六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010565393.6 (22)申请日 2020.06.19 (71)申请人 生态环境部华南环境科学研究所 地址 510655 广东省广州市黄埔区瑞和路 18号 (72)发明人 谢丹平贾文超胡克梅刘丽君 付建平尹文华黄忠辉 (74)专利代理机构 北京律谱知识产权代理事务 所(普通合伙) 11457 代理人 孙红颖 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) G01N 33/53(2006.01) (54)发明名称 一种六价铬的核酸适配体、 核酸适配体衍。

2、生 物及其用途 (57)摘要 本发明公开了一种六价铬的核酸适配体、 核 酸适配体衍生物及其用途， 六价铬的核酸适配体 序列为如下所示的DNA片段。 该核酸适配体可以 是各种同源性较高的类似序列或有本发明序列 得到的衍生物。 本发明的核酸适配体及其衍生物 可用于环境、 食品和生物有害因子的检测、 分离、 纯化及其他制品、 制备六价铬检测探针等。 具有 能够与六价铬高特异性和高亲合的结合力、 能够 化学合成、 性质稳定、 分子量小、 生物相容性好、 易于保存等优点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 111676226 A 2020.09.18 CN 111676226 A 。

3、1.一种六价铬(Cr6+)的核酸适配体， 其特征在于， 所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示： 序列： 5 -CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-3 。 2.如权利要求1所述的核酸适配体， 其特征在于， 所述核酸适配体的核苷酸序列上的某 一位置被磷酸化、 氧甲基化、 甲基化、 氨基化、 巯基化、 氟化或同位素化。 3.根据权利要求1所述的核酸适配体， 其特征在于， 所述核酸适配体的核苷酸序列上结 合有生物素、 地高辛、 荧光物质、 纳米材料、 聚乙二醇、 肽段、 蛋白、 酶或叶酸标记。。

4、 4.一种六价铬的核酸适配体衍生物， 其特征在于， 所述核酸适配体衍生物是权利要求1 或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架， 或者是权利要求 1或2或3中所述核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。 5.一种如权利要求13中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求4所述的核酸适配 体衍生物在用于环境有害因子检测中的用途。 6.一种如权利要求13中任一项所述的核酸适配体如权利4所述的核酸适配体衍生物 在用于六价铬分离与纯化中的用途。 7.一种如权利要求13中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求4所述的核酸适配 体衍生物在制备六价铬类检测探针中的用途。 权利要求书 1/1 页。

5、 2 CN 111676226 A 2 一种六价铬的核酸适配体、 核酸适配体衍生物及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种核酸适配体、 核酸适配体衍生物及其用途， 具体涉及一种可结合 六价铬的核酸适配体、 核酸适配体衍生物及其用途。 背景技术 0002 六价铬为吞入性毒物/吸入性极毒物， 皮肤接触可能导致过敏； 更可能造成遗传性 基因缺陷， 吸入可能致癌， 对环境有持久危险性。 六价铬是很容易被人体吸收的， 它可通过 消化、 呼吸道、 皮肤及粘膜侵入人体。 通过呼吸空气中含有不同浓度的铬酸酐时有不同程度 的沙哑、 鼻粘膜萎缩， 严重时还可使鼻中隔穿孔和支气管扩张等。 经消化道侵入时可引起呕。

6、 吐、 腹疼。 经皮肤侵入时会产生皮炎和湿疹。 危害最大的是长期或短期接触或吸入时有致癌 危险。 国家对水中的铬()的排放有着严格的规定。 目前， 水中的六价铬测定技术仍然以分 光光度法为主， 由于原子光谱测定六价铬需要进行离子分离， 导致步骤繁琐和影响分析速 度。 因此， 为了能够快速、 高效地检测水质中的六价格已成为一重大需求。 0003 核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体进化的系统进化技术(SELEX)筛选得 到的， 能够特异性结合靶标物质的单链寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。 核酸适配体与抗体功 能类似， 但是与抗体相比具有更多优势， 如具有更高的亲合力与特异性， 无。

7、免疫原性， 能够 化学合成、 成本低、 可进行标记、 稳定性好和易于保存等优点。 核酸适配体的靶分子更为广 泛， 包括金属离子、 有机小分子、 氨基酸、 核酸、 多肽、 蛋白质、 细胞和组织等， 并能从单一靶 标扩展至完成的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。 0004 但是， 目前尚未发现与六价铬具有高亲合力且低成本的核酸适配体。 如果获得一 种六价铬核酸适配体， 将有望提供一种新的检测六价铬的手段和扩展应用范围。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种能够与六价铬高特异 性和高亲合力结合、 能够化学合成、 生物相容性好、 分子量小、 稳定、 易于保存的六价铬的核。

8、 酸适配体、 核酸适配体衍生物及其用途。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为一种六价铬(Cr6+)的核酸适配体， 其特征在于， 所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示： 0007 序列： 0008 5 -CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-3 ； 0009 进一步地， 所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、 氧甲基化、 甲基 化、 氨基化、 巯基化、 氟化或同位素化。 0010 进一步地， 所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、 地高辛、 荧光物质、 纳。

9、 米材料、 聚乙二醇、 肽段、 蛋白、 酶或叶酸标记。 0011 进一步地， 所述核酸适配体衍生物所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的 硫代磷酸酯骨架， 或者是所述核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。 说明书 1/5 页 3 CN 111676226 A 3 0012 进一步地， 所述的核酸适配体衍生物在用于环境有害因子检测中的用途。 0013 本发明还提供了所述的核酸适配体衍生物在用于六价铬分离与纯化中的用途。 0014 本发明还提供了核酸适配体衍生物在制备六价铬类检测探针中的用途。 0015 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 0016 (1)本发明的核酸适配体可以高亲合力、 高特。

10、异性地结合六价铬， 具有稳定性好、 无毒性、 易于修饰等优点， 有利于大规模工业化生产及应用。 0017 (2)本发明的核酸适配体具有易修饰特性， 可以通过修饰信号物质， 将六价铬的紫 外吸收信号转化为其他信号(如荧光等)， 从而实现对六价铬的高灵敏度检测。 附图说明 0018 图1为本发明实施例中核酸适配体探针与Cr6+之间亲合力的测定结果。 0019 图2为本发明实施例中核酸适配体探针对Cr6+特异性的测定结果。 0020 图3为本发明实施例中无标记荧光核酸适配体探针对Cr6+的检测结果。 0021 图4为本发明实施例中核酸适配体纳米材料对Cr6+的可视化检测结果。 具体实施方式 0022。

11、 以下结合说明书附图和具体优选的实施对本发明作进一步描述， 但并不因此而限 制本发明的保护范围。 0023 实施例： 0024 一种本发明的六价铬的核酸适配体， 该核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列所 示的DNA片段， 即能够特异性结合六价铬的特征序列： 0025 5 -CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-3 0026 上述的核酸适配体的核苷酸序列选自天然存在或人工合成的序列， 或任何其他来 源的同样的序列。 0027 一种六价铬的核酸适配体序列， 该适配体的序列包含有与上述特征序列的核苷酸 的全部都相同。

12、的序列。 0028 上述核酸适配体核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、 氧甲基化、 甲基化、 氟化、 氨基化、 巯基化或同位素化。 0029 上述核酸适配体的核苷酸序列上可结合生物素、 地高辛、 荧光物质、 纳米材料、 聚 乙二醇、 肽段、 蛋白、 酶或叶酸标记(甚至连接上放射性物质等)。 0030 上述核酸适配体可衍生出其他的核酸适配体， 衍生出的核酸适配体的核苷酸序列 可以为以下三种序列中的任意一种： 0031 (1)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60以上(例如可将上 述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)； 0032 (2)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交。

13、的序列； 0033 (3)上述本实施所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。 0034 上述本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的骨架还可衍生出硫代磷酸酯骨架， 上述核酸适配体还可改造成相应锁核酸或肽核酸。 0035 上述本实施例的六价铬的核酸适配体具有以下用途： 环境、 食品和生物有害因 说明书 2/5 页 4 CN 111676226 A 4 子检测中的用途； 分离与纯化中的用途； 药物设计与开发中的用途； 制备六价铬类检 测探针中的用途。 0036 本实施例的上述六价铬CAS号为7440-47-3。 0037 上述本实施例的六价铬的核酸适配体主要利用磁珠捕获法进行筛选， 具体筛选过 程。

14、包括以下步骤： 0038 (a)优化核酸文库： 其中DNA文库的结构分为三部分。 中间是一段40个碱基的随机 序列； 随机序列的两侧是两条DNA手臂， 为20个固定碱基的PCR扩增所必须的序列， 同时5 端 的固定序列与固定探针(BDNA)进行互补杂交。 固定探针是一端标有生物素的与文库固定序 列互补的DNA链， 用于文库的固定。 0039 随机文库Lib: 0040 5 -ATTGGCACTCCACGCATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAT GCGTGCTACCGTGAA-3 (注： N代表A、 T、 C、 G中任一碱基)； 00。

15、41 5 引物： 5-ATTGGCACTCCACGCATAGG-3； 0042 3 引物： 5-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3； 0043 5 带荧光引物： 5 -FAM-ATTGGCACTCCACGCATAGG-3 ； 0044 3 带间隔臂的 引物 ： 5 -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-spacer18- TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 0045 BDNA固定探针： 5-CCTATGCGTGGAGTGCCAAT-biotin-3 0046 (b)初筛： 文库预处理方法： 将1.3nmol的文库(约1014条DNA链)、 2.9nmol B。

16、DNA溶于 289 L的DPBS缓冲液(0.9mmol/L CaCl2、 2.7mmol/L KCl、 1.5mmol/L KH2PO4、 0.5mmol/L MgCl2、 136.9mmol/L NaCl、 8.1mmol/L Na2HPO4)中， 95预变性10min， 之后以0.1每秒的 速度降温到60保持1min， 再以0.1每秒降温到25进行缓慢变复性。 将杂交文库加入到 已清洗5次的1mL量的链霉亲和素化磁珠颗粒中， 并在摇床内室温下孵育半小时。 接着使用 磁铁吸附磁珠， 并除去上清， 用400 L DPBS缓冲液对磁珠进行悬浮并清洗6遍。 然后加入六 价铬靶标溶液， 并将其放置摇。

17、床内在室温下孵育40min。 用磁铁吸附磁珠， 并回收上清溶液， 得到初筛核酸文库， 其中含有DNA与六价铬的复合物。 0047 (c)纯化： 将步骤(b)得到的初筛核酸文库进行PCR扩增， 扩增引物采用(a)中所列 的5 端带荧光引物与3 端带间隔臂的引物。 扩增产物使用SDS变性PAGE进行单链制备分离， 再通过煮胶、 正丁醇浓缩与透析形成次一级核酸文库。 其中， PCR反应扩增条件为： 95变性 30s， 60退火30s， 72延伸30s， 扩增N(最优轮数)个循环； 72延伸7min。 采用梯度PCR， 以 初始核酸文库作为模版优化退火温度， 最终得到退火温度为60。 而每轮筛选产物的。

18、最优 扩增轮数都是经过轮数优化获得的。 在轮数优化后， 将剩余的文库在相同条件下进行扩增。 将PCR后文库进行单链制备， 用于下一轮的筛选， 单链制备方法： 将PCR产物与正丁醇按体积 比为1： 5进行混合， 震荡混合30s， 在6000rpm下离心15s， 溶液呈现分层状态， 除去上层正丁 醇液体， 保留下层溶液， 并使得下层溶液体积约50 L， 往溶液中加入等体积的2TBE溶液， 并在95下加热10min。 趁热将样品上样到变性胶PAGE上， 使用300V电压进行跑胶20min， 在 紫外灯照射下对荧光条带进行切除收集， 并碎胶。 往碎胶中加入1.2mL DPBS缓冲液， 并在95 下煮泡。

19、15min， 离心， 收集上层清液， 重复12次。 往收集液中加入体积比为1： 5的正丁醇 溶液， 并震荡30s， 在6000rpm转速下离心3min， 移除上层正丁醇。 重复23次， 使得最后样品 说明书 3/5 页 5 CN 111676226 A 5 体积在100 L左右。 最后将样品在DPBS溶液中， 4冰箱过夜透析。 0048 (d)循环： 以上述得到的次一级核酸文库替代起始核酸文库并重复上述的步骤(b) (c)， 每次循环时使用新的链霉亲和素化磁珠， 直至的得到包含有与六价铬高亲和力和高 特异性结合的核酸适配体的核酸文库。 0049 (e)筛选效率评价： 采用qPCR测定筛选效率，。

20、 即筛选过程中DNA的富集情况。 检测信 号是DNA文库在qPCR过程中的Cq值， 转换为六价铬对文库的保留率。 首先， 制备一系列浓度 的核酸文库溶液， 并使用qPCR进行测定， 获取得到浓度与Cq值相关的线性方程。 然后， 再测 定六价铬竞争下来的DNA文库浓度， 根据测定量与投入量之比得到文库保留率。 筛选效率越 高， 保留率越高。 当保留率达到平台期时， 对文库进行克隆测序。 0050 考察1： 上述本实施例的六价铬与其核酸适配体之间的亲合力主要用qPCR方法进 行测定， 具体测定过程包括以下步骤： 0051 (1)测定核酸浓度与qPCR测定Cq值之间的标准曲线 0052 对核酸适配体。

21、探针浓度与qPCR测定的Cq值之间线性关系测定： 以DPBS为溶剂， 配 置不同浓度(1000,100,10,1,0.1pM)的核酸文库Lib溶液； 移取10 L上述溶液配好的溶液， 并加入2 L预配置好的mixture溶液(其中包含dNTP， evagreen酶， 前后向引物， 缓冲液)， 并 将其震荡混匀， 通过获得的Cq值与浓度对数进行线性拟合。 0053 (2)qPCR对探针与六价铬亲和力的测定： 0054 首先， 移取200 L包裹链霉亲和素磁性微球悬浮液， 然后使用磁铁吸附磁珠， 除去 上层清液， 并用200 L DPBS缓冲液清洗4次； 0055 使用DPBS配置2 L浓度为10。

22、0 M固定探针， 先与适配体探针进行孵育杂交， 再与上 述清洗后的链霉亲和素磁性微球孵育35min， 然后使用磁铁吸附磁珠并除去上清， 接着用 200 L DPBS缓冲液清洗2次， 并加入200 L DPBS重悬， 并将其5等份； 0056 分别往上述捕获了核酸适配体探针的磁珠悬浮液里加入等体积不同浓度(1、 4、 16、 64、 256 M)的六价铬溶液， 在室温下反应15min， 再使用磁铁吸附磁珠并移取上层溶液， 分别标号为1， 2， 3， 4， 5， 移取10 L上述反应标记的溶液至对应编号的qPCR管， 并往每个管中 加入2 L预配置好的mixture溶液(其中包含dNTP， eva。

23、green酶， 前后向引物， 缓冲液)， 然后 将其震荡混匀， 使用qPCR对溶液中的核酸进行定量分析， 将测定获取的Cq值带入进上述建 立的线性式中获得不同靶标浓度下竞争下来的适配体分子数， 并使用YBmax*X(Kd+X)(Y为 核酸分子的保留率， X为所用的六价铬的浓度， B是一个常数， max是最大值的意思)公式进行 拟合计算核酸适配体和靶标结合的Kd值。 如图1所示， 最后拟合得到的六价铬与其核酸适配 体Kd值为6.1 mol/L。 0057 考察2： 上述本实施例的六价铬与其核酸适配体之间的特异性主要用荧光恢复方 法进行测定， 具体测定过程包括以下步骤： 0058 (1)探针的设计。

24、 0059 六价铬核酸适配体3端标记Cy3荧光染料(适配体荧光探针)： 0060 5-CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC- Cy3-3； 0061 将适配体互补序列的5端标记BHQ-2荧光猝灭基团(猝灭探针)： 0062 5-BHQ-2-GCACGCATAGGCCAGAATCAGAGGCAACATTAGAGGGTGTGCTTGATTTGCCCTATGCG 说明书 4/5 页 6 CN 111676226 A 6 TGG-3； 0063 (2)特异性的测定： 以DPBS为溶剂， 分别配置浓度为2 M的适配体。

25、荧光探针与猝灭 探针的溶液， 各移取75 L体积进行混合并将其震荡混匀， 在室温下孵育30min备用。 将混合 溶液平均分为三等份(每份50 L)， 接着往三份溶液中里分别加入50 L浓度为2 M的六价铬 溶液(Cr6+)、 50 L浓度为6 M的硫酸铁溶液(阴性对照， Negative)、 以及50 L的筛选缓冲溶液 (空白对照， Blank)， 并在室温条件下反应10min， 接着将溶液转移至96孔板内， 使用多功能 扫描仪进行荧光发射光谱扫描， 获得上述3种反应溶液的荧光发射光谱曲线。 从图2中可以 看出， 该核酸适配体探针对Cr6+具有较高的反应特异性， 证明本专利提供的核酸适配体能够。

26、 对Cr6+以较高的特异性识别。 0064 考察3： 采用无标记荧光法对六价铬进行测定， 具体测定过程包括以下步骤： 0065 固定核酸适配体的浓度为2 M， 并往里加入等体积的2Evagreen染料并将其震 荡， 形成300 L的混合溶液。 将混匀后的溶液在95条件下加热10min， 然后降温至室温， 分 别加入终浓度为10nM、 20nM、 40nM、 80nM、 160nM的Cr6+溶液50 L。 结果如图3所示， 由荧光发射 光谱结果可见， 随着Cr6+的浓度增加， 荧光信号逐渐降低， 且荧光信号与Cr6+浓度之间呈现 良好的线性关系。 0066 考察4： 采用纳米材料聚集沉淀法对六价。

27、铬进行测定， 具体测定过程包括以下步 骤： 0067 此处选取十面体纳米银作为纳米材料， 移取125 L十面体纳米银， 并往里加入125 L浓度为10 M的核酸适配体溶液并震荡混匀， 在室温下反应30min后备用。 将上述溶液平均 分为5等份， 分别加入终浓度为50nM、 100nM、 200nM、 400nM、 800nM的Cr6+溶液50 L， 并在室温 下反应15min， 并转移至96孔板内放置与多功能全波长扫描仪进行测定。 由图4可以看出， 随 着Cr6+浓度的升高， 十面体纳米银本体的吸收值逐渐下降。 且该检测方法在50nM到800nM范 围内呈现良好的线性范围。 证明本专利提供的核。

28、酸适配体检测方法能够快速有效地测定六 价铬。 0068 以上所述仅是本发明的实施方式， 本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。 凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。 应该指出， 对于本技术领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰， 这些改进和润饰也应视 为本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 111676226 A 7 生态环境部华南环境科学研究所 一种六价铬的核酸适配体、 核酸适配体衍生物及其用途 7 SIPOSequenceListing 1.0 1 62 DNA 人工序列 1 ccacgcatag ggcaaatcaa gcacac。

29、cctc taatgttgcc tctgattctg gcctatgcgt 60 gc 62 2 80 DNA 人工序列 n=a或g或c或t 2 attggcactc cacgcatagg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 3 20 DNA 正向引物 3 attggcactc cacgcatagg 20 4 20 DNA 反向引物 4 ttcacggtag cacgcatagg 20 5 20 DNA 探针 5 cctatgcgtg gagtgccaat 20 6 序列表 1/2 页 。

30、8 CN 111676226 A 8 62 DNA 荧光探针 6 ccacgcatag ggcaaatcaa gcacaccctc taatgttgcc tctgattctg gcctatgcgt 60 gc 62 7 62 DNA 淬灭探针 7 gcacgcatag gccagaatca gaggcaacat tagagggtgt gcttgatttg ccctatgcgt 60 gg 62 序列表 2/2 页 9 CN 111676226 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 111676226 A 10 图3 说明书附图 2/3 页 11 CN 111676226 A 11 图4 说明书附图 3/3 页 12 CN 111676226 A 12 。