含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶及其编码基因与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010639055.2 (22)申请日 2020.07.06 (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰 城路3号 (72)发明人 刘西莉苗建强杜晓冉张晋辉 金朵刘小飞高虎虎李文浩 汝冰璐 (74)专利代理机构 北京惟诚致远知识产权代理 事务所(普通合伙) 11536 代理人 王慧凤李巍 (51)Int.Cl. C12N 9/88(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1。

2、5/90(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶及其编码 基因与应用 (57)摘要 本发明公开了一种来自大豆疫霉病菌 (Phytophthorasojae)的含有FYVE结构域的腺 苷酸环化酶及其编码基因与应用。 本发明含有 FYVE结构域的腺苷酸环化酶PsZFAC具有SEQID No.4所示的氨基酸序列， 其编码基因具有SEQID No.3所示的核苷酸序列。 本发明PsZFAC蛋白的主 要作用是能够控制大豆疫霉孢子囊的形成。 本发 明提供的基因在控制大豆疫霉根腐病中具有很 高的应用价值。

3、， 以该蛋白为作用靶标， 开发的杀 菌剂对控制大豆疫霉根腐病的发生和流行具有 重要的实践意义。 权利要求书2页 说明书10页 序列表14页 附图4页 CN 111647590 A 2020.09.11 CN 111647590 A 1.一种含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶， 是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质： A1)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； A2)在如SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质； A3)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与大豆疫霉孢子囊和/或游动。

4、孢子产生相关的由A1)衍生的蛋白质； A4)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相似性在93以上， 优选在95以上， 更优选在 98以上且具有与如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。 2.编码权利要求1所示的PsZFAC蛋白的编码基因； 优选的， 所述编码基因为如下B1)或 B2)或B3)： B1)序列表中序列3中所述的核苷酸序列所示的DNA分子； B2)与a)所示的核苷酸序列的具有75以上或85以上或95以上同一性， 且编码权 利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子； B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交， 且编码权利要求1中所述蛋白质 。

5、的cDNA分子或DNA分子。 3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子； 优选的， 所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)： C1)如序列3所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75以上， 进一步优选在85以 上， 更优选在95以上且具有与如序列3所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序 列； C2)如序列3中所示的DNA序列转录的RNA序列。 4.与权利要求1所示的腺苷酸环化酶、 权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的 RNA分子相关的生物材料， 为下述D1)至D10)中的任一种： D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒； D2)含有权利要求2所述编码基因的重组。

6、载体、 或含有D1)所述表达盒的重组载体； D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、 或含有D1)所述表达盒的重组微生物、 或含有D2)所述重组载体的重组微生物； D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、 或含有D1)所述表达盒的转基 因植物细胞系； D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、 或含有D2)所述表达盒的转基因 植物组织； D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、 或含有D2)所述表达盒的转基因 植物器官； D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子； 优选的， 所述核酸分子为敲除权利 要求2所述编码基因的核酸分子， 或者沉默权利要求2所述。

7、编码基因的核酸分子； D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、 重组载体、 重组微生物或转基因植物细胞 系； D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子； D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、 重组载体、 重组微生物或转基因植物细胞 系。 权利要求书 1/2 页 2 CN 111647590 A 2 5.权利要求1所述的腺苷酸环化酶、 权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA 分子或权利要求4所述的生物材料在控制卵菌孢子囊形成和/或游动孢子产生中的应用； 优选的， 所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)， 最优选为大豆疫霉病菌 (Phytop。

8、hthora sojae)P6497。 6.一种抑制和/或杀灭卵菌生长的方法， 包括通过抑制卵菌中含有FYVE结构域的腺苷 酸环化酶的编码基因的表达或使其失活， 或抑制其RNA的翻译， 或抑制含有FYVE结构域的腺 苷酸环化酶的活性或使其失活， 抑制或阻断所述卵菌孢子囊形成或游动孢子产生， 从而达 到抑制和/或杀灭卵菌生长； 所述含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列； 所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)； 所述抑制卵菌中含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶的编码基因的表达或使其失活的方 法优选为将所述的编码基因敲除。 7.。

9、根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶的编 码基因为如SEQ ID No.3所示的DNA。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述方法用于抑制和/或杀灭大豆产生的 卵菌病害； 所述卵菌优选为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)P6497。 9.一种抑制或阻断卵菌孢子囊形成或游动孢子产生的方法， 其包括通过抑制权利要求 2所述的基因的表达或使其失活， 或抑制如权利要求3中所述的RNA序列的翻译， 或抑制如权 利要求1所述的腺苷酸环化酶的活性或使其失活， 抑制或阻断所述卵菌孢子囊形成或游动 孢子产生； 所述卵菌为大豆疫霉病菌(Ph。

10、ytophthora sojae)； 所述抑制权利要求2所述的基因的表达或使其失活的方法优选为将权利要求2所述的 基因敲除。 10.一种降低卵菌侵染寄主能力的方法， 是通过权利要求9所述的方法抑制或阻断孢子 囊形成或游动孢子产生， 达到降低卵菌侵染寄主能力的目的； 所述寄主为大豆。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111647590 A 3 含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种病原卵菌新型腺苷酸环化酶及其编码基因与应用， 特别涉及来自 大豆疫霉中含有FYVE的腺苷酸环化酶PsZFAC其编码基因与应用。 背景技术 0002 大豆疫霉(Phyto。

11、phthora sojae)是重要的土传植物病原卵菌之一， 于20世纪五十 年代的北美洲首次被世人所知， 其寄主范围非常窄， 仅能侵染的作物为大豆。 其侵染大豆从 根部开始进而侵染茎部， 在潮湿的条件下以及在密实或重度粘土土壤中都能生长， 可引起 大豆种子腐烂、 幼苗倒伏以及根茎枯萎和腐烂等， 在田间可导致严重的经济损失。 0003 大豆疫霉是一种半寄生营养型卵菌， 无性生殖通常产生三种无性孢子： 孢子囊、 游 动孢子和厚垣孢子； 孢子囊呈梨形， 每个孢子囊可以分化产生10-30个游动孢子； 游动孢子 是水生无细胞壁的， 通常寿命短(3-6小时)并迅速分化形成休止孢， 继而萌发产生菌丝。 大 。

12、豆疫霉主要通过利用游动孢子可趋向于寄主植物根部释放化合物这一特性侵染寄主， 同时 在植物根部表面形成休止孢， 继而休止孢所产生的芽管可通过穿透植物根部的方式进行侵 染。 游动孢子和孢子囊也可以通过飞溅传播到上部植物， 孢子囊和游动孢子作为病害循环 中主要的再侵染源， 在病害大规模流行中起着重要的作用。 0004 综上所述， 病原孢子囊的形成和游动孢子的产生是大豆疫霉侵染寄主所必需的过 程。 如果能够阻断孢子囊形成和游动孢子的产生， 就可以控制大豆疫霉病害循环中的再侵 染， 控制病害大规模流行。 发明内容 0005 通过发明人的研究发现， 大豆疫霉病菌中含有FYVE的腺苷酸环化酶与大豆疫霉病 菌。

13、孢子囊的形成和游动孢子的产生有关， 因此可以通过控制含有FYVE结构域的腺苷酸环化 酶来阻断孢子囊的形成和游动孢子的产生， 可以达到控制(抑制或阻断)大豆疫霉病害大规 模的传播和流行。 0006 因此， 本发明提供了一种大豆疫霉病菌中含有FYVE的腺苷酸环化酶， 名称为 PsZFAC， 其氨基酸序列为与如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或者与SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列相似性在93以上， 优选在95以上， 更优选在98以上且具有与如SEQ ID No.4 所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。 0007 一般来讲， 在同一物种中都包括同源且功能相同或相似的氨基酸序列(或蛋白质。

14、 序列)或核酸序列， 特别是必要氨基酸序列(必要蛋白质序列)或必要核酸序列， 它们的序列 不一定100相同， 原因在于同一物种不同菌株受地理条件， 外在环境如温度、 湿度以及栽 培品种等因素的影响， 容易发生包括无义突变在内的各种突变， 但因为其功能对该物种的 存活或生长的重要性， 上述突变不会或基本不会影响其功能的行驶。 因此即使在同一物种 中， 允许与本发明的腺苷酸环化酶的如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列在一定范围内存在 差异。 说明书 1/10 页 4 CN 111647590 A 4 0008 其中， 所本发明的氨基酸序列可以是如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个 。

15、或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列功能 相同的氨基酸序列。 0009 为了方便纯化， 也可以在如SEQ ID No.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得 到的融合蛋白质； 所述标签可以为Poly-Arg(RRRRR)、 Poly-His(HHHHHH)、 FLAG(DYKDDDDK)、 Strep-tag II(WSHPQFEK)、 c-myc(EQKLISEEDL)等标签。 0010 本发明的腺苷酸环化酶一般来源于自然界中大豆疫霉病菌中， 即一般来讲， 其为 天然产物， 也可以人工表达或者合成。 0011 在本发明中， 所述腺苷酸环化酶。

16、的氨基酸序列可以具体地如SEQ ID No.4所示。 SEQ ID No.4所示的蛋白质由1574个氨基酸残基组成， 其中， FYVE结构域的序列为自SEQ ID No.4的氨基端第1000-1083为氨基酸残基序列。 0012 本发明之二提供了上述腺苷酸环化酶的编码基因PsZFAC。 所述编码基因， 优选DNA 序列为SEQ ID No.3所示的DNA序列或者与如SEQ ID No.3所示的DNA序列的相似性在75 以上， 进一步优选在85以上， 更优选在95以上且具有与如SEQ ID No.3所示的DNA序列 相同功能的DNA序列， 如cDNA或重组DNA。 例如在本发明中， 所述腺苷酸环。

17、化酶的DNA序列包 括存在于大豆疫霉病菌不同菌株(例如大豆疫霉病菌P6497菌株)中的腺苷酸环化酶的DNA 序列。 0013 在本发明中， 腺苷酸环化酶的DNA序列(编码基因和cDNA)可以具体地如SEQ ID No.3所示。 0014 本发明之三提供了如上任意一种DNA序列转录得到的RNA序列。 如mRNA等。 优选RNA 序列为与如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75以上， 进一步优选 在85以上， 更优选在95以上且具有与如SEQ ID No.3所示的DNA序列转录的RNA序列相 同功能的RNA序列。 最优选RNA序列为如SEQ ID No.3所示的DNA。

18、序列转录的RNA序列。 0015 本发明之四提供与上述的腺苷酸环化酶、 编码基因或上述RNA分子相关的生物材 料， 为下述D1)至D10)中的任一种： 0016 D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒； 0017 D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、 或含有D1)所述表达盒的重组载体； 0018 D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、 或含有D1)所述表达盒的重组微 生物、 或含有D2)所述重组载体的重组微生物； 0019 D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、 或含有D1)所述表达盒的 转基因植物细胞系； 0020 D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物。

19、组织、 或含有D2)所述表达盒的转 基因植物组织； 0021 D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、 或含有D2)所述表达盒的转 基因植物器官； 0022 D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子； 优选的， 所述核酸分子为敲除 权利要求2所述编码基因的核酸分子， 或者沉默权利要求2所述编码基因的核酸分子； 其中， 所述敲除权利要求2所述编码基因的核酸分子包括序列如CCAAUGGGAUCGCCUUCGUACUU、 CCUCAAGGGCGCUAAGGUCUGCG和/或CCUACGUUCCGGCUGUGGUGCGG所示的RNA分子， 或者序列表中 说明书 2/10 页 5 CN 。

20、111647590 A 5 SEQ ID No.33、 SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示的编码所述RNA分子的DNA分子； 0023 D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、 重组载体、 重组微生物或转基因植物 细胞系； 0024 D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子； 0025 D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、 重组载体、 重组微生物或转基因植物 细胞系。 0026 本发明的目的之五是提供所述的腺苷酸环化酶、 及其编码基因或权利要求3所述 的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在控制(抑制或阻断)卵菌孢子囊形成和/或游动孢 子产生中的应用；。

21、 0027 优选的， 所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)， 最优选为大豆疫霉病 菌(Phytophthora sojae)P6497。 0028 本发明的目的之六为提供一种抑制和/或杀灭卵菌生长的方法， 所述方法包括通 过基因敲除， 或抑制RNA序列的翻译， 或抑制和/或腺苷酸环化酶的活性来抑制和/或杀灭所 述卵菌生长； 所述含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列； 所述DNA序列为能够编码所述的腺苷酸环化酶的DNA序列； 所述RNA为所述DNA序 列转录得到的RNA序列； 其中， 通过控制(抑制或阻断)孢子囊形成或游。

22、动孢子产生来抑制 和/或杀灭卵菌(Oomycota)生长； 所述卵菌为大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)。 0029 优选的， 所述腺苷酸环化酶的cDNA序列为如SEQ ID No.3所示的DNA序列。 0030 优选的， 所述方法用于抑制和/或杀灭大豆产生的卵菌病害。 0031 本发明还提供一种控制(抑制或阻断)卵菌孢子囊形成或游动孢子产生的方法， 其 包括通过抑制上述腺苷酸环化酶的编码基因的表达或者将所述编码基因敲除， 或抑制上述 的RNA的翻译， 或抑制和/或失活如所述的腺苷酸环化酶的活性来控制(抑制或阻断)卵菌孢 子囊形成或游动孢子产生； 所述卵菌为大豆疫霉病菌(Ph。

23、ytophthora sojae)。 所述卵菌优 选为大豆疫霉病菌P6497菌株 0032 本发明还提供降低卵菌侵染寄主能力的方法， 是通过权利要求所述的控制孢子囊 形成或游动孢子产生来降低卵菌侵染寄主能力； 所述寄主为大豆。 0033 上述控制大豆疫霉病菌形成孢子囊和产生游动孢子的方法， 通过敲除如上任意一 种DNA序列， 控制所述大豆疫霉病菌形成孢子囊和产生游动孢子的方法。 所述大豆疫霉病菌 包括大豆疫霉病菌P6497菌株。 0034 本发明的一个实施方式中， 其中上述基因敲除的方法采用基于CRISPR/Cas9的基 因敲除法。 0035 具体的， 基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是。

24、将目的基因的Donor载体和sgRNA及 Cas9共表达质粒转染大豆疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。 0036 其中， 所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、 筛选基因和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。 0037 优选的， 所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游1000bp的序列、 筛 选基因和待敲除目的基因的下游1000bp的序列的重组载体。 所述筛选基因为NPTII基因， 所 述目的基因上游1000bp的序列具有序列表中序列36的DNA序列,所述目的基因下游1000bp 的序列具有序列表中序列37所。

25、示的DNA序列。 说明书 3/10 页 6 CN 111647590 A 6 0038 sgRNA及Cas9共表达质粒表达的sgRNA序列分别为CCAAUGGGAUCGCCUUCGUACUU、 CCUCAAGGGCGCUAAGGUCUGCG和CCUACGUUCCGGCUGUGGUGCGG。 0039 优选的， sgRNA及Cas9共表达质粒为含有表达靶向待敲除目的基因的sgRNA的编码 DNA片段的CRISPR-Cas9系统表达载体， 其中， 靶向于PsZFAC基因sgRNA的编码DNA为序列表 中SEQ ID No.33、 SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的DNA。 0。

26、040 优选的， 所述sgRNA及Cas9共表达质粒是出发载体是将以PYF515为出发载体， 将 SEQ ID No.33、 SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的DNA片段分别插入PYF515的BsaI和 NneI酶识别位点之间， 得到表达sgRNA及Cas9的重组表达载体。 0041 本发明之七提供了一种检测大豆疫霉病菌中含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶转 达水平的方法， 其包括选取如上任意一种DNA序列中的任意一段80-300bp， 特别是150- 200bp长的靶标序列来进行反转录荧光定量PCR检测； 优选还包括内参序列。 所述大豆疫霉 病菌包括大豆疫霉病菌P6497。

27、菌株。 0042 本发明之八提供了一种用于扩增大豆疫霉病菌中含有FYVE结构域的腺苷酸环化 酶表达水平的引物序列， 即用于扩增靶标序列的引物序列， 优选所述引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示； 更优选所述内参序列的引物序列如SEQ ID No.13-14所示。 所述 大豆疫霉病菌包括大豆疫霉病菌P6497菌株。 0043 扩增编码如上腺苷酸环化酶的DNA序列全长或其上的任意一段DNA序列的一条引 物和/或引物对也属于本发明的保护范围。 0044 实验证明， 本发明所提供的腺苷酸环化酶在大豆疫霉病菌自身生长发育过程中起 作用， 利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化技。

28、术获得的敲除转化子不产生孢子囊和游动孢 子(大豆疫霉P6497与敲除突变体PsZFAC-T1的孢子囊形态图如图4所示)， 回补全长转化 子缺失表型恢复(回补转化子孢子囊与游动孢子形态图如图6所示)。 因此， 大豆疫霉病菌中 含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶PsZFAC可以调控孢子囊的形成和游动孢子的产生， 抑制该 蛋白的功能就可以控制大豆疫霉病害循环中的再侵染， 控制病害大规模流行。 本发明为进 一步研制大豆疫霉病菌发育过程和分子检测技术， 以及大豆疫霉病菌所导致的植物病害的 防治与研究提供了技术基础。 附图说明 0045 图1为大豆疫霉PsZFAC基因在大豆疫霉不同发育阶段(横坐标从左向右依。

29、次为： 菌 丝(My)、 孢子囊(Sp)、 游动孢子(Zo)、 休止孢(Cy)、 休止孢萌发(Cg)、 侵染大豆叶片1.5h、 3h、 6h、 12h、 24h、 48h)的表达模式分析图。 0046 图2为敲除载体示意图， 左侧为同源臂替换载体示意图， 右侧为sgRNA载体示意图。 0047 图3为大豆疫霉PsZFAC敲除突变体基因内部的PCR鉴定结果， 从左到右依次为敲除 突变体(PsZFAC-T1、 PsZFAC-T2和PsZFAC-T3)、 水、 野生型大豆疫霉菌株P6497。 0048 图4为野生型大豆疫霉菌株P6497、 PsZFAC基因敲除突变体PsZFAC-T1孢子囊形 态图，。

30、 标尺200 m。 0049 图5为PsZFAC关键结构域截短片段示意图， 从上往下依次为PsZFAC基因全长片段 结构域示意图、 截短第一个CHD结构域的片段示意图(即CHD1)、 截短第二个CHD结构域的 片段示意图(即CHD2)、 截短两个CHD结构域的片段示意图(即CHD1&2)、 截短FYVE结构域 说明书 4/10 页 7 CN 111647590 A 7 的片段示意图(即FYVE)和截短PH结构域的片段示意图(即PH)。 0050 图6为回补转化子孢子囊和游动孢子形态图。 从第一排开始从左往右依次为野生 型大豆疫霉菌株P6497、 PsZFAC敲除转化子、 PsZFAC全长回补转。

31、化子和PsZFAC关键结构域截 短回补转化子， 标尺50 m。 0051 图7为菌落形态和菌丝生长速率测定图。 图7A从左往右依次为野生型大豆疫霉菌 株P6497、 PsZFAC敲除转化子的菌落形态图， 图7B为PsZFAC敲除转化子的菌丝生长速率测定 图。 0052 图8为菌饼接种大豆叶片侵染48h图和敲除突变体在大豆叶片致病性测定图。 图8A 从左往右依次为野生型大豆疫霉菌株P6497、 PsZFAC敲除转化子的菌饼接种大豆叶片侵染 48h图， 图8B为PsZFAC敲除转化子在大豆叶片致病性测定图。 具体实施方式 0053 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但不限定本发明。 下述实施例中。

32、的实验方 法， 如无特殊说明， 为常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从 商业途径得到。 0054 大豆疫霉野生型菌株P6497为美国Brett M.Tyler教授馈赠的大豆疫霉标准菌株。 以上菌株仅为本发明在实施例所使用的材料， 事实上， 在应用本发明所述筛选标记时， 可使 用任何商购途径获得疫霉菌菌株。 0055 上述菌株均已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。 0056 实施例1、 大豆疫霉中含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶PsZFAC基因的克隆 0057 1.1大豆疫霉总RNA提取 0058 大豆疫霉菌株P6497在10V8固体培养基上在25下黑暗培养。

33、4d后， 从菌落边缘 打取直径为5mm的菌饼接种在10V8液体培养基中， 25黑暗培养4d后收取菌丝， 取30mg左 右的菌丝， 至于2mL无霉无菌的离心管中， 并加入两颗直径5mm的钢珠， 液氮冷冻后使用球磨 仪研磨至粉末状。 采用Promega公司的SV Total RNA提取试剂盒(Z3100)提取大豆疫霉RNA， 具体方法步骤参考试剂盒中植物组织RNA提取的说明。 0059 1.2大豆疫霉反转录第一链cDNA的合成 0060第一链cDNA合成采用Takara公司的RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒(RR047A)进。

34、行。 具体步骤如下： 0061 (1)去除基因组DNA(10 L反应体系)： 5gDNA Eraser Buffer 2 L； gDNA Eraser 1 L； 总RNA 2 L； 无RNase的超纯水5 L。 0062(2)反转录反应(10 L反应体系)： 步骤(1)的反应液10 L； 5Buffer 4 L；Enzyme Mix I l L； RT Primer Mix l L； 无RNase的超纯水4 L。 0063 反应条件： 3715min； 855s； 4保存。 将获得的cDNA稀释4倍用于Real time PCR反应。 0064 1.3PsZFAC基因克隆 0065 设计克隆大。

35、豆疫霉中含有FYVE结构域的腺苷酸环化酶基因的引物， PsZFAC-F： ATGGTGGAGCAGCAGCAGAG(SEQ ID No.1)； PsZFAC-R： CTACTGCTGCGGGCTGACG(SEQ ID No.2)。 说明书 5/10 页 8 CN 111647590 A 8 以步骤1.2获得大豆疫霉cDNA和基因组为模板， 用上述引物进行PCR扩增， 将扩增产物回收 后分别与T1-simple Vector(北京全式金生物技术有限公司， 北京)连接， 并转化大肠杆菌 T1感受态细胞， 通过筛选出阳性克隆， 提取阳性克隆的质粒进行测序， 测序结果表明PsZFAC 基因cDNA具有。

36、序列表中序列3所示的核苷酸序列， 发明人通过对基因组扩增和测序表明， 其 编码基因与cDNA序列一致。 序列3由4725个核苷酸组成， 编码1574个氨基酸组成的蛋白质 (序列见SEQ ID No.4)， 将该蛋白质命名为PsZFAC。 其中， FYVE结构域的序列为自SEQ ID No.4的氨基端第1000-1083为氨基酸残基序列。 0066 实施例2、 PsZFAC基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达模式分析 0067 选用试剂盒： Takara TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNase H Plus) (Code： RR820A)。 用菌丝阶段cDNA。

37、样品分别稀释0、 4、 42、 43、 44、 45、 46倍， 以PsActin(引物序列 见SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14)为内参基因和PsZFAC为检测基因， 建立实时荧光定量PCR 标准曲线。 基因引物扩增效率需在90以上， 选取合适的稀释样品浓度进行下一步试验。 0068 以不同发育阶段和侵染阶段样品稀释4倍作为模板， PsActin为内参基因， 利用检 测引物PsZFAC-qPCR F/PsZFAC-qPCRR(序列见SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6)， 进行实时荧光 定量PCR检测。 qPCR反应体系为20 L： 10 L TB Green 。

38、Premix Ex Taq II、 1.6 L模板、 各0.8 L F/R引物、 6.8 L ddH2O。 反应程序为两步法： 95 30s； 955s， 60 30s， 40个循环。 通 过2- Ct计算PsZFAC基因在大豆疫霉不同发育阶段的相对表达量。 0069 结果如图1所述， 以大豆疫霉P6497菌丝阶段(My)进行归一化， PsZFAC在大豆疫霉 游动孢子阶段(Zo)和休止孢阶段(Cy)显著高表达， 休止孢萌发阶段(Cg)表达量降低； 而在 侵染阶段中， 仅在大豆疫霉侵染寄主24h时显著性高表达， 在6h、 12h和48h表达量显著性下 降。 0070 实施例3、 大豆疫霉PsZF。

39、AC基因的敲除转化子的获得 0071 3.1大豆疫霉PsZFAC基因的敲除载体的构建 0072 (1)获得候选sgRNA 0073 通过EuPaGDT(http:/grna.ctegd.uga.edu/)进行PsZFAC的sgRNA的设计， 在网站 中输入基因组全长进行搜索。 0074 (2)二级结构筛选 0075 利用网站工具 0076 (http:/rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/ Predict1.html)对候选sgRNA的二级结构进行分析， 选取形成发夹互补桥梁的个数小于等 于3个为候选sgRNA。 00。

40、77 (3)脱靶分析 0078 通过FungiDB(www.fungidb.org)对sgRNA进行脱靶分析， 输入包括PAM区域的共23 个碱基进行比对， 包含923(含NGG)完全匹配的情况， 认为脱靶的风险较高。 0079 (4)选取理想的sgRNA进行合成(表达sgRNA的DNA分子序列见SEQ ID No.33、 SEQ ID No .34和SEQ ID No .35， sgRNA序列分别为CCAAUGGGAUCGCCUUCGUACUU、 CCUCAAGGGCGCUAAGGUCUGCG、 CCUACGUUCCGGCUGUGGUGCGG。 分别靶向序列表中序列3的5 端第 4204-4。

41、226位核酸酸序列、 序列3的5 端第4503-4522位核酸酸序列、 序列3的5 端第104-126 位核酸酸序列。 说明书 6/10 页 9 CN 111647590 A 9 0080 (5)以PYF515(已发表载体， Fang Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Current Protocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)为骨架载体， 按照文献已发表方法 (记载于Fang。

42、 Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Current Protocols in Microbiology,44: 21A.1.1-21A.1.26.)构建sgRNA表达载体(结构如图2中sgRNA载体)。 sgRNA编码DNA退火处 理(30 L体系)： 3 L正义链， 3 L反义链， 3 L 10T4 DNA Ligase Buffer(NEB)， 2 L T4 Polynudeotide和19 L ddH2O， 37， 30。

43、min； 加入4 L 0.5M的NaCl， 100， 2min； 于室温缓慢 冷却约34h； 稀释1 L， 加入499 L ddH2O； 选用酶切位点BsaI和NneI酶切PYF515质粒， 使质 粒线性化； 连接质粒： 3 L稀释后退火处理的sgRNA片段编码DNA(序列见SEQ ID No.33、 SEQ ID No.34或SEQ ID No.35)， 2L 10T4 DNA Ligase Buffer(NEB)， 1L T4 DNA Polynudeotide， 50ng PYF515线性质粒， ddH2O补至20 L， 25， 30min。 将连接产物转入大肠 杆菌DH5 感受态细胞中。

44、， 冰浴30min、 热激42， 35s， 冰浴2min， 加入无抗性LB摇培60min， 将 菌液涂于带有Amp抗性的LB平板上， 37过夜培养后， 使用通用引物M13F(序列： TGTAAAACGACGGCCAGT)/RPL41-F(序列： CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG)扩增、 测序验证克隆。 将 验证正确的含有SEQ ID No.33所示片段的重组载体命名为PYF515-sgRNA1， 该载体表达靶 向序列表中序列3的5 端第4204-4226位核酸序列； 将验证正确的含有SEQ ID No.34所示片 段的重组载体命名为PYF515-sgRNA2， 该载体表达靶向序列。

45、表中序列3的5 端第4503-4522 位核酸序列； 将验证正确的含有SEQ ID No.35所示片段的重组载体命名为PYF515-sgRNA3， 该载体表达靶向序列表中序列3的5 端第104-126位核酸序列。 0081 (6)以大豆疫霉P6497基因组DNA为模板， 利用引物对(基因上游1000bp片段引物对 序列见SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、 基因下游1000bp片段引物对序列见SEQ ID No.11和 SEQ ID No.12)分别扩增目的基因上游1000bp片段(序列见SEQ ID No.36)和下游1000bp片 段(序列见SEQ ID No.37)； 以PY。

46、F515为模板， 利用引物对(序列见SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)扩增NPTII片段(序列详见Fang Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Current Protocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)。 以pBluescript II SK+为骨架载 体， 选择酶切位点EcoRI和BamHI(酶购自NEB公司)酶切pBluescript II SK+质粒， 通。

47、过In- fusion试剂盒(Takara Code No.639650)构建同源臂替换载体(结构如图2中Donor载体)。 利用HD Cloning Kit将三个扩增片段融合连接于克隆载体pBluescript II SK +(EcoRI和BamHI酶切)， 50， 15min后将连接产物转入大肠杆菌DH5 感受态细胞中， 冰浴 30min、 热激42， 35s， 冰浴2min， 加入无抗性LB摇培60min， 将菌液涂于带有Amp抗性的LB平 板上， 37过夜培养后， 使用通用引物M13F(序列： TGTAAAACGACGGCCAGT)/M13R(序列： CAGGAAACAGCTATGAC。

48、C)扩增、 测序验证克隆， 将验证正确的含有依次连接的PsZFAC上游 1000bp序列、 NPTII基因序列和PsZFAC下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-NPTII- PsZFAC。 0082 3.2大豆疫霉PsZFAC基因的敲除转化子的获得 0083 采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法获得PsZFAC基因的敲除转化子(记载于 Fang and Tyler,2016.Efficient disruption and replacement of an effector gene 说明书 7/10 页 10 CN 111647590 A 10 in the oomyc。

49、ete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9)。 具体为将3.1中构建的 sgRNA表达载体(PYF515-sgRNA1、 PYF515-sgRNA2和PYF515-sgRNA3分三组一起转入， 第一 组： PYF515-sgRNA1和PYF515-sgRNA2； 第二组PYF515-sgRNA2和PYF515-sgRNA3； 第三组 PYF515-sgRNA1和PYF515-sgRNA3)分别和同源臂替换载体pBS-NPTII-PsZFAC同时进行原生 质体转化， 转入大豆疫霉P6497中， 将生长出来的转化子经G418抗性V8平板上25培养筛 选， 从菌。

50、落边缘打取菌丝块接种在铺有玻璃纸的V8平板上， 25黑暗培养6d后刮取菌丝， 提 取转化子样品的DNA。 0084 利用三对引物进行敲除转化子的验证， 引物对PsZFAC-QCYZ-F1/R1(见序列表中序 列15和序列16)和PsZFAC-QCYZ-F3/R3(见序列表中序列19和序列20)用于基因是否发生替 换验证， PsZFAC-QCYZ-F2/R2(见序列表中序列17和序列18)用于基因内部的验证。 若 PsZFAC-QCYZ-F1/R1和PsZFAC-QCYZ-F3/R3对疑似转化子进行PCR扩增时有条带， 且PsZFAC- QCYZ-F2/R2对疑似转化子进行PCR扩增时无条带， 。