaaagactccatcacggaagtatggtcttacaatgctgaacttat tgtggcaatggaaaaccagcacactattgatttggctgattcagagatgaacaggctgtatgagcgagtgaggaaa caattaagggaaaatgctgaagaggatggcactggttgctttg。

23、aaatttttcataaatgtgacgatgattgtatgg ctagtataaggaacaatacttatgatcacagcaaatacagagaagaagcgatgcaaaatagaatacaaattgaccc agtcaaattgagtagtggctataaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgctttttgcttcttgcc attgcaatgggccttgttttcatatgtgtgaagaacggaaacatgcggtgcactatttgtatataa 0050 扩增条件： 5025min,953min， 然后9515s， 5845s， 在5。

24、8进行荧光检测， 共 说明书 4/6 页 6 CN 111635963 A 6 进行40个循环。 0051 (3)收集荧光信号， 分别选择FAM、 VIC荧光检测模式， 基线调整取315个循环的荧 光信号， 以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线。 0052 (4)结果判定： 待测样品荧光增长曲线超过阈值线， 并呈现良好的对数增长， 则判 断为阳性， 如无典型的扩增曲线， 判断为阴性。 0053 本实施例中， 阈值为35， 当Ct值35， 有明显扩增曲线为阳性结果， Ct值40， 明显 扩增曲线为阴性结果。 0054 上述荧光定量PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如70。

25、00， 7300， 7500， 7900等)； Bio Rad实时PCR检测系统、 Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000， MX3000， MX3005)。 具体地， 以Thermo Fisher QuantStudio 7Flex荧光定量PCR仪为例， 第一 到第二条检测通过分别以FAM和VIC标记。 第一条检测通道检测H3亚型EIV， 其荧光染料FAM 的检测波长约为520nm； 第二条检测通道检测H7亚型EIV， 其荧光染料VIC的检测波长约为 560nm。 0055 实施例4灵敏度检测 0056 (1)标准品的制备 0057 H3亚型EIV标准品由A/EQ/Guan。

26、gxi/01/09(H3N8)毒株接种的鸡胚尿囊液参考RNA 提取试剂盒说明书提取病毒总RNA。 首先利用实施例1中设计的特异性扩增H3亚型EIV的引 物运用普通RT-PCR的方法扩增目的片段， 普通RT-PCR体系为25 L： PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1 L、 21Step Buffer 10 L、 RNase Free dH2O 6 L、 H3-F100nmol/L(1 L)、 H3-R 100nmol/L(1 L)、 RNA模板5 L， 反应程序： 第一步： 421h,945min,第二步： 95 45s ,5845s ,721min ， 第三步 ： 7。

27、210min ， 该步骤试剂均来自宝生物公司 PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒。 然后将普通RT-PCR产物利用宝生物公 司TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒直接对扩增的目的 基因进行DNA纯化获得H3亚型EIV阳性标准品， -80保存并测定初始浓度为11.2ng/ L， 目 的基因长度为130bp， 按照拷贝数copies/ l(ng/ l10-9)(6.021023)/(660DNA长 度)公式计算,初始标准品浓度拷贝数为7.861010copies/ l。 00。

28、58 H7亚型EIV标准品使用实施例3中pMD-H7质粒作为标准品， -80保存并测得其初 始浓度为26.0ng/ L， 按照拷贝数copies/ l(ng/ l10-9)(6.021023)/(660DNA长 度)公式计算,初始标准品浓度拷贝数为7.06109copies/ l。 0059 (2)灵敏度检测方法 0060 将H3亚型EIV标准品使用无核酸酶水作10倍的倍比稀释， 共稀释7个浓度， 获得 7.86109copies/ L至7.86103copies/ L的10倍梯度稀释H3亚型EIV阳性模板样品。 H7亚 型EIV标准品使用无核酸酶水作10倍的倍比稀释， 共稀释7个浓度， 使用。

29、7.06109copies/ L至7.06102copies/ L的10倍梯度稀释H7亚型EIV阳性模板样品。 0061 按照实施例3中步骤进行马流感病毒2种亚型荧光定量RT-PCR检测。 0062 结果表明： 如图1、 3所示， 本发明设计的引物组和探针检测马流感病毒H3亚型的检 测灵敏度为7860copies/ L， H7亚型的检测灵敏度为706copies/ L。 检测马流感病毒H3亚型 和H7亚型的阳性梯度样品对应的标准曲线图， 分别如图2、 4所示。 由图可知， 马流感病毒H3 亚型和H7亚型的R2值分别为0.993和0.998， 说明样品浓度与病毒拷贝数之间具有良好的线 说明书 5。

30、/6 页 7 CN 111635963 A 7 性关系。 0063 实施例5特异性检测 0064 (1)样品模板： 选择实施例4步骤(1)中的H3和H7亚型EIV标准品作为检测样品之 一； 择猪流感病毒H1、 禽H9亚型流感病毒和马H9亚型流感病毒株提取的RNA， 上述流感病毒 株均为广西壮族自治区动物疫病预防控制中心保存。 0065 (9)反应体系： 按照实施例3中表1进行配制， 之后进行荧光定量PCR扩增。 0066 结果表明， 所建立的同时检测马流感H3和H7亚型病毒的荧光定量PCR方法及其试 剂盒， 马流感病毒H3(图5的线1， CT值约为14.5)和H7(图5的线2， CT值约为10)亚型有明显扩 增曲线， 为阳性。 猪H1亚型流感病毒、 禽H9亚型流感病毒和马H9亚型流感病毒均为阴性结 果， 没有特异性的扩增， 表明设计的引物及探针特异性强， 如图5所示。 说明书 6/6 页 8 CN 111635963 A 8 图1 说明书附图 1/5 页 9 CN 111635963 A 9 图2 说明书附图 2/5 页 10 CN 111635963 A 10 图3 说明书附图 3/5 页 11 CN 111635963 A 11 图4 说明书附图 4/5 页 12 CN 111635963 A 12 图5 说明书附图 5/5 页 13 CN 111635963 A 13 。