高电位超亲水性多肽单层膜及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010753455.6 (22)申请日 2020.07.30 (71)申请人 齐鲁工业大学 地址 250300 山东省济南市长清区大学路 3501号 (72)发明人 许静张震李天铎马慧君 班青 (74)专利代理机构 济南竹森知识产权代理事务 所(普通合伙) 37270 代理人 朱家富 (51)Int.Cl. A61L 31/02(2006.01) A61L 31/10(2006.01) A61L 31/14(2006.01) (54)发明名称 一种高电位超亲水性多肽单层膜及。

2、其制备 方法与应用 (57)摘要 本发明提供一种具有表面高电位且超亲水 性的多肽单层膜及其制备方法与应用。 所述多肽 是由分子量为(1.480.2)105g/mol的多肽分 子构成的， 单层膜的厚度为13.814.9nm， 膜表 面的伯氨基暴露量为1214， 多肽单层膜的 Zeta电位为15mV； 所述膜的接触角为101 。 作为心血管支架的表面涂层材料在治疗心血管 疾病中的应用； 其超亲水性质能够使材料表面形 成一层水化膜而有效防止蛋白吸附。 表面高电位 能提高细胞粘附、 增殖和分化能力。 权利要求书2页 说明书12页 附图7页 CN 111840661 A 2020.10.30 CN 11。

3、1840661 A 1.一种具有表面高电位且超亲水性的多肽单层膜， 其特征在于， 所述多肽是由分子量 为(1.480.2)105g/mol的多肽分子构成的， 单层膜的厚度为13.814.9nm， 膜表面的伯 氨基暴露量为1214， 多肽单层膜的Zeta电位为-15mV； 所述膜的接触角为101 。 2.根据权利要求1所述的多肽单层膜， 其特征在于， 所述多肽为胶原多肽， 所述多肽的 氨基酸的组成为甘氨酸(Gly)： 7.300.5； 缬氨酸(Vla)： 17.480.5； 异亮氨酸(Ile)： 36.970.5； 亮氨酸(Leu)： 13.850.5； 酪氨酸(Tyr)： 2.680.5； 苯。

4、丙氨酸(Phe)： 1.50.5； 赖氨酸(Lys)： 4.410.5； 组氨酸(His)： 0.450.5； 精氨酸(Arg)： 3.45 0.5； 脯氨酸(Pro)： 5.960.5； 半胱氨酸(Cys)： 5.950.5。 3.根据权利要求2所述的多肽单层膜， 其特征在于， 所述多肽单层膜的二级结构含量 为： -helix为4051； -sheet为1015； -turn为27； random coil为3142。 优选的， 所述多肽单层膜的二级结构含量为： -helix为50.980.2； -sheet为 10.850.13； -turn为6.610.07； random coil为3。

5、1.560.27； 或者 -helix为40.730.1； -sheet为14.970.13； -turn为2.550.08； random coil为41.750.22。 4.根据权利要求1所述的多肽单层膜， 其特征在于， 多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒 组成的， 球形纳米颗粒的平均粒径为602nm。 5.根据权利要求1所述的多肽单层膜， 其特征在于， 所述膜表面的伯氨基暴露量为 12.470.3或者13.130.3； 所述多肽单层膜的Zeta电位为-(0.850.1)mV或4.907 0.1mV。 6.一种含有多肽单层膜的复合膜， 其特征在于， 包括聚乙烯亚胺薄膜和权利要求16 所述的多肽。

6、单层膜， 聚乙烯亚胺薄膜和多肽单层膜之间通过离子键结合， 其中， 聚乙烯亚胺 薄膜的厚度为0.250.38nm， 多肽单层膜的厚度为13.814.9nm。 7.权利要求15所述多肽单层膜及权利要求6所述复合膜的制备方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)在一定温度下， 配制多肽溶液， 然后加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)， 得到多 肽-SDS混合溶液， 保温备用， 混合溶液中SDS的浓度为3.58.32mmol/L； (2)将钛片表面打磨抛光， 浸入混酸溶液中处理， 冲洗至中性， 用氮气吹干后再烘干； (3)将烘干后的钛片浸入聚乙烯亚胺(PEI)水溶液中处理后， 用水冲洗， 用氮气。

7、吹干后 再烘干， 得到沉积有PEI的正离子化的钛片； (4)将正离子化的钛片浸入步骤(1)所得多肽-SDS混合溶液中， 沉积812min， 然后将 其在去离子水中提拉2025次， 用高纯氮气吹干后， 即得多肽单层膜。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述温度与步骤(4)中沉积过程 温度均为50； 步骤(1)中， 胶原多肽溶液的浓度为4wt； 混合溶液中SDS的浓度为： 3.5mmol/L或8.32mmol/L； 步骤(1)中， 胶原多肽溶液的配置方法为： 将胶原多肽和去离子水 混合， 于室温溶胀0.5小时后， 加热至50， 搅拌2小时， 使胶原多肽完全溶解； 然后调节。

8、pH至 10.000.02。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 钛片使用金相砂纸打磨抛光 后， 依次用去离子水， 无水乙醇， 丙酮超声清洗钛片各15min， 然后用高纯氮气吹干后在60 烘箱干燥12h。 进一步优选的， 打磨抛光的方法为： 使用金相砂纸按照800， 1500， 3000， 5000， 权利要求书 1/2 页 2 CN 111840661 A 2 7000目的顺序依次打磨抛光； 步骤(2)中， 混酸溶液为体积比为1:1的质量分数为30H2O2和98H2SO4的混合溶液， 处 理时间为1小时； 步骤(3)中， 钛片在PEI水溶液中的处理时间为2040分钟。

9、。 10.权利要求15所述多肽单层膜及权利要求6所述复合膜作为心血管支架的表面涂 层材料在治疗心血管疾病中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111840661 A 3 一种高电位超亲水性多肽单层膜及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明属于天然高分子领域， 涉及多肽单层膜及其制备方法与应用， 具体涉及一 种具有表面高电位及超亲水性的多肽单层膜及其制备方法与应用。 背景技术 0002 胶原多肽是通过胶原蛋白的化学热降解而获得的一种水溶性蛋白。 由于其优良的 生物相容性， 可塑性， 粘性， 丰富度和低成本而成为最常用的生物聚合物之一。 胶原多肽作 为一种可生物降解和可再生资源， 被。

10、广泛应用于制备医用材料、 仿生材料、 包装及涂饰材 料。 生物固定化涂层常被应用于生物仿生支架领域， 解决酶、 乳糖、 聚多巴胺等生物分子、 药 物分子、 合成高分子或有机小分子的搭载问题， 若将胶原多肽制备成多肽单层膜具有搭载 量易精确控制等优点。 0003 但是， 现有技术中生物固定化涂层的厚度交厚且不易控制， 生物固定化涂层的层 厚普遍大于100nm。 且胶原多肽分子上含有氨基、 羧基、 羟基等很多极性基团， 使其产生较强 的分子间氢键， 形成网状结构， 再脱水后形成脆性薄膜； 此外， 这些基团与水分子形成氢键， 从而使多肽薄膜易吸水。 这些特性导致胶原多肽材料变脆并且容易溶于水， 限制。

11、了它在一 些领域的应用。 0004 天然生物大分子的二级结构能够影响多肽分子上官能团的暴露量， 从而影响膜表 面的化学、 亲润、 电性质等物理化学性质， 通过改变生物固定化涂层分子层膜表面的化学性 质、 亲润性、 电性质， 使其能够应用于心脑血管支架制备等领域。 0005 尽管使用表面活性剂对界面上多肽分子构象进行调控的相关研究比较普遍， 但限 于天然生物大分子结构的复杂性， 对多肽分子单层膜表面的化学性质的研究鲜有报道， 因 此限制了多肽分子的应用。 另外， 加强对多肽分子单层膜表面的化学性质的研究有利于多 肽分子的下一步改性， 能够进一步弥补其自身的缺点。 发明内容 0006 为了解决现有。

12、技术中存在的问题， 本发明提供一种表面高电位且具有超亲水性的 多肽单层膜及其制备方法与应用。 本发明通改变多肽单层膜表面的伯氨基暴露量来改善膜 表面电荷及亲水性质， 本发明的多肽单层膜能够应用于心脑血管支架制备领域。 0007 本发明中， 所述伯氨基的暴露量指的是： 伯氨基摩尔量/胶原多肽(g)。 0008 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0009 一种具有表面高电位且超亲水性的多肽单层膜， 其特征在于， 所述多肽是由分子 量为(1.480.2)105g/mol的多肽分子构成的， 单层膜的厚度为13.814.9nm， 膜表面的 伯氨基暴露量为1214， 多肽单层膜的Zeta电位为。

13、-15mV； 所述膜的接触角为101 。 0010 优选的， 所述多肽为胶原多肽。 优选的， 所述单层膜的厚度为14.20.1nm。 0011 优选的， 所述多肽的氨基酸的组成为甘氨酸(Gly)： 7.300.5； 缬氨酸(Vla)： 17.480.5； 异亮氨酸(Ile)： 36.970.5； 亮氨酸(Leu)： 13.850.5； 酪氨酸(Tyr)： 说明书 1/12 页 4 CN 111840661 A 4 2.680.5； 苯丙氨酸(Phe)： 1.50.5； 赖氨酸(Lys)： 4.410.5； 组氨酸(His)： 0.45 0.5； 精氨酸(Arg)： 3.450.5； 脯氨酸(P。

14、ro)： 5.960.5； 半胱氨酸(Cys)： 5.95 0.5。 0012 优选的， 所述单层膜胶原多肽的二级结构含量为： -helix为4051； -sheet为 1015； -turn为27； random coil为3142。 0013 优选的， 多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒组成的， 球形纳米颗粒的平均粒径为 602nm。 0014 优选的， 所述膜表面的伯氨基暴露量为12.470.3或者13.130.3。 0015 优选的， 所述多肽单层膜的Zeta电位为-(0.850.1)mV或4.9070.1mV。 0016 进一步优选的， 所述膜的二级结构含量为： -helix为50.98。

15、0.2； -sheet为 10.850.13； -turn为6.610.07； random coil为31.560.27； 0017 或者 -helix为40.730.1； -sheet为14.970.13； -turn为2.55 0.08； random coil为41.750.22。 上述多肽单层膜中的二级结构的含量是采用显微 共焦拉曼光谱仪进行表征的。 0018 本发明还提供一种含有多肽单层膜的复合膜： 包括聚乙烯亚胺薄膜和多肽单层 膜， 聚乙烯亚胺和多肽分子之间通过离子键结合， 其中， 聚乙烯亚胺薄膜的厚度为0.25 0.38nm， 多肽单层膜的厚度为13.814.9nm。 0019。

16、 本发明还提供了上述多肽单层膜的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 0020 (1)在一定温度下， 配制多肽溶液， 然后加入表面活性剂SDS(十二烷基硫酸钠)， 得 到多肽-SDS混合溶液， 保温备用， 混合溶液中十二烷基硫酸钠的浓度为3.5mmol/L 8.32mmol/L； 0021 (2)将钛片表面打磨抛光， 浸入混酸溶液中处理， 冲洗至中性， 用氮气吹干后再进 一步烘干； 0022 (3)将烘干后的钛片浸入PEI(聚乙烯亚胺)水溶液中处理后， 用水冲洗， 用氮气吹 干后再烘干， 得到沉积有PEI的正离子化的钛片； 0023 (4)将正离子化的钛片浸入步骤(1)所得多肽-SDS混合。

17、溶液中， 沉积812min， 然 后将其在去离子水中提拉2025次， 用高纯氮气吹干后， 即得多肽单层膜。 0024 优选的， 步骤(1)中所述温度与步骤(4)中沉积过程温度均为50。 0025 优选的， 步骤(1)中， 胶原多肽溶液的浓度为4wt； 混合溶液中十二烷基硫酸钠的 浓度为： 3.5mmol/L或8.32mmol/L。 0026 优选的， 步骤(1)中， 胶原多肽溶液的配置方法为： 将胶原多肽和去离子水混合， 于 室温溶胀0.5小时后， 加热至50， 搅拌2小时， 时胶原多肽完全溶解； 然后调节pH至10.00 0.02。 0027 优选的， 步骤(2)中， 钛片使用金相砂纸打磨抛。

18、光后， 依次用去离子水， 无水乙醇， 丙酮超声清洗钛片各15min， 然后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥12h。 进一步优选的， 打 磨抛光的方法为： 使用金相砂纸按照800， 1500， 3000， 5000， 7000目的顺序依次打磨抛光。 0028 优选的， 步骤(2)中， 混酸溶液为体积比为1:1的质量分数为30H2O2和98H2SO4 的混合溶液， 处理时间为1小时。 0029 优选的， 步骤(3)中， 钛片在PEI水溶液中的处理时间为2040分钟。 说明书 2/12 页 5 CN 111840661 A 5 0030 本发明中将市售多肽产品经过透析方法得到的结构规整的胶原多肽。 0。

19、031 本发明还提供上述多肽单层膜作为心血管支架的表面涂层材料在治疗心血管疾 病中的应用。 0032 本发明所述多肽单层膜表面较高的伯氨基暴露量将有效提高心血管药物的搭载 量。 表面高电位能够提高生物相容性、 血液相容性； 表面高电位能提高细胞的粘附、 增殖和 分化能力。 0033 另外， 该单层膜的超亲水特性， 可在在表面形成一层水化膜， 防止蛋白吸附。 应用 于心血管支架材料中可有效防止纤维基蛋白、 牛血清蛋白等常见蛋白吸附， 避免引起心血 管的再次堵塞。 0034 本发明的有益效果： 0035 本发明通过静电自组装技术将多肽固定在正离子化的基材表面， 制备多肽单层 膜， 通过改变伯氨基在。

20、薄膜表面的暴露量， 调控膜表面的Zeta电位和亲水性质， 显著提高了 细胞附着和增殖， 对细胞活力有益， 使其能够应用于生物仿生支架领域。 0036 本发明的多肽单层膜具有超亲水性质， 能够使材料表面形成一层水化膜而有效防 止蛋白吸附， 避免引起心血管的再次堵塞； 高的伯氨基暴露量将有效提高心血管药物的搭 载量。 附图说明 0037 图1是多肽浓度对椭圆度的影响； 0038 图2是4浓度胶原多肽所得胶原多肽分子层膜的AFM图像； 0039 图3是不同提拉次数的荧光强度； 0040 图4(a)是多肽单层膜G-SDS6的厚度-距离曲线， (b)是G-SDS6的AFM图像； 0041 图5是多肽单层。

21、膜的高分辨率N1s XPS光谱和对应伯氨基含量(a,G-SDS6， b,G- SDScmc， c,G-SDScac， d,4多肽膜)； 0042 图6是胶原多肽单层膜的Zeta电位和水接触角； 0043 图7是多肽单层膜的接触角图(a是SDScac、 图b是SDS6、 图c是SDScmc)； 0044 图8是产物四苯乙烯(TPE)-异硫氰酸酯(ITC)的TPE-CH3(a),TPE-N3(b),TPE-ITC (c)的1H NMR谱图； 0045 图9是不同样品的CLSM图像(a,正离子化后的钛片； b,4多肽-TPE； c,4多肽； d, G-SDScac-TPE； e,G-SDScac； 。

22、f,G-SDS6-TPE； g,G-SDS6)； 0046 图10是多肽单层膜G-SDS6的CCK-8检测结果； 0047 图11是多肽单层膜G-SDS6的MTT检测结果； 0048 图12是不同样品进行细胞克隆实验后， 细胞存活情况(a,对照组， b,G-SDScac， c, G-SDS6； d， 各处理组细胞存活百分数)； 0049 图13是胶原多肽单层膜在生理盐水中浸泡7天前后的荧光显微镜图像(a,b)4 多肽膜， (c,d)G-SDScmc， (g,h)G-SDS6)， 样品放置在恒温箱里15天后的荧光显微镜图像 (i)G-SDS6)。 说明书 3/12 页 6 CN 11184066。

23、1 A 6 具体实施方式： 0050 以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案做进一步说明， 本发明实施例中 所使用的胶原多肽为市售多肽产品(A.R.)， 其分子量约为5.001041.80105g/mol， 经 透析方法得到的分子量为(1.480.2)105g/mol的多肽。 其他试剂没有特别说明的均为 普通市售产品。 0051 胶原多肽是两性聚电解质， 在等电点下可团聚为球形粒子。 利用胶原多肽的聚集 行为， 通过调节温度、 浓度、 pH、 离子强度等因素， 使分子量小的胶原多肽通过半透膜， 从而 达到与分子量较大的胶原多肽分开的目的。 凝胶电泳、 激光粒度仪的研究结果表明， 规格为 5。

24、万的透析袋， 胶原多肽的透析浓度为2， 透析温度为45， NaCl的浓度为0.9molL-1的条 件下可制备出窄分子量分布的胶原多肽。 0052 透析前后胶原多肽CP、 CA、 MW和等电点(IP)的对比如表1所示， 透析前后氨基酸种 类对比如表2所示。 GPC测试结果表明透析胶原多肽的重均分子量Mw1.48105gmol-1， Mw/Mn1.43。 凯氏定氮法测出胶原多肽中蛋白质含量(CP)为83.38， 氨基酸含量(CA)为 4.9510-4molg-1， 伯氨基定量仪于50测定结果表明透析胶原多肽分子中包含4.95 10-4gmol-1的伯氨基， 透析前后胶原多肽的分子结构没有明显改变。。

25、 将胶原多肽配制为 5的水溶液， 其电导率为5.98 S cm-1， 去离子水自身电导率为2.06 S cm-1， 上述结果表明 分子量较小的胶原多肽以及胶原多肽中混杂的无机盐都被透析出去了。 0053 表1. 0054 0055 表2. 0056 0057 0058 实施例1 说明书 4/12 页 7 CN 111840661 A 7 0059 一种多肽单层膜的制备方法， 包括以下步骤： 0060 (1)配制浓度为4wt的胶原多肽溶液50mL： 精确称取胶原多肽于100mL于三口烧 瓶中， 准确量取去离子水， 把去离子水倒入三口烧瓶中， 室温溶胀0.5h后， 将三口烧瓶放入 501的水浴中，。

26、 加热搅拌2h， 使其完全溶解， 然后用2mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节 至10.000.02， 在水浴中稳定0.5h后。 0061 (2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂SDS， 得到胶原多肽-SDS混合溶液， 混 合溶液中SDS的浓度为3.50mmol/L(CAC， 50时， SDS的临界聚集浓度)； 在水浴中稳定6h备 用。 0062 (3)切割大小为1cm1cm1mm的长方形钛片， 使用金相砂纸按照， 800， 1500， 3000， 5000， 7000目的顺序依次打磨抛光， 依次用去离子水， 无水乙醇， 丙酮超声清洗钛片各 15min， 然后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥1。

27、2h备用。 配制30H2O2和98H2SO4体积比 为1:1的混酸溶液， 冷却至室温后， 将上述处理好的钛片用混酸处理1h， 然后用自来水冲洗 至中性， 再用去离子水清洗5次， 最后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥12h备用。 0063 (4)配制1mg/mL的PEI聚乙烯亚胺水溶液， 将上述酸蚀的钛片用PEI溶液室温处理 0.5h， 后用去离子水清洗5次， 去除掉结合不牢的电荷， 最后用高纯氮气吹干后在60烘箱 干燥12h备用。 将正离子化的钛片放入沉积盒中， 分别向沉积盒中倒入上述配制好的不同体 系的多肽溶液， 50下沉积10min， 然后将其在去离子水中提拉20次， 用高纯氮气吹干后置 于。

28、氮气中保存。 0064 所得多肽单层膜标记为G-SDScac。 0065 实施例2 0066 一种多肽单层膜的制备方法， 包括以下步骤： 0067 (1)配制浓度为4wt的胶原多肽溶液50mL： 精确称取胶原多肽于100mL于三口烧 瓶中， 准确量取去离子水， 把去离子水倒入三口烧瓶中， 室温溶胀0.5h后， 将三口烧瓶放入 501的水浴中， 加热搅拌2h， 使其完全溶解， 然后用2mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节 至10.000.02， 在水浴中稳定0.5h后。 0068 (2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂SDS， 得到胶原多肽-SDS混合溶液， 混 合溶液中SDS的浓度为8.32。

29、(6wt)mmol/L； 在水浴中稳定6h备用。 0069 (3)切割大小为1cm1cm1mm的长方形钛片， 使用金相砂纸按照， 800， 1500， 3000， 5000， 7000目的顺序依次打磨抛光， 依次用去离子水， 无水乙醇， 丙酮超声清洗钛片各 15min， 然后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥12h备用。 配制30H2O2和98H2SO4体积比 为1:1的混酸溶液， 冷却至室温后， 将上述处理好的钛片用混酸处理1h， 然后用自来水冲洗 至中性， 再用去离子水清洗5次， 最后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥12h备用。 0070 (4)配制1mg/mL的PEI聚乙烯亚胺水溶液， 将上述。

30、酸蚀的钛片用PEI溶液室温处理 0.5h， 后用去离子水清洗5次， 去除掉结合不牢的电荷， 最后用高纯氮气吹干后在60烘箱 干燥12h备用。 将正离子化的钛片放入沉积盒中， 分别向沉积盒中倒入上述配制好的不同体 系的多肽溶液， 50下沉积10min， 然后将其在去离子水中提拉20次， 用高纯氮气吹干后置 于氮气中保存。 0071 所得多肽单层膜标记为G-SDS6。 0072 对比例1 说明书 5/12 页 8 CN 111840661 A 8 0073 配制浓度为15wt的胶原多肽溶液， 计算好所需的胶原多肽的质量和去离子水 的体积， 精确称取胶原多肽于50mL三口烧瓶中， 准确量取去离子水，。

31、 把去离子水倒入三口烧 瓶中， 室温溶胀0.5h后， 将三口烧瓶在50的水浴中加热搅拌2h， 使其完全溶解， 然后用 1mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节至10.000.02备用。 0074 将上述不同浓度的胶原多肽溶液进行圆二色谱仪(CD)表征， 通常用摩尔消光系数 差 (M-1cm-1)和摩尔椭圆度 来度量圆二色性的大小。 CD测试是在Chirascan系统(英国 应用光物理有限公司)上进行的， 使用氮气吹扫时流速为35mL/min。 将所有溶液中蛋白质的 浓度稀释至0.16mg/mL， 混合样品在50下平衡1h， 同时在50下， 取200 L溶液于1mm样品 池中进行测量， 测量温度保。

32、持在50。 在190260nm范围内记录光谱， 分辨率为0.2nm， 共扫 描6次。 数据处理： 减去缓冲溶液的光谱以校正基线， CD光谱以摩尔椭圆度为单位进行了归 一化， 采用峰回归计算方法和CONTIN拟合程序对二级结构含量进行了计算。 多肽浓度对其 二级结构的影响结果见图1和表3所示。 0075 表3 0076 0077 表3和图1所示， 随着多肽质量浓度的从1增加到5， -helix、 Antiparallel - sheet、 parallel -sheet结构呈现出先增加后减少的趋势， 在浓度为4时达到最大； - turn、 random coil结构呈现出先减少后增加的趋势， 在。

33、浓度为4时达到最小。 该结果表明 在4时， 多肽分子二级结构发生较大变化。 此浓度正好处于多肽分子接触浓度和缠结浓度 交界区域。 因此， 本发明在制备胶原多肽单层膜时， 将多肽的质量浓度优选为4。 0078 对比例2 0079 一种多肽单层膜的制备方法， 与实施例1相比， 不同之处在于， 在单层膜在制备过 程中不添加表面活性剂， 仅将多肽沉积到正离子化的钛片上， 其他条件与实施例1相同。 0080 将浓度为4的多肽溶液沉积到用PEI处理的钛金属片上， 沉积温度50， 沉积时 间10min、 提拉次数20， 多肽分子排列松散， 详见图2。 所得多肽单层膜标记为G。 0081 对比例3 0082 。

34、一种多肽单层膜的制备方法， 包括以下步骤： 0083 (1)配制浓度为4wt的胶原多肽溶液50mL： 精确称取胶原多肽于100mL于三口烧 瓶中， 准确量取去离子水， 把去离子水倒入三口烧瓶中， 室温溶胀0.5h后， 将三口烧瓶放入 501的水浴中， 加热搅拌2h， 使其完全溶解， 然后用2mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节 至10.000.02， 在水浴中稳定0.5h后。 0084 (2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂SDS， 得到胶原多肽-SDS混合溶液， 混 说明书 6/12 页 9 CN 111840661 A 9 合溶液中SDS的浓度为7.50mmol/L(CMC， 50时， 。

35、SDS的临界胶束浓度)； 在水浴中稳定6h备 用。 0085 (3)切割大小为1cm1cm1mm的长方形钛片， 使用金相砂纸按照， 800， 1500， 3000， 5000， 7000目的顺序依次打磨抛光， 依次用去离子水， 无水乙醇， 丙酮超声清洗钛片各 15min， 然后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥12h备用。 配制30H2O2和98H2SO4体积比 为1:1的混酸溶液， 冷却至室温后， 将上述处理好的钛片用混酸处理1h， 然后用自来水冲洗 至中性， 再用去离子水清洗5次， 最后用高纯氮气吹干后在60烘箱干燥12h备用。 0086 (4)配制1mg/mL的PEI聚乙烯亚胺水溶液， 将上。

36、述酸蚀的钛片用PEI溶液室温处理 0.5h， 后用去离子水清洗5次， 去除掉结合不牢的电荷， 最后用高纯氮气吹干后在60烘箱 干燥12h备用。 将正离子化的钛片放入沉积盒中， 分别向沉积盒中倒入上述配制好的不同体 系的多肽溶液， 50下沉积10min， 然后将其在去离子水中提拉20次， 用高纯氮气吹干后置 于氮气中保存。 0087 所得多肽单层膜标记为G-SDScmc。 0088 1.多肽单分层膜厚度测定 0089 用PEI处理的钛金属片沉积胶原多肽后， 多肽分子中的-COO-与PEI中的-NH3+可以 形成强的离子键。 为了验证胶原多肽分子是通过离子键而不是物理吸附与基底结合的， 测 量了多。

37、肽单层膜在沉积过程中不同提拉次数的荧光强度。 随着提拉次数的增加(520次)， 通过物理吸附到基底的多肽会被洗掉而由离子键结合的则会牢固地固定在基底上。 由图3 可以看出， 提拉15次后， 荧光强度不再降低， 表明通过物理吸附到基底上的胶原多肽已被去 除。 0090 本发明使用Multimode8型AFM(Bruker， 德国)对膜表面形貌进行研究。 将多肽单层 膜样品置于工作台上， 以Peak Force模式对样品形貌进行测试。 膜厚的测量： 使用沉积法制 备多肽单层膜时， 用锡纸包裹钛片的一半， 使其不被溶液沾染。 测试时， 先用原子力显微镜 自带的光学辅助系统找到钛片的边界， 然后把测试。

38、范围设置为20 m以横跨基底和样品区 域， 沿边界用AFM针尖进行扫描， 从对应于膜基质的高度一直到边界底部， 扫描3个不同区域 以获得平均膜厚。 扫描速度0.977Hz， 扫描范围20 m、 10 m、 5 m、 1 m， 数据处理软件为AFM自 带的NanoScope Analysis。 0091 从图4的AFM图像中可以发现， 实施例2所得多肽单层膜(G-SDS6)的平均厚度约为 14.2nm。 另外， 实施例12所得胶原多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒组成的， 球形纳米颗 粒的平均粒径约为60nm。 0092 2.多肽单分层膜表面伯氨基暴露量的测定 0093 对实施例12及对比例2、 3。

39、所得样品进行了XPS表征， 并对其N元素进行了分峰处 理。 伯胺的结合能为400.05eV， 酰胺键为398.89eV， 仲胺为398.26eV。 使用XPS数据通过检测 结合能和局部化学状态的变化， 对官能团进行半定量分析。 N 1s核心区域(从396至402eV) 的高分辨率光谱和伯氨基暴露量， 如图5所示， 多肽单层膜(G-SDS6)的伯氨基暴露量为 13.13， 多肽单层膜(G-SDScac)的伯氨基暴露量为12.47， 而多肽单层膜(G-SDScmc)的伯 氨基暴露量为11.41， 多肽单层膜(G)的伯氨基暴露量仅为2.89。 使用CasaXPS对N1s高 分辨率图谱进行分峰并计算伯。

40、氨基含量XPS和Raman的结果表明， 胶原多肽单层膜中氨基暴 露量不仅与增加的 -sheet和random coil结构有关， 而且与在不同表面活性剂浓度下， 胶 说明书 7/12 页 10 CN 111840661 A 10 原多肽和表面活性剂的非共价相互作用有关。 0094 3.膜表面润湿性、 荷电性质测定 0095 对膜样品采用DSA-100型光学接触角测量仪(Kruss公司， 德国)在室温下测量了样 品的水接触角(CA)。 使用自动分配控制器将2mL去离子水滴到样品上， 并使用Laplace- Young拟合算法自动确定CA。 通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值， 并用数码相机。

41、 (日本索尼有限公司)拍摄图像。 使用SurPASS电动固体表面分析仪测定膜表面Zeta电位。 0096 使用1mM Na2SO4溶液作为电解质测定膜表面Zeta电位。 图6显示了含SDS的胶原多 肽单层膜表面的Zeta电位。 表面Zeta电位的数值大小排序为： 4wt.多肽单层膜G-SDScmc G-SDScacG-SDS6。 结果表明， 当SDS浓度为6wt.和CAC时， 可检测到更高的Zeta电位值。 与 XPS分析的结果结合比较， Zeta电位的增加应该是由于伯氨基含量的增加。 氨基暴露于表面 促进了正电荷性质。 4wt.多肽单层膜的Zeta电位： -15.6mV； G-SDScmc单。

42、层膜的Zeta电位： - 2.29mV； G-SDScac多肽单层膜的Zeta电位： -0.85mV； G-SDS6多肽单层膜的Zeta电位： 4.907mV。 表面高电位能提高细胞的粘附、 增殖和分化能力。 0097 表面的润湿性可以直接通过水的接触角值反映出来， 如图6所示。 纯Ti片表现出疏 水性， 接触角为101.40.2 ， 4wt.胶原多肽单层膜表面显示的接触角为56.11.2 。 G- SDScmc的表面接触角84 ， 而在G-SDScac和G-SDS6表面上发现了接触角约为10 的超亲水 表面， 如图7所示。 结果表明， 润湿性与伯氨基暴露和单层膜结构有关。 其超亲水特性可在表。

43、 面形成一层水化膜， 防止蛋白吸附； 利用其超亲水特性将表面涂层材料应用在心血管支架 中， 能够防止蛋白吸附， 避免引起心血管的再次堵塞。 0098 4.多肽单层膜中多肽二级结构含量计算 0099 在酰胺基团的振动中， 酰胺I和酰胺带的拉曼峰对蛋白质主链的构象变化非常 敏感。 对于酰胺带来说， -helix， -sheet， -turn， random coil这四种二级结构分别位 于： 1265-1300cm-1， 1230-1240cm-1， 1305cm-1， 1240-1260cm-1。 通过拉曼光谱对在Ti表面上组 装的G-SDS的SAMs进行表征， 酰胺III带的拉曼光谱揭示了有关。

44、胶原多肽单层膜二级结构的 表面敏感信息。 采用显微共焦拉曼光谱仪表征多肽单层膜表面二级结构含量， 测试方法为： 用配备有He-Ne激光器(632.8nm)和600凹槽mm-1光栅的LabRAM HR800(Horiba JY， 法国)光 谱仪记录样品的振动拉曼光谱图。 拉曼强度的测量精度约为1.2cm-1。 在激光功率为1.1mw， 辐照1s， 30次积累的条件下， 获得了样品的拉曼参考光谱。 用0.06mW的激光功率， 1s的照 射时间和10次扫描获得PEI修饰的样品和胶原多肽覆盖样品的拉曼光谱。 在所有拉曼实验 中， 都仔细控制了平台的方向， 以使输入激光的偏振器平行于领结轴。 光谱处理在。

45、Systat软 件的PeakFit上进行。 确定基线， 以去卷积谱和三阶导数谱为参考确定各子峰位置。 这有助 于分辨重叠的子峰， 并将干扰与噪声峰值区分开。 曲线拟合法用于获得二级结构的百分比。 然后， 改变每个子峰的峰高， 半峰宽和高斯含量， 以使曲线拟合的均方根误差最小， 并用次 峰面积表征。 采用曲线拟合的方法对原始光谱的酰胺谱带进行了分析。 在酰胺III带区 域， -helix， -sheet， -turn和random coil结构的典型吸收峰分别为1265-1300cm-1， 1230-1240cm-1， 1305cm-1和1240-1260cm-1。 0100 多肽单层膜表面二级。

46、结构含量见表4所示， 通过添加不同浓度的SDS， 单层膜中 - helix， -sheet， -turn和random coil含量发生了变化。 当SDS的浓度从CAC增加到6wt 时， -helix和 -turn的总含量减少， 而 -sheet和random coil的总含量增加。 在SDScac中， 说明书 8/12 页 11 CN 111840661 A 11 -helix和 -turn的总含量达到约60。 然而， 在SDS6时， -sheet和random coil的总含量 约为57。 另外， -helix的含量在含SDS的胶原多肽单层膜中显着增加。 0101 表4 0102 0103。

47、 5.膜表面伯氨基分布点表征 0104 探针合成： 合成对伯氨基响应荧光探针分子四苯乙烯(TPE)-异硫氰酸酯(ITC)， 对 多肽单层膜表面的伯氨基分布进行直观表征。 具体为1-4-(异硫氰酸甲酯)苯基-1,2,2- 三苯基乙烯(TPE-ITC)， 四苯基乙烯(TPE)和异硫氰酸酯(ITC)的加合物。 0105 0106 合成步骤如上式(1)， 具体分5步： 在250mL双颈圆底烧瓶中， 在N2下将5.05g (30mmol)二苯基甲烷溶于100mL蒸馏四氢呋喃中。 混合物冷却至0后， 通过注射器缓慢加 入15mL(2.5M己烷溶液， 37.5mmol)正丁基锂。 将混合物在0搅拌1小时。 。

48、然后将4.91g (25mmol)4-甲基二苯甲酮加入到反应混合物中。 将混合物加热至室温并搅拌6小时。 合成化 合物3。 0107 将反应混合物用饱和氯化铵溶液猝灭， 然后用二氯化碳萃取。 收集有机层并浓 缩。 将粗产物和0.20g对甲苯磺酸溶于100mL甲苯中。 将该混合物加热回流4小时。 冷却至室 温后， 反应混合物用二氯化碳萃取。 收集有机层并浓缩。 通过使用己烷作为洗脱剂的硅胶色 谱法纯化粗产物， 得到白色固体4。 0108 在250mL圆底烧瓶中， 将5.20g(15.0mmol)4， 2.94g(16.0mmol)N-溴代琥珀酰亚 胺， 0.036g过氧化苯甲酰在80mL四氯化碳。

49、中的溶液回流12小时。 反应完成后， 混合物用二氯 甲烷和水萃取。 将有机层合并， 用无水硫酸镁干燥。 通过使用己烷作为洗脱剂的硅胶色谱法 纯化粗产物， 得到5， 为白色固体。 0109 在250mL双颈圆底烧瓶中， 在N2下将1.70g(4mmol)5和0.39g(6mmol)叠氮化钠溶 说明书 9/12 页 12 CN 111840661 A 12 于二甲基亚砜中。 将混合物在室温下搅拌过夜(25， 48h)。 然后加入大量(100mL)水， 溶液 用乙醚萃取三次。 将有机层合并， 用无水硫酸镁干燥。 通过使用己烷/氯仿(v/v3:1)作为 洗脱剂的硅胶色谱法纯化粗产物， 得到6， 为白色。

50、固体。 0110 将叠氮基官能化的四苯乙烯(6； 0.330g， 0.852mmol)和三苯基膦(0.112g， 0.426mmol)加入到双颈烧瓶中， 其在真空下抽空并用干燥氮气冲洗三次。 将二硫化碳 (0.55g， 7.242mmol)和蒸馏过的二氯甲烷(50mL)加入烧瓶中搅拌。 将所得反应混合物回流 过夜， 然后减压除去溶剂。 粗产物用冷乙醚(250mL)沉淀， 过滤沉淀并洗涤三次。 最后将产物 真空干燥得到TPE-ITC， 为白色固体。 0111 首先对合成产物(四苯乙烯(TPE)-异硫氰酸酯(ITC)进行核磁氢谱表征。 产物的 1H NMR由AVANCE II 400核磁共振波谱仪。