过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针、制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010745792.0 (22)申请日 2020.07.29 (71)申请人 湖南文理学院 地址 415000 湖南省常德市洞庭大道3150 号 (72)发明人 张春香谷标申有名张向阳 (74)专利代理机构 北京风雅颂专利代理有限公 司 11403 代理人 曾志鹏 (51)Int.Cl. C07F 9/32(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探 针、 制备方法。

2、和应用 (57)摘要 本发明涉及一种过氧亚硝酰阴离子比率远 红外荧光探针、 制备方法和应用， 过氧亚硝酰阴 离子比率远红外荧光探针的结构式如下： 本申请的荧光探针， 是一种高选择性、 低检测下线、 较大的伪斯托克 斯位移以及比率远红外ONOO荧光探针， 能满足 医学能对ONOO引起的病变及时诊断的需求。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 111848671 A 2020.10.30 CN 111848671 A 1.一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针， 其特征是， 结构式如下： 2.一种如权利要求1所述的过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针的制备方法， 其特 征是， 步骤为： 将化。

3、合物ANI和碘乙烷溶于有机溶剂中， 搅拌回流， 待反应完成后， 过滤， 得到过氧亚硝 酰阴离子比率远红外荧光探针， 所述化合物ANI的结构为： 3.如权利要求2所述的制备方法， 其特征是， 所述化合物ANI和碘乙烷的摩尔比为1:2。 4.如权利要求2或3所述的制备方法， 其特征是， 所述有机溶剂为无水乙腈。 5.如权利要求3所述的制备方法， 其特征是， 所述化合物ANI和无水乙腈的重量比为10- 15:1。 6.一种如权利要求1所述的过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针在检测过氧亚硝酰 阴离子中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111848671 A 2 一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外。

4、荧光探针、 制备方法和 应用 技术领域 0001 本发明属于离子检测技术领域， 具体是涉及到一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外 荧光探针、 制备方法和应用。 背景技术 0002 过氧亚硝酸酰阴离子(ONOO-)是体内最重要的活性氧之一， 在生命活动中起着至 关重要的作用。 正常浓度的过氧亚硝酸酰阴离子在生理和病理过程中起到信号转导和抗菌 作用。 然而， 由于ONOO-较强的氧化氧化和亲核能力， 高浓度的ONOO-对许多生物分子造成损 伤， 如蛋白质、 脂类、 DNA等， 从而可能影响细胞生长过程以及导致细胞坏死和凋亡。 因此发 展一种高选择、 灵敏检测的方法用于ONOO-的检测具有重要意义。 近几。

5、年来， 发展了许多用 于ONOO-检测的方法比如电子顺磁共振法、 电化学法、 色谱法、 化学发光和紫外-可见吸收光 谱法荧光探针法等， 但是上述检测方法需要大型仪器， 耗时耗力， 不适用于生物体内ONOO- 的原位、 实时快速定量分析。 0003 荧光探针法由于具有高灵敏性、 实时性、 较高的时空分辨性以及可以直接用于生 物体中活性物质的检测等优势， 广泛用于生物体中ONOO-的检测。 然而， 目前用于ONOO-检测 的荧光探针大多以开-关型以及短发射波长为主， 其中开-关型荧光探针易环境条件的改 变、 光漂白以及样品浓度的变化的影响； 短发射波长荧光探针不能对生物体中深层组织检 测、 对光有。

6、较大的损伤以及易受激发光的干扰。 因此， 上述荧光探针不利于ONOO-的精准检 测以及对深层组织ONOO-的检测。 另外， 较小的伪斯托克斯位移的荧光探针易受到生物体荧 光的干扰。 0004 用于细胞内H2O2和ONOO-检测的荧光探针的设计合成与生物分析应用， 杨秀娥， 2016年山东师范大学硕士论文， 第一章2.3节公开了过氧亚硝基阴离子荧光探针的研究进 展， 有荧光光谱法、 紫外可见光谱法、 化学发光法、 电化学方法、 酶学法和免疫组织化学法 等， 包括如下探针化合物， 如： 0005等， 说明书 1/6 页 3 CN 111848671 A 3 0006苯基酰肼类苯并噻唑(BT)类 0。

7、007 以花菁为荧光母体， 二价硒为响应基团的探针 0008以香豆素和半花菁为荧光骨架的比率型探针CHCN 0009以派洛宁为荧光母体 0010中国专利申请201810684964.0公开了对称的化合物 说明书 2/6 页 4 CN 111848671 A 4 发明内容 0011 本发明要解决的技术问题是提供一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针、 制 备方法和应用， 具有高选择性， 低检测下线以及较大的伪斯托克斯位移。 0012 本发明的内容包括一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针， 结构式如下： 0013 0014 一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针的制备方法， 步骤为： 0015 。

8、将化合物ANI和碘乙烷溶于有机溶剂中， 搅拌回流， 待反应完成后， 过滤， 得到过氧 亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针， 所述化合物ANI的结构为： 0016 0017 所述化合物ANI和碘乙烷的摩尔比为1:2； 所述有机溶剂为无水乙腈； 所述化合物 ANI和无水乙腈的重量比为10-15:1。 0018 具体的反应过程为： 0019 0020 所述化合物ANI的制备方法为， 将化合物AN和二苯基次磷酰氯溶于三乙胺和有机 溶剂(优选为无水四氢呋喃)中， 搅拌， 反应得到化合物ANI； 化合物AN的结构为： 0021 0022 所述化合物AN、 二苯基次磷酰氯和三乙胺的摩尔比为1:1.5:1.5。 。

9、0023 本申请还提供一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针在检测过氧亚硝酰阴 说明书 3/6 页 5 CN 111848671 A 5 离子中的应用。 0024 本发明的有益效果是， 本申请的荧光探针， 是一种高选择性、 低检测下线、 较大的 伪斯托克斯位移以及比率远红外ONOO-荧光探针， 能满足医学能对ONOO-引起的病变及时诊 断的需求。 0025 本申请以异佛尔酮吡啶盐为荧光基团， 二苯基次磷酰酯为识别基团， 探针ANI-DP 自身由于羟基被保护， 在535nm处有荧光发射。 当加入过氧亚硝酰阴离子时， 过氧亚硝酰阴 离子与二苯基次磷酰酯发生亲核加成反应， 二苯基次磷酰酯脱去， 生成。

10、酚羟基， 荧光红移至 628nm。 0026 相比于本发明人先前申请的荧光探针， 即： 0027 0028 其中， R基团为-H、 -OH、 -Cl或-OCH3； 本申请的反应机理不同， 本申请属于分子内质 子转移(ICT)机理， 属于比率远红外荧光探针， 伪斯托克斯位移较大， 不易受环境条件的改 变、 光漂白以及样品浓度变化的影响。 0029 本申请的荧光探针对过氧亚硝酰阴离子检测下线比较低， 为13.3nM， 说明该探针 比较灵敏。 附图说明 0030 图1为探针化合物ANI-DP的1H NMR图谱。 0031 图2为探针化合物ANI-DP的13C NMR图谱。 0032 图3为探针化合物。

11、ANI-DP加入(带竖直线的线条)和不加ONOO-的紫外可见光吸收 光谱图。 0033 图4为探针化合物ANI-DP与ONOO-作用前后的荧光强度变化图。 0034 图5为本发明荧光探针的荧光强度(I628/I535)比值和ONOO-浓度线性关系图。 0035 图6为探针化合物ANI-DP与ONOO-作用前后荧光强度(I628/I535)比值随pH的变化 图。 0036 图7为探针化合物ANI-DP与ONOO-作用前后荧光强度(I628/I535)比值随时间的变化 图。 0037 图8为探针化合物ANI-DP与不同的生物活性物种作用后的荧光强度(I628/I535) 比值变化图。 0038 (。

12、1)ANI-DP， (2)Zn2+， (3)Fe3+， (4)K+， (5)Al3+， (6)Cu2+， (7)NO2-， (8)NO3-， (9)F-， (10) Cl-， (11)Br-， (12)CO32-， (13)H2PO4-， (14)AcO-， (15)Cys， (16)Hcy， (17)GSH， (18)H2O2， (19) HClO， (20)HO-， (21)tBuHO-， (22)ROO-， (23)O2-， (24)1O2-， (25)ONOO-。 说明书 4/6 页 6 CN 111848671 A 6 具体实施方式 0039 实施例1 0040 将化合物AN(400。

13、mg， 1mmol)、 二苯基次磷酰氯(0.356mg， 1 .5mmol)和三乙胺 (0.21mL)溶于10mL无水四氢呋喃中， 溶液搅拌室温反应12小时， 待反应完成后， 旋干柱层析 的产品ANI(0.288mg， 产率48)。 0041 1H NMR(400MHz,DMSO-d6) (ppm):8.60(d,J6.4Hz,2H),7.94-7.85(m,5H),7.65- 7.62(m,4H),7.58-7.53(m,4H),7.30(d,J8.0Hz,2H),7.12(d,J8.0Hz,2H),5.53(s, 2H) ,2.51(s,2H),1.01(s,6H)； 13C NMR(10。

14、0MHz,DMSO-d6)(ppm):166.5,162.0,154.7, 154.1,151.8,150.3,145.3,135.5,133.3,132.0,131.7,130.6,130.4,129.7,129.5, 129.4,125.9,124.0,122.1,121.5,121.4,117.3,116.5,98.2,97.5。 0042 将化合物ANI(600mg， 1mmol)和碘乙烷(940mg， 2mmol)溶于5mL无水乙腈中， 溶液搅 拌回流反应8小时， 待反应完成后， 过滤， 收集黄色产品470mg， 产率62)。 0043 1H NMR(400MHz， DMSO-d6)。

15、(ppm):9.12(d， J6.8Hz,2H)， 8.13(d,J6.8Hz,2H)， 7.94-7.85(m,5H)， 7.66-7.62(m,4H)， 7.57-7.54(m,4H)， 7.30(d,J8.0Hz,2H)， 7.14(d,J 6.0Hz,2H)， 5.59(s,2H)， 4.62(q,2H)， 2.66(s,2H)， 2.49(s,2H)， 1.55(t,3H)， 1.02(s, 6H)； 13C NMR(100MHz,DMSO-d6)(ppm):167.0,164.0,161.6,155.8,154.6,152.1,151.8, 144.9,135.8,133.4,13。

16、2.0,131.9,131.7,130.3,129.5,127.8,125.5,123.9,121.4,99.7, 64.5,56.3,44.8,31.9,28.1,16.7。 具体如图1-2所示。 0044 总反应式为： 0045 0046 实施例2 0047 一、 探针ANI-DP对ONOO-响应的吸收光谱和荧光光谱 0048 将探针化合物ANI-DP溶于DMSO中， 配置成1mmol/L的溶液。 向移取的探针ANI-DP溶 液中加入DMSO和PBS缓冲液(pH7.4)， 配置成10 M(DMSO： PBS10:90， V/V)的待测溶液。 向 待测溶液加入ONOO-， 用紫外光谱和荧光光。

17、谱仪测试其荧光发射光谱的变化情况。 由图3可 知， 探针ANI-DP在388nm处有强的吸收峰， 加入ONOO-之后， 探针ANI-DP在451nm处有出现了 新的吸收峰。 由图4可知， 探针ANI-DP自身在535nm处有发射峰， 加入ONOO-之后， 探针在 628nm处出现了强荧光发射峰， 并且该发射峰强度随着ONOO-浓度的增加而增强， 而535nm处 发射峰则逐渐减弱。 0049 该探针ANI-DP可以对ONOO-实现比率远红外检测， 其伪斯托克斯位移可达到 177nm。 由图5通过计算可得测下线为13.3nM(计算公式为3 /k， 其中 为空白样品连续测定 多次的标准偏差， k为标。

18、准曲线斜率)。 0050 二、 pH值变化对探针ANI-DP与ONOO-作用的荧光强度(I554/I473)比值影响 0051 在不同的pH条件下， 测试了探针ANI-DP对ONOO-的荧光强度比值(I628/I535)变化。 说明书 5/6 页 7 CN 111848671 A 7 由图6可知， pH为2-4时， 探针ANI-DP的荧光强度比值(I628/I535)逐渐增强， pH为4-10时， 探针 ANI-DP的荧光强度比值(I628/I535)达到最佳， 并保持不变。 因此， 探针ANI-DP可在生理pH条 件下实现对ONOO-的检测。 0052 三、 探针ANI-DP对ONOO-的时。

19、间研究 0053 为了考察探针ANI-DP对ONOO-响应的时间， 测试了探针ANI-DP对ONOO-的荧光强度 比值(I628/I535)随时间变化情况。 由图7可知， 在探针ANI-DP溶液加入ONOO-后， 荧光强度比 值(I628/I535)随时间的变化而逐渐增强， 荧光强度比值(I628/I535)在20分钟内达到最大， 说 明探针ANI-DP可实时检测ONOO-。 0054 四、 探针ANI-DP对ONOO-的选择性研究 0055 在探针ANI-DP溶液中分别加入不同的生物活性物种， 分别测试了探针ANI-DP的荧 光强度比值(I628/I535)变化情况。 由图8可知， 在探针A。

20、NI-DP溶液中加入ONOO-后， 荧光强度 比值(I628/I535)发生了明显的改变， 而加入其它生物活性物种， 荧光强度比值(I628/I535)几 乎没有发生变化， 说明探针ANI-DP能够选择性的实现ONOO-检测。 说明书 6/6 页 8 CN 111848671 A 8 图1 说明书附图 1/5 页 9 CN 111848671 A 9 图2 图3 说明书附图 2/5 页 10 CN 111848671 A 10 图4 图5 说明书附图 3/5 页 11 CN 111848671 A 11 图6 图7 说明书附图 4/5 页 12 CN 111848671 A 12 图8 说明书附图 5/5 页 13 CN 111848671 A 13 。