人工甲基营养型枯草芽孢杆菌及其构建方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010537846.4 (22)申请日 2020.06.12 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 刘龙陈坚堵国成李江华 吕雪芹高博 (74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通合伙) 32257 代理人 王玉仙 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 15/75(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 人工甲基营养型枯草芽孢杆菌及。

2、其构建方 法 (57)摘要 本发明公开了一种人工甲基营养型枯草芽 孢杆菌及其构建方法， 本发明选用B.subtilis WB600通过异源表达Mdh构建了人工甲基营养型 枯草芽孢杆菌， 使其具有了利用甲醇的能力， 并 通过对甲醇代谢途径关键酶的表达进行调控， 包 括Mdh和Hps的RBS优化、 表达质粒上5-UTR突变 的引入、 Ndh的强化表达循环再生Mdh辅因子 NAD+、 质粒与基因组双表达系统以及基因组表达 启动子的优化这几项策略， 使人工甲基营养型枯 草芽孢杆菌在含有甲醇的培养基中OD600增加 34.74， 达到6.84。 甲醇消耗量提高了38.79， 达4.09g/L。 同时甲醛。

3、积累量降低26.83， 为 3.05mg/L。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图1页 CN 111662857 A 2020.09.15 CN 111662857 A 1.一种人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的人工甲基营养型枯草芽孢 杆菌是在枯草芽孢杆菌中表达甲醇脱氢酶Mdh， 并强化表达甲醇脱氢酶Mdh、 3-己酮糖-6-磷 酸合成酶Hps和6-磷酸-3-己酮糖异构酶Phi， 以及过表达NADH脱氢酶Ndh； 其中， 所述的甲醇 脱氢酶Mdh、 3-己酮糖-6-磷酸合成酶Hps和6-磷酸-3-己酮糖异构酶Phi采用质粒和基因组 双系统表达。 2.根据权利要求1所述。

4、的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的甲醇脱氢 酶Mdh强化表达是通过在5 非翻译区域AGTGATAGC之后插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示 的序列， 以及将基因组中甲醇脱氢酶的启动子替换为启动子P325。 3.根据权利要求1所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的3-己酮 糖-6-磷酸合成酶Hps和6-磷酸-3-己酮糖异构酶Phi强化表达是通过在5 非翻译区域 AGTGATAGC之后插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列， 以及将质粒中3-己酮糖-6-磷 酸合成酶Hps的RBS替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的序列， 并将基因组中。

5、3-己酮糖- 6-磷酸合成酶Hps和6-磷酸-3-己酮糖异构酶Phi的启动子替换为启动子P325。 4.根据权利要求1所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的人工甲基 营养型枯草芽孢杆菌的宿主为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600。 5.根据权利要求1所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的质粒是以 pP43NMK-1为载体。 6.根据权利要求1所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的甲醇脱氢 酶的NCBI编号为EIJ80770.1， 3-己酮糖-6-磷酸合成酶的NCBI编号为NP_388228.1， 6-磷酸- 3-己酮糖异构酶的NCB。

6、I编号为NP_388227.1， NADH脱氢酶的NCBI编号为NP_389111.1。 7.一种甲醇依赖型人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述的甲醇依赖型人 工甲基营养型枯草芽孢杆菌是在权利要求16任一项所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆 菌的基础上， 敲除核酮糖-磷酸3-差向异构酶Rpe或核糖-5-磷酸异构酶RpiB。 8.根据权利要求7所述的甲醇依赖型人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 其特征在于， 所述 的核酮糖-磷酸3-差向异构酶Rpe的NCBI编号为WP_003232058， 核糖-5-磷酸异构酶RpiB的 NCBI编号为WP_003221910.1。 9.一种权利要求16任一项。

7、所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌的构建方法， 其特征 在于， 包括如下步骤： S1、 构建质粒pP43NMKmut-mdh3-act-rbs3hxlAB： 将3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6-磷酸- 3-己酮糖异构酶基因hxlAB的RBS替换为SEQ ID NO.9所示的序列后， 与甲醇脱氢酶的基因 一起连接到pP43NMK-1上， 并在5 非翻译区域AGTGATAGC之后插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列， 得到质粒pP43NMKmut-mdh3-act-rbs3hxlAB； S2、 构建重组菌B.subtilis WB600 containing pP43NMKmut-mdh3。

8、-act-rbs3hxlAB： 将 S1步骤得到的质粒转入枯草芽孢杆菌宿主中， 得到重组菌B.subtilis WB600 containing pP43NMKmut-mdh3-act-rbs3hxlAB； S3、 构建重组菌B.subtilis MH2 derivate,yogA:yogA-P325mut-mdh3,yclG:yclG- P43mut-act,tcyP:tcyP-P325mut-hxlAB： 在甲醇脱氢酶基因mdh3-act和3-己酮糖-6-磷酸 合成酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因hxlAB的5 非翻译区域AGTGATAGC之后插入核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示。

9、的序列， 然后分别与P325连接， 连接后分别转入S2步骤构建的重组菌 权利要求书 1/2 页 2 CN 111662857 A 2 基因组的yogA位点， yclG位点及tcyP位点之后； S4、 构建人工甲基营养型枯草芽孢杆菌B.subtilis MH3 derivate,ydgH:ydgH-P325- ndh： 将ndh基因与P325启动子连接后， 整合至S3构建的重组菌的基因组上， 得到所述的人工 甲基营养型枯草芽孢杆菌。 10.权利要求16任一项所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌在构建甲基营养型重组 菌株中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111662857 A 3 人工甲基。

10、营养型枯草芽孢杆菌及其构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一种人工甲基营养型枯草芽孢杆菌及其构建方法， 属于代谢工程技术 领域。 背景技术 0002 在生物工业生产中， 用于产物合成的微生物所需的主要碳源多以葡萄糖等糖类化 合物为主。 近年来， 糖类碳源的价格持续上涨， 且只能通过玉米等粮食物资进行生产。 而甲 醇作为一种可再生的清洁能源， 其产量丰富且价格低廉， 并且可通过储量丰富的甲烷或二 氧化碳进行生产。 天然甲基营养型微生物具有同化甲醇的能力， 因此可利用甲醇作为碳源。 但由于目前对天然甲基营养型微生物的代谢途径了解有限， 且缺乏对其进行遗传改造的分 子工具与技术手段， 导致天然甲。

11、基营养型微生物难以应用于生物工业生产。 0003 目前已有多种人工甲基营养型工程菌的构建， 包括大肠杆菌、 谷氨酸棒状杆菌和 酵母。 多数人工甲基营养型工程菌的构建都以RuMP途径为基础技术路线。 通过异源共表达 甲醇脱氢酶(Mdh)和核酮糖单磷酸途径的关键酶3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)和6-磷酸- 3-己酮糖异构酶(Phi)使工程菌具有利用甲醇作为碳源的能力。 甲醇首先被甲醇脱氢酶氧 化为甲醛， 之后甲醛与核酮糖-5-磷酸(Ru-5-P)被Hps缩合生成己酮糖-6-磷酸(H-6-P)， 然 后H-6-P被Phi转化为果糖-6-磷酸(F-6-P)， 最终F-6-P经由糖酵解(EMP)途。

12、径和三羧酸循环 完成甲醇的碳同化。 目前该技术路线已在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中验证成功， 并获得 人工甲基营养型大肠杆菌和人工甲基营养型谷氨酸棒状杆菌。 0004 为了进一步提高人工甲基营养型工程菌对甲醇的利用率和依赖性， 相关研究先后 在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中尝试开发甲醇依赖型工程菌， 包括以葡萄糖酸盐为辅助碳 源的甲醇依赖型大肠杆菌、 以D-木糖为辅助碳源的甲醇依赖型大肠杆菌或甲醇依赖型谷氨 酸棒状杆菌、 以D-核糖为辅助碳源的甲醇依赖型大肠杆菌或甲醇依赖型谷氨酸棒状杆菌。 但是目前以核酮糖单磷酸途径为基础的人工甲基营养型工程菌的研究当中， 普遍存在着甲 醇的利用率低及辅碳源消耗量高。

13、的问题。 0005 在目前的人工甲基营养型工程菌的相关研究当中， 关键酶的表达通常以质粒表达 系统为主， 具有操作简单、 外源蛋白表达高效等优点， 但同时质粒存在不稳定性。 甲醇代谢 途径作为外源引入的基础碳源代谢的途径， 仅依赖质粒表达系统时， 可能会因为质粒的不 稳定性而影响菌体对甲醇的利用， 尤其对于数代的传代表达是不利的， 并对菌体对甲醇的 利用产生影响。 并且， 此类人工甲基营养型工程菌中的关键酶Mdh为辅因子NAD+依赖型酶， 因此NAD+的含量会对Mdh的催化活性产生明显影响。 并且菌体胞内的NADH/NAD+的氧化还原 比例对于Mdh的NAD+依赖是不利的， 这直接影响了Mdh。

14、的催化能力并限制了此类人工甲基营 养型工程菌对甲醇的利用。 此外， 甲醇同化过程中的中间产物甲醛需要以Ru-5-P作为同化 载体缩合产生H-6-P。 因此Ru-5-P的含量与代谢合成可以直接影响人工甲基营养型工程菌 对甲醇的利用。 0006 目前人工甲基营养型工程菌的构建主要有大肠杆菌、 谷氨酸棒状杆菌和酵母为基 说明书 1/8 页 4 CN 111662857 A 4 础。 大肠杆菌为条件致病菌， 因此应用性受到了一定的限制。 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)属 于食品安全级菌种， 具有代谢模式清晰、 改造技术成熟等优点， 被广泛用于各种高附加值代 谢产物的生物工业生产， 并且， 枯草芽。

15、孢杆菌中天然含有RuMP途径中的关键酶Hps和Phi， 因 此， 构建一种高效、 稳定的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌成为亟待解决的问题。 发明内容 0007 为解决上述技术问题， 本发明提供了一种人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 选用 B.subtilis WB600通过异源表达Mdh构建了人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 使其具有了利 用甲醇的能力， 并通过对甲醇代谢途径关键酶的表达进行调控， 包括Mdh和Hps的RBS优化、 表达质粒上5-UTR突变的引入、 Ndh的强化表达循环再生Mdh辅因子NAD+、 质粒与基因组双 表达系统以及基因组表达启动子的优化这几项策略， 获得了一种高效、 稳定利用甲醇。

16、的人 工甲基营养型枯草芽孢杆菌。 0008 本发明的第一个目的是提供一种人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 所述的人工甲基 营养型枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌中表达甲醇脱氢酶(Mdh)， 并强化表达甲醇脱氢酶 (Mdh)、 3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(Phi)， 以及过表达NADH脱 氢酶(Ndh)； 其中， 所述的甲醇脱氢酶(Mdh)、 3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)和6-磷酸-3-己 酮糖异构酶(Phi)采用质粒和基因组双系统表达。 0009 进一步地， 所述的甲醇脱氢酶(Mdh)强化表达是通过在5 非翻译区域AGTGATAGC之 后插入核苷酸序列如S。

17、EQ ID NO.1所示的序列， 以及将基因组中甲醇脱氢酶的启动子替换 为启动子P325。 0010 进一步地， 所述的3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(Phi) 强化表达是通过在5 非翻译区域AGTGATAGC之后插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序 列， 以及将质粒中3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)的RBS替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所 示的序列， 并将基因组中3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(Phi)的 启动子替换为启动子P325。 0011 进一步地， 所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌的宿主为枯草。

18、芽孢杆菌 B.subtilis WB600。 0012 进一步地， 所述的质粒是以pP43NMK-1为载体。 0013 进一步地， 所述的甲醇脱氢酶的NCBI编号为EIJ80770.1， 3-己酮糖-6-磷酸合成酶 的NCBI编号为NP_388228.1， 6-磷酸-3-己酮糖异构酶的NCBI编号为NP_388227.1， NADH脱氢 酶的NCBI编号为NP_389111.1。 0014 本发明的第二个目的是提供一种甲醇依赖型人工甲基营养型枯草芽孢杆菌， 所述 的甲醇依赖型人工甲基营养型枯草芽孢杆菌是在所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌的 基础上， 敲除核酮糖-磷酸3-差向异构酶的基因rpe或。

19、核糖-5-磷酸异构酶的基因rpiB。 0015 进一步地， 所述的核酮糖-磷酸3-差向异构酶Rpe的NCBI编号为WP_003232058， 核 糖-5-磷酸异构酶RpiB的NCBI编号为WP_003221910.1。 0016 本发明的第三个目的是提供所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌的构建方法， 包 括如下步骤： 0017 S1、 构建质粒pP43NMKmut-mdh3-act-rbs3hxlAB： 将3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6- 说明书 2/8 页 5 CN 111662857 A 5 磷酸-3-己酮糖异构酶基因hxlAB的RBS替换为SEQ ID NO.9所示的序列后， 与甲醇脱氢酶。

20、的 基因一起连接到pP43NMK-1上， 并在5 非翻译区域AGTGATAGC之后插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列， 得到质粒pP43NMKmut-mdh3-act-rbs3hxlAB； 0018 S2、 构建重组菌B.subtilis WB600 containing pP43NMKmut-mdh3-act- rbs3hxlAB： 将S1步骤得到的质粒转入枯草芽孢杆菌宿主中， 得到重组菌B.subtilis WB600 containing pP43NMKmut-mdh3-act-rbs3hxlAB； 0019 S3、 构建重组菌B.subtilis MH2 derivate。

21、,yogA:yogA-P325mut-mdh3,yclG: yclG-P43mut-act,tcyP:tcyP-P325mut-hxlAB： 在甲醇脱氢酶基因mdh3-act和3-己酮糖- 6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因hxlAB的5 非翻译区域AGTGATAGC之后插入核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列， 然后分别与P325连接， 连接后分别转入S2步骤构建的 重组菌基因组的yogA位点， yclG位点及tcyP位点之后； 0020 S4、 构建人工甲基营养型枯草芽孢杆菌B.subtilis MH3 derivate,ydgH:ydgH- P325-ndh： 将n。

22、dh基因与P325启动子连接后， 整合至S3构建的重组菌的基因组上， 得到所述 的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌。 0021 本发明的第四个目的是提供所述的人工甲基营养型枯草芽孢杆菌在构建甲基营 养型重组菌株中的应用。 0022 本发明的有益效果： 0023 本发明选用B.subtilis WB600通过异源表达Mdh构建了人工甲基营养型枯草芽孢 杆菌， 使其具有了利用甲醇的能力， 并通过对甲醇代谢途径关键酶的表达进行调控， 包括 Mdh和Hps的RBS优化、 表达质粒上5-UTR突变的引入、 Ndh的强化表达循环再生Mdh辅因子 NAD+、 质粒与基因组双表达系统以及基因组表达启动子的优化这几项。

23、策略， 使人工甲基营 养型枯草芽孢杆菌在含有甲醇的培养基中OD600增加34.74， 达到6.84。 甲醇消耗量提高了 38.79， 达4.09g/L。 同时甲醛积累量降低26.83， 为3.05mg/L。 0024 此外， 本发明还以D-核糖和D-木糖为辅助碳源时构建甲醇依赖型枯草芽孢杆菌。 在D-核糖为辅助碳源时敲除rpe阻断非氧化磷酸戊糖途径， 获得以D-核糖为辅助碳源的甲 醇依赖型枯草芽孢杆菌； 在D-木糖作为辅碳源时敲除rpiB阻断非氧化磷酸戊糖途径， 获得 以D-木糖为辅助碳源的甲醇依赖型枯草芽孢杆菌。 附图说明 0025 图1是在表达质粒pP43NMK上引入5-UTR突变示意图；。

24、 0026 图2是通过Ndh强化表达使辅因子NAD+循环再生示意图； 0027 图3是甲醇依赖型枯草芽孢杆菌的构建示意图。 具体实施方式 0028 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施， 但所举实施例不作为对本发明的限定。 0029 表1菌株信息 说明书 3/8 页 6 CN 111662857 A 6 0030 0031 涉及的检测方法： 0032 使用分光光度计在600nm波长下检测菌体生长浓度(OD600)。 0033 通过Hantzsch反应的显色反应测定上清液中的甲醛浓度。 首先配置乙酰丙酮显色 剂， 680mL的乙酰。

25、丙酮显色剂各组分含量分别为： 50g的乙酸铵， 6mL的冰乙酸和0.5mL的乙酰 丙酮。 检测方法为： 400的uL待测样品中加入850uL乙酰丙酮显色剂混匀后于60加热15min 后， 冷却至室温， 利用分光光度计在414nm处测定吸光值。 0034 使用配备RID检测器和Aminex HPX-87H色谱柱的安捷伦高效液相色谱(HPLC)系统 测量上清液中甲醇， 葡萄糖， D-木糖和D-核糖的浓度。 用H2SO4(5mM)以0.6mL/min的流速洗脱 该柱。 0035 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析。 将待测菌体用超纯水洗涤三遍收集细胞， 并立即在液氮中冷冻。 纯化总RNA， 通。

26、过总RNA的反转录获得cDNA， 并将其用作qPCR的模板。 使用LightCycler 480II实时PCR仪器(Roche Applied Science， 曼海姆， 德国)进行qPCR反 说明书 4/8 页 7 CN 111662857 A 7 应， 将16S核糖体RNA用作相对定量因子。 0036 实施例1： 构建人工甲基营养型枯草芽孢杆菌 0037 由于枯草芽孢杆菌中具有RuMP途径的关键酶Hps和Phi， 因此在枯草芽孢杆菌中构 建以RuMP途径为基础的甲醇代谢途径只需进行异源Mdh的表达。 选用B.subtilis WB600为 底盘微生物， 以质粒pP43NMK-1为表达载体异。

27、源表达Mdh的基因mdh3-act(其中act为Act的 基因， Act为Mdh的激活蛋白， NCBI编号为Q8KP10.1， 可调节Mdh的活性， 增加甲醇亲和力， 氧 化速率， NAD+依赖性和Mdh的活性)构建人工甲基营养型B.subtilis M(表1)， 在含有10g/L 甲醇和5g/L葡萄糖的M9培养基中进行甲醇利用的生长验证， 以B.subtilis C(表1)为对照。 B.subtilis M的OD600最高为3.54， 提高了14.48。 随着菌体的生长B.subtilis M的甲醇消 耗量最高为1.8g/L， 对照组菌体对甲醇几乎没有消耗。 同时在B.subtilis M的。

28、生长过程中 培养基中存在不同程度的甲醛积累， 最高为6.37mg/L。 这些结果初步证明合成甲基营养型 B.subtilis M对甲醇的利用。 0038 实施例2： Hps-Phi的强化表达 0039 在人工甲基营养型工程菌中， Hps和Phi对甲醛的不可逆转化是将甲醇代谢途径平 衡向F-6-P形成的方向推进的驱动力， 且甲醛对菌体具有一定的毒性。 因此甲醛代谢对甲醇 的利用和菌体的生长都十分重要。 为了促进B.subtilis M对甲醇的利用及降低甲醛的积 累， 在本发明中利用启动子pP43NMK-1对B.subtilis M内源Hps和Phi的表达基因hxlAB进行 了强化表达， 获得了B。

29、.subtilis MH(表1)。 同样在含有10g/L甲醇和5g/L葡萄糖的M9培养基 中进行甲醇利用的生长验证。 结果表明强化表达Hps和Phi后菌体OD600最高为4.83， 提高了 36.26。 甲醇的消耗量为2.71g/L， 提高了50.81； 同时甲醛的积累量也有明显降低， 最大 甲醛积累量为4.28mg/L， 降低了32.89。 这些结果表明通过HPS和PHI的强化表达增加了 B.subtilis M对甲醇的利用。 0040 实施例3： 甲醇代谢途径关键酶在翻译和转录水平上的表达优化 0041 除了对关键酶的强化表达之外， 由于方便和高效， 在翻译或转录水平上调节关键 酶的表达也。

30、被广泛应用。 RBS是影响翻译水平的因素之一。 合理设计RBS可调节合成途径中 关键基因的表达水平， 进而影响关键酶的总体催化活性。 本发明中通过在线工具RBS Calculator v2.0针对Mdh和Hps在原始RBS的基础上分别预测并增设了四个不同强度的RBS (表2)， 并逐一分别对B.subtilis M和B.subtilis H(表1)中的RBS进行替换。 并以最终的催 化效果评估不同强度的RBS对基因有效表达的影响。 结果表明， 在相同条件下B.subtilis MR2(表1)催化甲醇产生甲醛产量始终高于其它组， 最高为2.54mg/L， 是对照B.subtilis M 甲醛产量。

31、的10.16倍。 在相同条件下30min时B.subtilis HR3(表1)的甲醛消耗量相比于对 照B.subtilis H提高了18.78。 尽管RBS的优化对Mdh和Hps的催化活性的影响程度不同， 但这一结果仍可以证明， 在B.subtilis中合理设计RBS是强化甲醇代谢途径中关键酶催化 活性的有效策略。 0042 表2 RBS序列 说明书 5/8 页 8 CN 111662857 A 8 0043 0044 上调RuMP途径基因的转录对甲醇同化率和甲醇耐受性至关重要， 如图1所示， 在 B.subtilis M和B.subtilis MR2中5 非翻译区域(5-UTR)插入一个73。

32、bp的片段， 获得 B.subtilis DM和B.subtilis DMR2。 结果表明， B.subtilis DM对甲醇的催化效果最好， 甲 醛产量最高为5.62mg/L， 是对照B.subtilis M的22.48倍， 同时是RBS优化结果B.subtilis MR2的2.21倍。 对B.subtilis DM和其对照B.subtilis M通过RT-PCR分析mdh的相对转录水 平， 结果表明B.subtilis DM的相对转录水平是B.subtilis M的97.90倍。 但对RBS优化后的 B.subtilis MR2中引入5-UTR突变后， 获得的B.subtilis DMR2。

33、甲醛的积累并没有提高。 可 能是由于将5-UTR突变位点后的序列(RBS)替换后， 使突变的作用消失。 因此为了保证5- UTR突变的效果， 突变位点之后的目的基因不能进行RBS的替换。 将5-UTR突变也引入Hps- Phi的表达质粒中进行验证， 结果表明， 引入5-UTR突变的B.subtilis DH对甲醛的消耗量 为19.6mg/L， 相比对照菌株B.subtilis H提高了30.32。 这表明在B.subtilis中， 通过对 甲醇代谢途径关键酶转录水平的调控可有效影响其催化活性。 在B.subtilis MH的基础上 将上述表达优化策略进行综合， 获得甲醇代谢途径强化的B.sub。

34、tilis MH2。 0045 其中， 5-UTR突变： 该种突变为在启动子和目的基因之间的5非编码的特定位点 (AGTGATAGC之后)插入一段特定序列GGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGTCGTCAACA TGTTCGAGGACATCGACACGTTCGAGGA(SEQ ID NO.1)。 0046 实施例4： 质粒与基因组双系统表达与启动子的优化及辅因子NAD+的循环再生 0047 由于质粒本身存在不稳定性以及可能造成工业上抗生素的高昂成本， 所以依赖质 粒进行甲醇代谢途径的表达和改造会影响甲醇代谢途径表达的稳定性及经济性。 并且可能 对合成甲基营养工。

35、程菌产物合成途径的引入和改造带来影响。 将甲醇代谢途径的关键基因 整合到基因组中以允许更稳定的表达， 尤其是数代的表达可能是有利的。 在本发明中通过 Cre/lox系统分别将Mdh和Hps-Phi的表达基因mdh3-act和hxlAB分别整合到基因组中。 以 P43启动子作为表达启动子， 并在启动子与目的基因之间引入5-UTR突变， 最终分别将此表 达基因簇整合至B .subtilis基因组中yogA位点， yclG位点及tcyP位点之后。 获得 B.subtilis GM和B.subtilis GH。 但Mdh和Hps-Phi的基因组表达导致其催化活性有不同程 度的降低。 启动子强度是控制基。

36、因表达的重要因素。 因此在本发明中选择了五个不同强度 的启动子分别对B.subtilis GM和B.subtilis GH中的P43启动子进行替换。 结果表明， 启动 子替换为P325的B.subtilis GM4的甲醛产量最高， 为0.39mg/L， 且相比于对照B.subtilis GM提高了88.11。 同时启动子替换为P325和P566的B.subtilis GH4和B.subtilis GH6的 甲醛消耗量最高， 分别为11mg/L和11.36mg/L。 相较于对照B.subtilis GH提高了65.54。 说明了在基因组上进行甲醇代谢途径关键酶的表达时， 通过不同强度启动子的替换。

37、可以有 说明书 6/8 页 9 CN 111662857 A 9 效调节关键酶的催化活性。 但与以质粒为载体进行关键酶的表达相比， 酶的催化活性仍有 不同程度的降低。 因此为了实现甲醇代谢途径较大通量的同时， 相对提高表达的稳定性， 在 B.subtilis MH2的基础上如上述方式将Mdh、 Hps和Phi再进行基因组的表达， 获得双系统表 达Mdh、 Hps和Phi的B.subtilis MH3。 在本发明中采用质粒及基因组双系统表达的策略。 0048 表3启动子 0049 0050 1.CRISPR-assisted multi-dimensional regulation for fi。

38、ne-tuning gene expression in Bacillus subtilis。 0051 由于MDH是NAD+依赖型醇脱氢酶， 因此菌体内NAD+的代谢循环供给对MDH的催化活 性非常重要。 在人工甲基营养型工程菌中通常可通过两种方式促进NADH的利用来循环供给 NAD+， 首先可以通过导入NADH依赖型的产物生产途径， 实现两种依赖型的互补循环。 另外还 可以通过强化表达电子传输链中含有的Ndh对NADH/NAD+的代谢平衡进行调控。 如图2所示， 在本发明中采用Ndh强化表达这一策略， 将B.subtilis内源ndh基因与P325启动子连接后， 分别整合至B.subtil。

39、is DM和B.subtilis GM4的基因组中， 获得B.subtilis DMN和 B.subtilis GM4N。 结果表明， B.subtilis DMN的甲醛产量达8.49mg/L， 相比于B.subtilis DM增长了26.99。 同时B.subtilis GM4N的甲醛产量达0.43mg/L， 相比于B.subtilis GM4 增长了32.31。 这些结果说明了在B.subtilis WB600内强化表达Ndh对Mdh的甲醇催化能 力有正向影响。 0052 在B.subtilis MH3的基础上进行Ndh的强化表达， 获得B.subtilis MH4。 并在M9培 养基(1。

40、0g/L甲醇， 5g/L葡萄糖)中进行甲醇利用的生长验证， 以B.subtilis MH为对照。 结果 表明B.subtilis MH4在17h时菌体OD600最高， 为6.84， 相比于B.subtilis MH的最高OD600增 长34.74。 甲醇消耗量最高为4.09g/L， 提高了38.79。 同时甲醛积累量最高为3.05mg/L， 降低26.83。 且与原始菌株B.subtilis C相比， 相同条件下菌浓提高120.75， 这些结果 说明经过一系列甲醇代谢途径的强化调控， 整体提高了菌体对甲醇的利用。 0053 实施例5： 甲醇依赖型枯草芽孢杆菌的构建 0054 本发明在B.sub。

41、tilis MH4的基础上进行甲醇依赖型B.subtilis的构建。 如图3a所 示， 首先选择以D-核糖作为辅碳源， 在不影响D-核糖代谢生产Ru-5-P的前提下， 选择敲除 rpe阻断非氧化磷酸戊糖(PPP)途径， 获得B.subtilis MH5。 在M9培养基(10g/L甲醇， 5g/LD- 核糖)中进行生长验证， 未添加甲醇为对照。 结果表明， 该条件下未添加甲醇时菌体无生长， 添加甲醇的条件下菌体生长， 最大OD600为0.47。 同时菌体的甲醇消耗量为0.42g/L， D-核糖 消耗量为1.56g/L， 甲醛最大积累量为8.95mg/L。 证明B.subtilis MH5为以D-。

42、核糖为辅助碳 说明书 7/8 页 10 CN 111662857 A 10 源的甲醇依赖型枯草芽孢杆菌。 0055 同时如图3b所示， 在本发明中也选择了以D-木糖作为辅碳源， 并敲除rpiB阻断非 氧化PPP途径， 获得B.subtilis MH6。 在M9培养基(10g/L甲醇， 5g/LD-木糖)中进行生长验 证， 未添加甲醇为对照。 结果表明， 该条件下未添加甲醇时菌体无生长， 添加甲醇的条件下 菌体生长， 最大菌体OD600为0.24。 菌体的甲醇消耗量为0.25g/L， D-木糖消耗量为0.8g/L， 甲 醛最大积累量为6mg/L。 证明B.subtilis MH6为以D-木糖为辅。

43、助碳源的甲醇依赖型枯草芽 孢杆菌。 0056 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例， 本发明的保护范 围不限于此。 本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明 的保护范围之内。 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说明书 8/8 页 11 CN 111662857 A 11 序列表 江南大学 人工甲基营养型枯草芽孢杆菌及其构建方法 17 PatentIn version 3.3 1 73 DNA （人工序列） 1 ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac acatggtcgt caacatgttc gaggacatcg 60 。

44、acacgttcga gga 73 2 22 DNA （人工序列） 2 gtaggataag acaagtctta ca 22 3 24 DNA （人工序列） 3 gagctaaaat taaggaataa ttat 24 4 19 DNA （人工序列） 4 gtaagagagg aatgtacac 19 5 28 DNA （人工序列） 5 ctaaattcac aaacaccagg taattgta 28 6 28 序列表 1/3 页 12 CN 111662857 A 12 DNA （人工序列） 6 taaccgctat tgaggaggga ggtacttc 28 7 33 DNA （人。

45、工序列） 7 gcaagcctgc atccaacaag gggtcagcac aat 33 8 19 DNA （人工序列） 8 gtaagagagg aatgtacac 19 9 23 DNA （人工序列） 9 aaaggacagt aaagggacac tcg 23 10 28 DNA （人工序列） 10 ggaccgcccc gaaagaacag acaatttt 28 11 27 DNA （人工序列） 11 ctcaaccgag aaaggggata ggaactt 27 12 80 DNA （人工序列） 12 序列表 2/3 页 13 CN 111662857 A 13 ttgagg。

46、aatc atagaatttt taatttaaat tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta 60 taatattctc atagtttgaa 80 13 80 DNA （人工序列） 13 ttgaggaatc atagaatttt taatttaaat tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta 60 taatctaagc tagtgtattt 80 14 81 DNA （人工序列） 14 ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttga caaaaatggg ctcgtgttgt 60 ataatattc。

47、t catagtttga a 81 15 75 DNA （人工序列） 15 ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttga caaaaatggg ctcgtgttgt 60 aaaattagtt gtgct 75 16 81 DNA （人工序列） 16 ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttgc ttaatcctac aattcttgat 60 ataatattct catagtttga a 81 17 76 DNA （人工序列） 17 aaaaaacggc ctctcgaaat agagggttga cactcttttg agaatatgtt atattatcag 60 aaaggaggtg ataaaa 76 序列表 3/3 页 14 CN 111662857 A 14 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 15 CN 111662857 A 15 。