内切木聚糖酶突变体S45C08及制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010675795.1 (22)申请日 2020.07.14 (71)申请人 云南师范大学 地址 650500 云南省昆明市呈贡区聚贤街 768号 (72)发明人 张蕊周峻沛黄遵锡黎孔月 沈骥冬吴倩慕跃林 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 刘妮 (51)Int.Cl. C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R。

2、 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种内切木聚糖酶突变体S45C08及制备方 法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种内切木聚糖酶突变体 S45C08及制备方法和应用， 突变体S45C08的氨基 酸序列如SEQIDNO.1所示， 其最适pH为5.0， 最 适温度为65。 与野生酶相比， 突变内切木聚糖 酶S45C08在10.0mM的-Mercaptoethanol、 MgSO4、 ZnSO4、 CoCl2、 FeCl3和FeSO4中的活性、 在 3.030.0(w/v)的NaCl中的活性、 在15.0 30.0(w/v)的NaNO3中酶活性得到了改良。 本发 明的突变内切木聚糖酶。

3、S45C08可应用于酿造和 高盐环境下食品加工等生物技术领域。 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图2页 CN 111690633 A 2020.09.22 CN 111690633 A 1.一种内切木聚糖酶突变体S45C08， 其特征在于， 所述的突变体S45C08的氨基酸序列 如SEQ ID NO.1所示。 2.权利要求1所述的内切木聚糖酶突变体S45C08的编码基因s45c08， 其特征在于， 所述 的编码基因s45c08的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 3.一种重组载体， 其特征在于， 包含权利要求2所述的编码基因s45c08。 4.一种重组菌， 其特征在于， 包含权。

4、利要求2所述的编码基因s45c08。 5.权利要求1所述的内切木聚糖酶突变体S45C08的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 1)将编码基因s45c08和表达载体pEasy-E2相连接， 并将连接产物转化大肠杆菌BL21- Gold(DE3)， 获得包含编码基因s45c08的重组菌株； 2)培养重组菌株， 诱导重组突变内切木聚糖酶表达； 3)回收并纯化所表达的突变内切木聚糖酶S45C08。 6.权利要求1所述的内切木聚糖酶突变体S45C08或权利要求2所述的编码基因s45c08 在食品制造中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111690633 A 2 一种内切木聚糖酶突变体S。

5、45C08及制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 涉及蛋白质改造技术， 具体为一种内切木聚糖酶 突变体S45C08及制备方法和应用。 背景技术 0002 植物半纤维素约占植物干重的35， 是在自然界中仅次于纤维素的第二大类可再 生的生物质能。 木聚糖是自然界中半纤维素的第一大组分， 由木糖以 -1,4糖苷键连接而 成。 内切木聚糖酶属于半纤维素酶， 是一类能够随机剪切木聚糖主链生成低聚木糖和/或木 糖的糖苷水解酶。 (Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:323.)。 0003 木聚糖酶已广泛应用于食品、 饲料、 造纸、 。

6、环保及能源等领域。 例如， Hashimoto和 Nakata(J Biosci Bioeng,2003,95:164169)将耐盐的内切木聚糖酶、 木糖苷酶和 -阿拉 伯呋喃糖苷酶用于酱油酿造， 发现其协同降解木聚糖， 同时， 产物木糖和阿拉伯糖影响美拉 德反应， 从而产生类黑精并影响酱油色泽。 因此， 良好耐盐性的木聚糖酶能够在高盐环境下 具有更好的适应性。 但是， 在复杂的高盐环境中， 多数酶催化活性偏低， 限制其在复杂环境 中生物技术领域应用范围。 此外， 酶的耐盐机理多数处于假说阶段， 缺少突变改性实验数据 作为参考依据。 发明内容 0004 本发明目的在于提供一种内切木聚糖酶突变体。

7、S45C08， 该突变体应用于酿造和高 盐环境下食品加工等生物技术领域。 0005 本发明具体通过以下技术方案实现： 0006 本发明提供了一种内切木聚糖酶突变体S45C08， 所述的突变体S45C08的氨基酸序 列如SEQ ID NO.1所示。 0007 所述的氨基酸序列SEQ ID NO.1经修饰、 缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸 序列， 且保持只有90的同源性的序列也在本发明的保护范围内。 0008 在本发明另一方面， 还提供了所述的内切木聚糖酶突变体S45C08的编码基因 s45c08， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0009 与所述的编码基因s45c08编码相同蛋白。

8、质， 但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。 0010 在本发明的另一方面， 还提供了包含携带有编码基因序列为SEQ ID NO.2的重组 载体。 0011 在本发明的另一方面， 还提供了一种内切木聚糖酶突变体基因的工程菌， 所述的 工程菌含有具有SEQ ID NO.2所示基因的载体。 0012 在本发明的另一方面， 还提供了一种内切木聚糖酶突变体S45C08的制备方法， 包 括以下步骤： 0013 1)将编码基因s45c08和表达载体pEasy-E2相连接， 并将连接产物转化大肠杆菌 说明书 1/6 页 3 CN 1。

9、11690633 A 3 BL21-Gold(DE3)， 获得包含编码基因s45c08的重组菌株； 0014 2)培养重组菌株， 诱导重组突变内切木聚糖酶表达； 0015 3)回收并纯化所表达的突变内切木聚糖酶S45C08； 0016 4)活性测定。 0017 在本发明的另一方面， 所述的内切木聚糖酶突变体S45C08及其编码基因s45c08在 食品制备中的应用也在本发明的保护范围之内。 0018 本发明的有益效果为： 0019 与野生酶相比， 突变内切木聚糖酶S45C08的盐适应性发生了改变。 纯化的突变酶 S45C08、 野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适pH分别为5.0、。

10、 5.5和6.0， 最适温度分别为65 、 50和75。 在10.0mM的ZnSO4和FeSO4中， 突变体S45C08的酶活力比野生酶rXynAGN16L 的酶活力分别高12和44； 在10.0mM的 -Mercaptoethanol、 MgSO4、 ZnSO4、 CoCl2、 FeCl3和 FeSO4中， 突变体S45C08的酶活力比野生酶rXynAHJ3的酶活力分别高22、 11、 23、 33、 16和33。 在3 .030 .0(w/v)的NaCl中， 突变体S45C08酶活力比野生酶 rXynAGN16L酶活力分别高0.417， 比rXynAHJ3酶活力分别高130； 在15.0 。

11、30.0(w/v)的NaNO3中， 突变体S45C08酶活力比野生酶rXynAGN16L酶活力分别高511， 比rXynAHJ3酶活力分别高1828。 本发明的突变内切木聚糖酶S45C08可应用于酿造和高 盐环境下食品加工等生物技术领域。 附图说明 0020 图1是本发明在大肠杆菌中表达的重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、 rXynAHJ3及其 突变体S45C08的SDS-PAGE分析， 其中， CK： 蛋白质Marker； 0021 图2是本发明重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、 rXynAHJ3及其突变体S45C08在NaCl 中的活性； 0022 图3是本发明重组内切木聚糖酶rX。

12、ynAGN16L、 rXynAHJ3及其突变体S45C08在NaNO3 中的活性。 具体实施方式 0023 下面将结合本发明具体的实施例， 对本发明技术方案进行清楚、 完整地描述， 显 然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实 施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属 于本发明保护的范围。 0024 试验材料和试剂 0025 1、 菌株及载体： 大肠杆菌Escherichia coli BL21-Gold(DE3)和表达载体pEasy- E2购自北京全式金生物技术有限公司； 节杆菌(Arthrobacter。

13、 sp.)和列舍瓦里尔菌 (Lechevalieria sp.)由云南师范大学提供。 0026 2、 酶类及其它生化试剂： DNA聚合酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司， 山 毛榉木聚糖购自Sigma公司， 玉米芯木聚糖购自上海源叶生物科技有限公司， 易错PCR试剂 盒购自北京天恩泽基因科技有限公司， 细菌基因组提取试剂盒购自GENE STAR公司， PopCultureTM细胞裂解液购自德国默克集团有限公司， 其它都为国产试剂(均可从普通生化 说明书 2/6 页 4 CN 111690633 A 4 试剂公司购买得到)。 0027 3、 培养基： 0028 LB培养基： Pepton。

14、e 10g， Yeast extract 5g， NaCl 10g， 加蒸馏水至1000mL， pH自 然(约为7)。 固体培养基在此基础上加2.0(w/v)琼脂。 0029 说明： 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 分子克隆实验 指南 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书 进行。 0030 实施例1突变文库的构建 0031 1)按照GENE STAR公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌(Arthrobacter sp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组。 0032 2)根据GenBank记录的节杆菌。

15、(Arthrobacter sp.)内切木聚糖酶核苷酸序列 JQ863105 (SEQ ID No .3) ， 设计引物5 GTGCAGC CGGAGGAAAAACG 3 和5 GATGAAGGCAGGATCCGGGGT 3， 以节杆菌(Arthrobacter sp.)基因组为模板进行PCR扩增， 获 得内切木聚糖酶基因xynAGN16L； 另根据GenBank记录的列舍瓦里尔菌(Lechevalieria s p .) 内 切 木 聚 糖 酶 核 苷 酸 序 列 J F 7 4 5 8 6 8 (S E Q I D N o .4) ， 设 计 引 物 5 GTCTCGGCCCCGCCGGA。

16、CGT 3 和5 GGCTC GCTTCGCCAGCGTGG 3 ， 以列舍瓦里尔菌 (Lechevalieria sp.)基因组为模板进行PCR扩增， 获得内切木聚糖酶基因xynAHJ3。 0033 PCR反应参数为： 94变性5min； 然后94变性30sec， 55退火30sec， 72延伸 1min 30sec， 30个循环后72保温10min。 0034 3)以上述PCR产物为模板， 利用易错PCR试剂盒， 按照试剂盒说明书进行基因突变。 0035 4)用超声打断仪Biorupter对易错PCR产物进行超声随机打断， 打断产物经2琼 脂糖凝胶电泳后切胶纯化。 0036 5)纯化后的小。

17、片段DNA自身互为引物和模板进行DNA家族改组(DNAFamily shuffling)PCR， PCR反应参数为： 96变性1min30sec； 然后94变性30sec， 依次65退火 90sec、 62退火90sec、 59退火90sec、 56退火90sec、 53退火90sec、 50退火90sec、 47退火90sec、 44退火90sec、 41退火90sec， 72延伸1min 30sec， 35个循环后72保 温7min。 0037 6)以纯化的DNA家族改组PCR产物为模板， 用内切木聚糖酶基因xynAHJ3和 xynAGN16L扩增引物和反应条件进行序列全长扩增， 扩增产物。

18、含突变序列和未突变序列。 0038 7)将序列全长扩增产物和表达载体pEasy-E2相连接， 并将连接产物转化大肠杆菌 BL21-Gold(DE3)， 经过夜培养， 从转化平板中挑取单菌落于含有150 L液体LB培养液(含100 g mL-1Amp)的96孔细胞培养板中， 于37， 快速振荡培养约16h后， 每孔加入40(w/w)的甘 油50 L， 混匀后于-70保存。 0039 实施例2突变体的筛选 0040 1)从保存突变文库的96孔细胞培养板中取2 L菌液， 接种于含200 L/孔液体LB培 养液(含100 g mL-1Amp)的96深孔板中， 于37， 200rpm振荡培养至OD600。

19、1.0(约20h)， 加入 含2mM IPTG和100 g mL-1Amp的200 L液体LB培养液， 于20， 160rpm过夜诱导。 0041 2)诱导结束后加入40 L/孔的PopCultureTM细胞裂解液， 在25下， 震荡裂解细胞 30min。 说明书 3/6 页 5 CN 111690633 A 5 0042 3)取50 L含1.0(w/v)山毛榉木聚糖的McIlvaine缓冲液(pH7.0)及50 L细胞 裂解产物， 在96深孔板中于70恒温箱中反应2h。 反应结束后加入150 L DNS试剂终止反 应， 于140恒温箱中保温20min以上并冷却至室温， 使用酶标仪读取OD54。

20、0nm的值， 以只含有 pEASY-E2空载体的E.coli BL21-Gold(DE3)菌株裂解液反应组作为对照。 0043 4)取有内切木聚糖酶活性的突变体细胞裂解产物10 L， 另取90 L含0.5(w/v)山 毛榉木聚糖的McIlvaine缓冲液(pH7.0)， 加入10(w/v)和25(w/v)的NaCl， 在96深孔 板中于70恒温箱中反应10min。 0044 5)反应结束后加入150 L DNS试剂终止反应， 于140恒温箱中保温20min以上并 冷却至室温， 使用酶标仪读取OD540nm的值， 以不含NaCl的对应突变体裂解液反应组作为对 照。 0045 6)比较突变体与野生。

21、重组酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶活大小， 获得在10(w/ v)和25(w/v)NaCl中酶活提高的1个突变体， 编号为S45C08， 该突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示， 其是两个野生酶的改组杂合体， 该突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0046 实施例3突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶制备 0047 将含突变体S45C08、 野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的重组菌株以0.1的接种量 分别接种于LB(含100 g mL-1Amp)培养液中， 37快速振荡16h。 0048 然后将此活化的菌液以1接种量。

22、接种到新鲜的LB(含100 g mL-1Amp)培养液中， 快速振荡培养约23h(OD600达到0.61.0)后， 加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导， 于20 继续振荡培养约20h。 12000rpm离心5min， 收集菌体。 用适量的pH7.0TrisHCl缓冲液悬浮 菌体后， 于低温水浴下超声波破碎菌体。 以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后， 吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。 0049 SDS-PAGE结果(图1)表明， 突变酶S45C08、 野生酶rXynAG N16L和rXynAHJ3都获得 了纯化，。

23、 产物为单一条带。 0050 实施例4突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的性质测定 0051 1)突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的活性分析 0052 活性测定方法采用3,5二硝基水杨酸(DNS)法： 将底物溶于缓冲液中， 使其终浓 度为0.5(w/v)； 反应体系含100 L适量酶液， 900 L底物； 底物在反应温度下预热5min后， 加入酶液后再反应10min， 然后加1.5mL DNS终止反应， 沸水煮5min， 冷却至室温后在540nm 波长下测定OD值； 1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底。

24、物产生1 mol还原 糖(以木糖计)所需的酶量。 0053 2)突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的pH活性和pH稳定性 测定 0054 酶的最适pH测定： 将酶液置于37下和pH4.012.0的缓冲液中进行酶促反应。 酶的pH稳定性测定： 将酶液置于pH3.012.0的缓冲液中， 在37下处理1h， 然后在pH 7.0及37下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 缓冲液为： McIlvaine buffer(pH 3.08.0)和0.1M glycineNaOH(pH9.012.0)。 以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底 物， 反应10min， 测定纯。

25、化的内切木聚糖酶的酶学性质。 0055 结果表明： 突变酶S45C08、 野生纯化酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适pH分别为 5.0、 5.5和6.0； 在pH5.511时， 突变体S45C08、 野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3稳定。 说明书 4/6 页 6 CN 111690633 A 6 0056 3)突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的热活性及热稳定性 测定 0057 酶的热活性测定： 在pH7.0的缓冲液中， 于090下进行酶促反应。 酶的热稳定 性测定： 将同样酶量的酶液置于37处理060min后， 在pH7.0及37。

26、下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物， 反应10min， 测定纯化 的内切木聚糖酶的酶学性质。 0058 结果表明： S45C08、 rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适温度分别为65、 50和75， 在70分别具有69.8、 17.7和97.7的酶活； S45C08和rXynAHJ3在50时稳定， rXynAGN16L在50时极不稳定。 0059 4)不同金属离子及化学试剂对突变体s45c08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的 纯化酶活力的影响 0060 在酶促反应体系中加入10.0mM的金属离子及化学试剂， 研究其对酶活性的影。

27、响。 在37及pH7.0条件下， 以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物测定酶活性。 0061 结果(表1)表明： 10.0mM的HgCl2可完全抑制S45C08、 rXynAGN16L和rXynAHJ3； 在 10.0mM的ZnSO4和FeSO4中， 突变体S45C08的酶活力比野生酶rXynAGN16L的酶活力分别高 12和44； 在10.0mM的 -Mercaptoethanol、 MgSO4、 ZnSO4、 CoCl2、 FeCl3和FeSO4中， 突变体 S45C08的酶活力比野生酶rXynAHJ3的酶活力分别高22、 11、 23、 33、 16和33。 0062 表1金属离子及化学试。

28、剂对突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3活力的 影响 0063 0064 5)突变体S45C08及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶在NaCl和NaNO3中的活 性： 0065 酶在NaCl中的活性测定： 在酶促反应体系中加入3.030.0(w/v)NaCl， 于pH7.0 及37下进行酶促反应。 以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物， 反应10min， 测定纯化的 内切木聚糖酶的酶学性质。 0066 结果表明： 在3 .030 .0(w/v)的NaCl中， 突变体S45C08酶活力比野生酶 说明书 5/6 页 7 CN 111690633 A 7 。

29、rXynAGN16L酶活力分别高0.417， 比rXynAHJ3酶活力分别高130(图2)。 0067 酶在NaNO3中的活性测定： 在酶促反应体系中加入3.030.0(w/v)NaNO3， 于 pH7.0及37下进行酶促反应。 以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物， 反应10min， 测定纯 化的内切木聚糖酶的酶学性质。 0068 结果表明： 在15.030.0(w/v)的NaNO3中， 突变体S45C08酶活力比野生酶 rXynAGN16L酶活力分别高511， 比rXynAHJ3酶活力分别高1828(图3)。 0069 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 对于本领域的普通技术人员而言， 可。

30、以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、 修改、 替换和 变型， 本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 说明书 6/6 页 8 CN 111690633 A 8 序列表 云南师范大学 一种内切木聚糖酶突变体S45C08及制备方法和应用 8 SIPOSequenceListing 1.0 1 362 PRT 内切木聚糖酶突变体(S45C08) 1 Val Ser Ala Pro Pro Asp Val Ser Gly His Lys Gln Thr Leu Arg Ser 1 5 10 15 Ala Ala Pro Lys Gly Phe His Ile Gl。

31、y Thr Ala Val Ala Gly Gly Gly 20 25 30 His His Glu Asn Gln Pro Tyr Pro Asp Pro Phe Thr Ser Asp Ser Glu 35 40 45 Tyr Arg Lys Val Leu Ala Ala Glu Phe Asn Ser Val Ser Pro Glu Asn 50 55 60 Gln Met Lys Trp Glu Tyr Ile His Pro Glu Arg Gly Arg Tyr Asn Phe 65 70 75 80 Gly Met Ala Asp Ala Ile Val Arg Phe Ala。

32、 Lys Gln Asn Arg Gln Val 85 90 95 Val Arg Gly His Thr Leu Phe Trp His Ser Gln Asn Pro Gln Trp Leu 100 105 110 Glu Gln Gly Asn Phe Ser Lys Glu Glu Leu Arg Gly Ile Leu Lys Asp 115 120 125 His Val Gln Thr Val Val Gly Arg Tyr Ala Gly Lys Ile Gln Gln Trp 130 135 140 Asp Val Ala Asn Glu Ile Phe Asn Asp As。

33、p Gly Thr Leu Arg Ala Thr 145 150 155 160 Glu Asn Ile Trp Leu Arg Glu Leu Gly Pro Asp Ile Ile Ala Asp Val 165 170 175 Phe Arg Trp Ala His Glu Ala Asp Pro Lys Ala Lys Leu Phe Phe Asn 180 185 190 Asp Phe Gly Val Glu Asp Ile Asn Ala Lys Ser Asp Ala Tyr Leu Glu 195 200 205 Leu Ile Pro Arg Leu Gln Ala Gl。

34、n Gly Val Gln Val Asp Gly Phe Ala 210 215 220 序列表 1/5 页 9 CN 111690633 A 9 Ile Gln Gly His Leu Ser Thr Arg Tyr Gly Phe Pro Ser Gly Leu Gln 225 230 235 240 Ala Asn Leu Gln Arg Phe Asp Asp Leu Gly Leu Glu Thr Ala Ile Thr 245 250 255 Glu Ile Asp Val Arg Met Asp Ile Ala Ala Gly Thr Glu Pro Thr Ala 260 2。

35、65 270 Glu Gln Leu Glu Gln Gln Ala Asp Tyr Tyr Gln Arg Ala Leu Glu Ala 275 280 285 Cys Leu Ser Val Ala Asp Cys Asn Ser Phe Thr Ile Trp Gly Phe Thr 290 295 300 Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro Val Phe Phe Ala Gly Glu Gly Glu Ala 305 310 315 320 Thr Val Met Glu Glu Asp Phe Thr Arg Lys Pro Ala Tyr Phe Ala L。

36、eu 325 330 335 Arg Glu Thr Leu Lys Arg Pro Val Pro Lys Pro Asp Asp Gly Gly Pro 340 345 350 Ser Gln Pro Thr Pro Asp Pro Ala Phe Ile 355 360 2 1086 DNA 内切木聚糖酶突变体(s45c08) 2 gtctcggccc cgccggacgt gagcggccac aaacagacgt tgcgctcggc agcgcccaag 60 ggtttccaca tcggcacggc cgtcgcgggc ggcggccacc acgagaacca gccgta。

37、cccg 120 gaccccttca cctcggacag cgagtaccgg aaggtgctgg ccgcggagtt caactcggtc 180 tcgcccgaga accagatgaa gtgggagtac atccacccgg agcgcggccg gtacaacttc 240 ggcatggccg acgccatcgt ccggttcgcc aagcagaacc ggcaggtggt ccgcgggcac 300 accctctttt ggcacagcca gaatcctcag tggctggagc agggaaactt ctccaaagaa 360 gaactgcgcg 。

38、gaatcctcaa agaccacgtc cagactgtag tgggcaggta cgccggcaaa 420 atccagcagt gggacgtcgc caacgaaatc ttcaatgatg acggaaccct gcgcgccacc 480 gagaacattt ggcttcgtga actgggcccg gacatcattg ccgacgtttt ccgctgggcg 540 cacgaggccg accccaaggc caagctgttc ttcaatgatt tcggcgttga ggacattaat 600 gccaagagtg atgcctacct cgaactcat。

39、c ccccggcttc aggcacaggg cgtgcaggtt 660 gacgggtttg ccatccaggg ccatctgagc acccgctacg gtttcccttc agggctgcag 720 gccaacctgc agcgctttga cgacctgggg ctggaaaccg ccattacgga aatagacgtc 780 cgcatggata ttgcagccgg cacggagccg acggccgagc agcttgagca gcaggcggac 840 tactaccagc gcgcccttga ggcctgcctg tccgttgcag actgcaa。

40、ttc gttcaccatt 900 tggggcttca cggacaagta ctcgtgggtt ccggtcttct ttgccggcga gggcgaggcg 960 序列表 2/5 页 10 CN 111690633 A 10 acagtcatgg aggaagactt cacgcgcaag cctgcctact ttgccctgcg ggaaacactg 1020 aagcgtccgg tgccgaagcc cgacgacggc ggcccgtccc agccaacccc ggatcctgcc 1080 ttcatc 1086 3 3639 DNA 节杆菌(Arthrobacte。

41、r sp.) 3 atgaaggttc cgcgtttatt aaccgctctg gctgtaacct cggcgctgct gctgccggcg 60 gttccggcgc ttgccgtgca gccggaggaa aaacgtcctc cgggccagtc caaacaggac 120 acgctgcgcc gtgcagcccc caaagacttc aagattggtt ccgccgttgc gggcggaggc 180 catcatgagg cccaggacta ccccgatcct tttacgttcg ataaggaata ccgccggcaa 240 ctggccgccg a。

42、gttcaattc ggtgtcaccg gagaaccagt cgaagtggga attcatccac 300 ccggaaaagg atgtctaccg cttcacggaa atggacgcca ttgtccgctc cgcccaaaaa 360 aacaagcagg tggtgcgcgg ccacaccctc ttttggcaca gccagaatcc tcagtggctg 420 gagcagggaa acttctccaa agaagaactg cgcggaatcc tcaaagacca cgtccagact 480 gtagtgggca ggtacgccgg caaaatccag。

43、 cagtgggacg tcgccaacga aatcttcaat 540 gatgacggaa ccctgcgcgc caccgagaac atttggcttc gtgaactggg cccggacatc 600 attgccgacg ttttccgctg ggcgcacgag gccgacccca aggccaagct gttcttcaat 660 gatttcggcg ttgaggacat taatgccaag agtgatgcct acctcgaact catcccccgg 720 cttcaggcac agggcgtgca ggttgacggg tttgccatcc agggccat。

44、ct gagcacccgc 780 tacggtttcc cttcagggct gcaggccaac ctgcagcgct ttgacgacct ggggctggaa 840 actgccatta cggaaataga cgtccgcatg gatattgcag ccggcacgga gccgacggcc 900 gagcagcttg agcagcaggc ggactactac cagcgcgccc ttgaggcctg cctgtccgtt 960 gcagactgca attcgttcac catttggggc ttcacggaca agtactcgtg ggttccggtc 1020 t。

45、tctttgccg gcgagggcga ggcgacagtc atggaggaag acttcacgcg caagcctgcc 1080 tactttgccc tgcgggaaac actgaagcgt ccggtgccga agcccgacga cggcggcccg 1140 tcccagccaa ccccggatcc tgccttcatc cccggcggcg ccgccaaccc gacagcgacg 1200 ccgatcgcag catcccgcgg caccggcaac tccgtggcgc tcaccttcga tgacgggccc 1260 gagcccggcg aaacca。

46、cagc tgtcctcgat ttcctcaagg acaagggcat cactgccacc 1320 ttctgcgtca tcggagcgaa catccaggcc cccggcggag ccgagctggt gaagcgcatg 1380 gtcgaggagg gccacacgct gtgcaaccac ggcaccacgt atgcggacat gggttcgtgg 1440 acccaggaac agattaaggc cgacctggtg gaaaacctcc gcatcatccg tgaagccgcc 1500 ggcacgcctg atctgcaggt cccctatttc 。

47、cgggcaccga acggaagctg gggagtcacg 1560 ggcgaagtag ccgcagcgct tggtatgcag ccgctgggcc tgggcaatgt catctttgac 1620 tgggacggca atgacctcag cgaagccacc ctcacggcaa acctccgtgc cgcgttcacc 1680 cccggcgcgg tggtgctggc gcacgtcggc ggcggtgacc ggaccaacac agtgaaggca 1740 gttacgacgg tcgtgaccga aaagctcgcc caggggtgga cgttc。

48、gccct tccgcagggc 1800 ggtgccccgg aggaaccttc cggcggtgtg ccctcggact tcgagaccgg aaccgacggc 1860 序列表 3/5 页 11 CN 111690633 A 11 tggaccgcgc gcggggactc agtggcggtc aacctcagct ccgacgcccg caccggatcc 1920 ggaagcctgc tggtcacgaa ccggacccag gactggcacg gtgccgcact cgacgtcacg 1980 ggcgccctac cggtcggctc ggccgtaaag a。

49、tgtccgtct gggccaagct cgcccccggg 2040 cagcagccgg cggcactgaa aatgtccgtt cagcgggaca acggcggcgg gagtgcctat 2100 gaaggcgttg ccggagccgg ggcttcggtc accgccgacg gctggaccga acttgccggg 2160 acttacaccc tcggcgcagc agcggacaaa gcccaggtgt acatcgaagg tgctgtcggc 2220 gtggggttcc tgctcgatga cttcagcctc gccgcatatg ttgagc。

50、ctcc ccttcaggag 2280 gacatacccg ggttgaaaga cgtccttggc ctgcagggca tcgagcacgt gggagcagca 2340 atcgacgcac gcgagacagc gggcaccgca gcgaacctcc tgcggaaaca cttcaatgcc 2400 ttcactcccg agaacgccgg caggcccgag agcgtgcagc cggtggaggg tcagttcacc 2460 cttacccagc tggaccagct gctggacttc gcagccgcca acaatgtcaa ggtgtacgga 。