基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010791405.7 (22)申请日 2020.08.07 (71)申请人 中国人民解放军总医院 地址 100036 北京市海淀区复兴路28号 (72)发明人 刘煜凡杨思明付小兵黄沙 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11419 代理人 王玉松宋丹丹 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) C12N 5/071(2010.01) (54)发明名称 基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细 胞向汗腺分化的方法 (57。

2、)摘要 本发明提供了一种基于3D生物打印技术高 效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法， 该方法 包括如下步骤： (1)将生物墨水、 MSC悬浮液和小 鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打 印得到含MSC的3D打印基质； (2)将含有MSC的3D 打印基质进行交联； (3)将交联后3D打印基质进 行培养获得汗腺细胞； 其中， 生物墨水的杨氏模 量为160380kPa， 且孔隙率为0.50.7； 本发明所 提供的3D生物打印基质在不改变微观结构的前 提下改进了水凝胶生物墨水的硬度， 该方法实现 了对皮肤真皮基质硬度的模拟， 实验结果表明， 该方法构建的3D生物打印基质能够更高效的诱 导MSC向。

3、功能性汗腺分化。 权利要求书2页 说明书14页 附图2页 CN 111849888 A 2020.10.30 CN 111849888 A 1.一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)将生物墨水、 MSC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打印得到 含MSC的3D打印基质； (2)将含有MSC的3D打印基质进行交联； (3)将交联后3D打印基质进行培养获得汗腺细胞； 其中， 生物墨水的杨氏模量为160-380kPa， 且孔隙率为0.5-0.7。 2.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方。

4、 法， 其特征在于， 步骤(1)的含MSC的3D打印基质的制备方法如下： 取体积比为2:0.25-2:18 的浓度为1.0107cell/ml的MSC悬浮液、 小鼠足趾部真皮基质匀浆和生物墨水混合均匀后 密封在无菌打印注射器中， 将密封后的无菌打印注射器放置在4冷却15-30min后， 将无菌 打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上， 设置温度为15， 同时将培养皿放在3D生物 打印平台， 设置温度为4， 使用打印喷嘴构建含MSC的3D打印基质， 即得载有MSC的3D打印 基质。 3.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 步骤(2)所述将。

5、含有MSC的3D打印基质进行交联的具体方法为： 将载有MSC 的3D打印基质用浓度为2-3的氯化钙溶液交联8-12min， 氯化钙溶液浸没3D打印基质。 4.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 步骤(3)进行培养获得汗腺细胞具体包括以下步骤： 先将交联后的载有MSC 的3D打印基质用DMEM培养基培养3天， 3天后再用汗腺专用培养基培养， 所述DMEM培养基和 所述汗腺专用培养基均是每两天更换一次； 培养基培养的条件为放置于37， 5CO2的无 菌培养箱中培养。 5.如权利要求4所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的。

6、方 法， 其特征在于， 所述DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5-15(v/v)的胎牛血清FBS， 0.8-1.2(v/v)双抗溶液， 所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。 6.如权利要求4所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 所述汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的 比例混合， 充分混匀后加入1-3ng/mL三碘甲状腺原氨、 4-6(v/v)胎牛血清FBS、 8-12ng/mL EGF、 0 .3-0 .5g/mL半琥珀酰氢化考的松、 0 .8-1 .2(v/v)双抗溶液和0 .8-1 .2mL/ 10。

7、0mLITS， 所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。 7.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 所述生物墨水通过以下方法制备而成： 称取3.5-4.5重量份的海藻酸钠和9-11重量份的明胶均匀混合， 置入装有90-110重量 份的超纯水中搅拌均匀制得海藻酸钠-明胶混悬液； 待海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠 和明胶完全溶解于超纯水时， 制得生物墨水。 8.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 所述海藻酸钠与所述明胶、 超纯水的质量比为4:10:100。 9.如权利要求7所述的基于3D。

8、生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 将海藻酸钠与明胶置入超纯水中搅拌均匀后， 还包括以下步骤： 将海藻酸 权利要求书 1/2 页 2 CN 111849888 A 2 钠-明胶混悬液于40-80条件下放置8-20小时， 即可使海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸 钠和明胶完全溶解于超纯水中。 10.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方 法， 其特征在于， 海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水后还包括以 下步骤： 将打印基质通过巴氏消毒法灭菌， 灭菌条件为： 在60-80条件下灭菌10-60分钟； 再在1-8条件下灭。

9、菌3-10分钟， 循环交叉灭菌3次。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111849888 A 3 基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法 技术领域 0001 本发明涉及干细胞分化技术领域， 特别涉及基于3D生物打印技术高效诱导间充质 干细胞向汗腺分化的方法。 背景技术 0002 覆盖在机体表面的皮肤是机体最大的器官， 其强大的防御能力能够为机体抵御感 染、 损伤以及烧(创)伤等各种外界环境的侵害。 维持机体的热平衡是机体能够正常运转的 重要环节， 热平衡的失调会导致一系列严重的并发症， 如中暑、 高热、 热惊厥、 热休克甚至是 死亡。 汗腺作为皮肤附属器之一， 其正常的发。

10、汗功能是机体维持热平衡的最重要的途径。 由 此可见， 汗腺的存在以及功能的完整对于机体来说是不可或缺的。 在临床上， 烧(创)伤引起 的大面积真皮层皮肤缺失是导致汗腺缺失最主要的原因。 因此， 在烧(创)伤领域的研究中， 针对含汗腺的皮肤再生的相关研究是该领域内不可回避的重要部分。 0003 在既往研究中， 针对汗腺细胞再生的研究多集中在二维结构， 这不仅无法模拟细 胞在机体中所处的三维立体环境， 也无法有效地研究物理因素对干细胞分化的影响。 仅有 的少数关于三维环境下汗腺再生的研究， 也因三维架构的硬度较低导致其研究成果难以实 现临床转化。 0004 现有关于汗腺修复的的研究较少， 如申请号。

11、:CN201910895337.6的专利公开了一 种诱导汗腺功能性修复的方法， 该方法主要应用质粒转染技术诱导表皮干细胞向汗腺细胞 分化， 并未考虑三维环境以及物理因素对干细胞的影响， 且该方法中汗腺细胞的分别必须 依赖表皮干细胞， 应用范围有限。 发明内容 0005 为了解决以上技术问题， 本发明提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质 干细胞向汗腺分化的方法， 该方法包括如下步骤： 0006 (1)将生物墨水、 MSC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打印 得到含MSC的3D打印基质； 0007 (2)将含有MSC的3D打印基质进行交联； 0008 (3)将交联后3D打。

12、印基质进行培养获得汗腺细胞； 0009 其中， 生物墨水的杨氏模量为160-380kPa， 且孔隙率为0.5-0.7。 0010 表皮干细胞与汗腺细胞为同谱系分化， 难度较小。 而间充质细胞向汗腺细胞分化 为跨谱系分化， 难度更大。 在临床转化应用中， 间充质干细胞的易获取性以及汗腺的重要功 能使得针对间充质干细胞向汗腺细胞分化的研究有着重要的意义， 现有的关于生物墨水中 的汗腺分化研究， 所应用的水凝胶生物墨水强度低导致其可成型性较差， 临床转化难度大， 本发明针对该技术难题进行研究， 发现当使用杨氏模量为160-380kPa， 且孔隙率为0.5-0.7 的生物墨水与SC悬浮液和小鼠足趾部真。

13、皮基质匀浆打印得到的3D打印基质再进行交联、 培 说明书 1/14 页 4 CN 111849888 A 4 养， 得到的类汗腺细胞团更大， 杨氏模量适中。 0011 进一步地， 步骤(1)的含MSC的3D打印基质的制备方法如下： 取体积比为2:0.25-2: 18的浓度为1.0107cell/ml的MSC悬浮液、 小鼠足趾部真皮基质匀浆和生物墨水混合均匀 后密封在无菌打印注射器中， 将密封后的无菌打印注射器放置在4冷却15-30min后， 将无 菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上， 设置温度为15， 同时将培养皿放在3D生 物打印平台， 设置温度为4， 使用打印喷嘴构建含MSC的3D打。

14、印基质， 即得载有MSC的3D打 印基质。 0012 进一步地， 步骤(2)所述将含有MSC的3D打印基质进行交联的具体方法为： 将载有 MSC的3D打印基质用浓度为2-3的氯化钙溶液交联8-12min， 氯化钙溶液浸没3D打印基 质。 0013 进一步地， 步骤(3)进行培养获得汗腺细胞具体包括以下步骤： 先将交联后的载有 MSC的3D打印基质用DMEM培养基培养3天， 3天后再用汗腺专用培养基培养， 所述DMEM培养基 和所述汗腺专用培养基均是每两天更换一次； 培养基培养的条件为放置于37， 5CO2的 无菌培养箱中培养。 0014 进一步地， DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5。

15、-15(v/v)的胎牛血清FBS， 0.8-1.2(v/v)双抗溶液， 所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。 0015 进一步地， 汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的 比例混合， 充分混匀后加入1-3ng/mL三碘甲状腺原氨、 4-6(v/v)胎牛血清FBS、 8-12ng/mL EGF、 0 .3-0 .5g/mL半琥珀酰氢化考的松、 0 .8-1 .2(v/v)双抗溶液和0 .8-1 .2mL/ 100mLITS， 所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。 0016 进一步地， 所述生物墨水通过以下方法制备而成： 0017 称取3.5-4.5重量份的海藻。

16、酸钠和9-11重量份的明胶均匀混合， 置入装有90-110 重量份的超纯水中搅拌均匀制得海藻酸钠-明胶混悬液； 待海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻 酸钠和明胶完全溶解于超纯水时， 制得生物墨水。 0018 进一步地改进， 海藻酸钠与所述明胶、 超纯水的质量比为4:10:100。 0019 进一步地改进， 将海藻酸钠与明胶置入超纯水中搅拌均匀后， 还包括以下步骤： 将 海藻酸钠-明胶混悬液于40-80条件下放置8-20小时， 即可使海藻酸钠-明胶混悬液中的 海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水中。 0020 进一步地改进， 海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水后 还包括以下步骤： 将打印。

17、基质通过巴氏消毒法灭菌， 灭菌条件为： 在60-80条件下灭菌10- 60分钟； 再在1-8条件下灭菌3-10分钟， 循环交叉灭菌3次； 0021 优选地， 在70条件下灭菌30分钟； 再在4条件下灭菌5分钟， 循环交叉灭菌3次。 0022 70下灭菌30min， 再在5下灭菌5min， 这是一个循环， 一共进行3个循环； 巴氏消 毒法即完成。 0023 本发明所提供的生物生物墨水在不改变微观结构的前提下改进了水凝胶生物墨 水的硬度， 该方法实现了对皮肤真皮基质硬度的模拟， 实验结果表明， 该方法构建的生物墨 水能够更高效的诱导MSC向功能性汗腺分化。 说明书 2/14 页 5 CN 1118。

18、49888 A 5 附图说明 0024 附图1.为空白组、 实施例1-3和对照例1的生物墨水的杨氏模量对比柱状图和孔隙 率对比柱状图； 0025 附图2.为打印后7天时用扫描电子显微镜观察空白组、 实施例1-3和对照例1的生 物墨水的微观结构； 0026 附图3.为各组生物墨水中间充质干细胞表达汗腺表面标记物蛋白相关基因的差 异。 具体实施方式 0027 下面结合实施例， 对本发明进一步说明； 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围； 本发明中所使用的设备， 如无特殊规定， 均为 本领域内常用的设备； 本发明中所使用的方法， 如无特殊规定， 均为本领域内。

19、常用的方法。 0028 实施例1 0029 本实施例提供了一种生物墨水， 该生物墨水由以下方法制备而成： 使用微量称量 仪称取3.5g海藻酸钠粉剂和9g明胶粉剂， 将海藻酸钠和明胶均匀混合后， 置入装有110mL超 纯水的容量瓶中， 然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液， 将海 藻酸钠-明胶混悬液在40条件下放置20小时以使其完全溶解， 然后通过巴氏消毒法灭菌， 灭菌条件为： 在60条件下灭菌60分钟； 再在1条件下灭菌3分钟， 循环交叉灭菌3次， 灭菌 后， 将生物墨水密封并保存在4待用。 0030 实施例2 0031 本实施例提供了一种生物墨水， 该生物墨水由以下方法。

20、制备而成： 使用微量称量 仪称取4g海藻酸钠粉剂和10g明胶粉剂， 将海藻酸钠和明胶均匀混合后， 置入装有100mL超 纯水的容量瓶中， 然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液， 将海 藻酸钠-明胶混悬液在60条件下放置12小时以使其完全溶解， 然后通过巴氏消毒法灭菌， 灭菌条件为： 在70条件下灭菌30分钟； 再在4条件下灭菌5分钟， 循环交叉灭菌3次， 灭菌 后， 将生物墨水密封并保存在4待用。 0032 实施例3 0033 本实施例提供了一种生物墨水， 该生物墨水由以下方法制备而成： 使用微量称量 仪称取4.5g海藻酸钠粉剂和11g明胶粉剂， 将海藻酸钠和明胶均匀混合。

21、后， 置入装有90mL超 纯水的容量瓶中， 然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液， 将海 藻酸钠-明胶混悬液在80条件下放置8小时以使其完全溶解， 然后通过巴氏消毒法灭菌， 灭菌条件为： 在80条件下灭菌10分钟； 再在8条件下灭菌10分钟， 循环交叉灭菌3次， 灭 菌后， 将生物墨水密封并保存在4待用。 0034 实施例4 0035 本实施例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法， 该方法包括以下步骤： 0036 (1)用实施例1的方法制备得到生物墨水； 0037 (2)取1ml 1.0107细胞/ml的MSC悬浮液、 0.5ml小鼠足趾部。

22、真皮基质匀浆和9ml 步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中， 使用3D生物打印平台(购自 说明书 3/14 页 6 CN 111849888 A 6 Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水， 标记为3.5-9-110组， 将密封后的无菌打印注射器 放置在4条件下冷却15分钟(3.5-9-110)后， 将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打 印臂上， 设置温度为15， 同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台， 设置温度为4， 使用直 径为260 m的打印喷嘴(购自捷诺飞生物科技股份有限公司)以层层叠加的形式构建直径为 50mm、 厚度为5mm、 孔径为2.5mm的含。

23、MSC的生物墨水； 0038 (3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2氯化钙溶液中交联12分钟， 将交联后的 基质置于37， 5CO2的无菌培养箱中培养； 在打印后的前三天内， 使用含有DMEM培养基培 养； 三天后更换为汗腺专用培养基， 每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水 用培养基培养7天； 0039 以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5(v/v)的胎牛血清FBS， 0.8 (v/v)双抗溶液(青霉素链霉素混合液)， 充分混匀后密封置于4保存。 0040 以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例 混合， 充分混匀后加入。

24、1ng/mL三碘甲状腺原氨、 4(v/v)胎牛血清FBS、 8ng/mL EGF、 0.3 g/ mL半琥珀酰氢化考的松、 0.8(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、 0.8mL/100mL ITS， 充分混匀后密封置于4保存； 0041 其中， MSC由以下方法制备： 0042 S1将1周龄的C57BL/6小鼠处死后， 浸泡在75的酒精溶液中10分钟； 0043 S2在无菌超净台内， 将小鼠置于100mm细胞培养皿中， 用眼科剪剪开小鼠两侧的后 肢皮肤后， 用眼科镊钝性分离肌肉和筋膜组织， 充分暴露手术视野， 取出双侧的股骨和胫 骨； 0044 S3将分离出的股骨和胫骨置于装有抗凝缓。

25、冲液的100mm细胞培养皿中， 置于冰上 操作； 0045 S4手术操作结束后， 将股骨和胫骨转移至新的100mm细胞培养皿中， 加入1mL的MSC 提取专用胶原酶， 用止血钳轻柔钳夹股骨和胫骨直至碎裂， 用眼科剪将碎骨剪至1mm3的碎 片， 再次加入MSC提取专用胶原酶(以每只老鼠使用2mL的MSC提取专用胶原酶为准)， 用无菌 滴管充分吹打骨碎片团块至碎片分离后， 移入50mL离心管中后密封； 0046 S5将50mL离心管置于37下放置60min， 每5分钟上下颠倒一次； 0047 S6使用低速台式离心机在1400rpm下离心10分钟后， 弃上清液， 加入足量的 MesenCultTM 。

26、MSC培养基， 将管底沉淀物充分重悬后转移到新的100mm细胞培养皿中， 置于37 ， 5CO2的无菌培养箱中孵育4天； 0048 S7细胞贴壁生长至80时以1:3传代， 本次实验中使用第2代间充质干细胞； 0049 小鼠足趾部真皮基质匀浆(PD)通过以下方法制备: 0050 S1将5只出生后24小时内的C57BL/6小鼠处死后， 浸泡在75的酒精溶液中10分 钟； 0051 S2将小鼠置于100mm细胞培养皿中， 用眼科剪剪取四肢的足趾部后置于无菌研磨 器中； 0052 S3在无菌条件下， 加入4mL无菌PBS缓冲液后充分研磨成匀浆液； 0053 S4将匀浆液分装至无菌的1.5mL的EP管中。

27、， 使用低温高速离心机在4、 13000rpm 条件下离心5分钟； 说明书 4/14 页 7 CN 111849888 A 7 0054 S5上清液既为PD， 转移至新的无菌1.5mL的EP管中， 密封后置于-80保存待用。 0055 实施例5 0056 本实施例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法， 该方法包括以下步骤： 0057 (1)用实施例2的方法制备得到生物墨水； 0058 (2)取1ml 1.0107细胞/ml的MSC悬浮液、 0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml 步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中， 使用3D生物打印平台(。

28、购自 Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水， 标记为4A10G组， 将密封后的无菌打印注射器放置 在4条件下冷却20分钟后， 将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上， 设置温度 为15， 同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台， 设置温度为4， 使用直径为260 m的打印 喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、 厚度为5mm、 孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水； 0059 (3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2.5氯化钙溶液中交联10分钟， 将交联后 的基质置于37， 5CO2的无菌培养箱中培养； 在打印后的前三天内， 使用含有DMEM培养基 培养； 三天后更换为汗腺。

29、专用培养基， 每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨 水用培养基培养7天； 0060 以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入10(v/v)的胎牛血清FBS， 1(v/ v)双抗溶液(青霉素链霉素混合液)， 充分混匀后密封置于4保存。 0061 以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例 混合， 充分混匀后加入2ng/mL三碘甲状腺原氨、 5(v/v)胎牛血清FBS、 10ng/mL EGF、 0.4 g/mL半琥珀酰氢化考的松、 1(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、 1mL/100mL ITS， 充 分混匀后密封置于4保存。

30、； 0062 其中， MSC由以下方法制备： 0063 S1将1周龄的C57BL/6小鼠处死后， 浸泡在75的酒精溶液中10分钟； 0064 S2在无菌超净台内， 将小鼠置于100mm细胞培养皿中， 用眼科剪剪开小鼠两侧的后 肢皮肤后， 用眼科镊钝性分离肌肉和筋膜组织， 充分暴露手术视野， 取出双侧的股骨和胫 骨； 0065 S3将分离出的股骨和胫骨置于装有抗凝缓冲液的100mm细胞培养皿中， 置于冰上 操作； 0066 S4手术操作结束后， 将股骨和胫骨转移至新的100mm细胞培养皿中， 加入1mL的MSC 提取专用胶原酶， 用止血钳轻柔钳夹股骨和胫骨直至碎裂， 用眼科剪将碎骨剪至1mm3的。

31、碎 片， 再次加入MSC提取专用胶原酶(以每只老鼠使用2mL的MSC提取专用胶原酶为准)， 用无菌 滴管充分吹打骨碎片团块至碎片分离后， 移入50mL离心管中后密封； 0067 S5将50mL离心管置于37下放置45min， 每5分钟上下颠倒一次； 0068 S6使用低速台式离心机在1300rpm下离心10分钟后， 弃上清液， 加入足量的 MesenCultTM MSC培养基， 将管底沉淀物充分重悬后转移到新的100mm细胞培养皿中， 置于37 ， 5CO2的无菌培养箱中孵育3天； 0069 S7细胞贴壁生长至80时以1:3传代， 本次实验中使用第3代间充质干细胞； 0070 本实施例的小鼠足。

32、趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。 0071 实施例6 说明书 5/14 页 8 CN 111849888 A 8 0072 本实施例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法， 该方法包括以下步骤： 0073 (1)用实施例3的方法制备得到生物墨水； 0074 (2)取1ml 1.0107细胞/ml的MSC悬浮液、 0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml 步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中， 使用3D生物打印平台(购自 Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水， 标记为4.5-11-110组， 将密封后的无菌打印注射 器放置在4。

33、条件下冷却30分钟后， 将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上， 设 置温度为15， 同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台， 设置温度为4， 使用直径为260 m 的打印喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、 厚度为5mm、 孔径为2.5mm的含MSC的生物墨 水； 0075 (3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的3氯化钙溶液中交联8分钟， 将交联后的基 质置于37， 5CO2的无菌培养箱中培养； 在打印后的前三天内， 使用含有DMEM培养基培 养； 三天后更换为汗腺专用培养基， 每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水 用培养基培养7天； 0076 以上的DMEM培养基。

34、是在DMEM培养基原液中加入15(v/v)的胎牛血清FBS， 1.2 (v/v)双抗溶液(青霉素链霉素混合液)， 充分混匀后密封置于4保存。 0077 以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例 混合， 充分混匀后加入3ng/mL三碘甲状腺原氨、 6(v/v)胎牛血清FBS、 12ng/mL EGF、 0.5 g/mL半琥珀酰氢化考的松、 1.2(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、 1.2mL/100mL ITS， 充分混匀后密封置于4保存； 0078 其中， MSC由以下方法制备： 0079 S1将1周龄的C57BL/6小鼠处死后， 浸泡在7。

35、5的酒精溶液中10分钟； 0080 S2在无菌超净台内， 将小鼠置于100mm细胞培养皿中， 用眼科剪剪开小鼠两侧的后 肢皮肤后， 用眼科镊钝性分离肌肉和筋膜组织， 充分暴露手术视野， 取出双侧的股骨和胫 骨； 0081 S3将分离出的股骨和胫骨置于装有抗凝缓冲液的100mm细胞培养皿中， 置于冰上 操作； 0082 S4手术操作结束后， 将股骨和胫骨转移至新的100mm细胞培养皿中， 加入1mL的MSC 提取专用胶原酶， 用止血钳轻柔钳夹股骨和胫骨直至碎裂， 用眼科剪将碎骨剪至1mm3的碎 片， 再次加入MSC提取专用胶原酶(以每只老鼠使用2mL的MSC提取专用胶原酶为准)， 用无菌 滴管充。

36、分吹打骨碎片团块至碎片分离后， 移入50mL离心管中后密封； 0083 S5将50mL离心管置于37下放置45min， 每5分钟上下颠倒一次； 0084 S6使用低速台式离心机在1300rpm下离心10分钟后， 弃上清液， 加入足量的 MesenCultTM MSC培养基， 将管底沉淀物充分重悬后转移到新的100mm细胞培养皿中， 置于37 ， 5CO2的无菌培养箱中孵育3天； 0085 S7细胞贴壁生长至80时以1:3传代， 本次实验中使用第3代间充质干细胞； 0086 本实施例的小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。 0087 对照例1 0088 本对照例提供了一种生物墨水， 该。

37、生物墨水由以下方法制备而成： 使用微量称量 说明书 6/14 页 9 CN 111849888 A 9 仪称取1g海藻酸钠粉剂和3g明胶粉剂， 将海藻酸钠和明胶均匀混合后， 置入装有100mL PBS 的容量瓶中， 然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液， 将海藻酸 钠-明胶混悬液在60条件下放置12小时以使其完全溶解， 然后通过巴氏消毒法灭菌， 灭菌 条件为： 在70条件下灭菌30分钟； 再在4条件下灭菌5分钟， 循环交叉灭菌3次， 灭菌后， 将生物墨水密封并保存在4待用。 0089 对照例2 0090 本对照例提供了一种生物墨水， 该生物墨水由以下方法制备而成： 使用微。

38、量称量 仪称取1g海藻酸钠粉剂和3g明胶粉剂， 将海藻酸钠和明胶均匀混合后， 置入装有100mL超纯 水的容量瓶中， 然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液， 将海藻 酸钠-明胶混悬液在60条件下放置12小时以使其完全溶解， 然后通过巴氏消毒法灭菌， 灭 菌条件为： 在70条件下灭菌30分钟； 再在4条件下灭菌5分钟， 循环交叉灭菌3次， 灭菌 后， 将生物墨水密封并保存在4待用。 0091 对照例3 0092 本对照例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法， 该方法包括以下步骤： 0093 (1)用对照例1的方法制备得到生物墨水； 0094 。

39、(2)取1ml 1.0107细胞/ml的MSC悬浮液、 0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml 步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中， 使用3D生物打印平台(购自 Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水， 标记为control组， 将密封后的无菌打印注射器放 置在4条件下冷却15分钟后， 将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上， 设置温 度为15， 同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台， 设置温度为4， 使用直径为260 m的打 印喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、 厚度为5mm、 孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水； 0095 (3)将载有MS。

40、C的生物墨水浸入无菌的2.5氯化钙溶液中交联10分钟， 将交联后 的基质置于37， 5CO2的无菌培养箱中培养； 在打印后的前三天内， 使用含有DMEM培养基 培养； 三天后更换为汗腺专用培养基， 每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨 水用培养基培养7天； 0096 以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入10(v/v)的胎牛血清FBS， 1(v/ v)双抗溶液(青霉素链霉素混合液)， 充分混匀后密封置于4保存。 0097 以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例 混合， 充分混匀后加入2ng/mL三碘甲状腺原氨、 5(v/v)胎。

41、牛血清FBS、 10ng/mL EGF、 0.4 g/mL半琥珀酰氢化考的松、 1(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、 1mL/100mL ITS， 充 分混匀后密封置于4保存； 0098 其中， MSC和小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。 0099 对照例4 0100 本对照例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法， 该方法包括以下步骤： 0101 (1)用对照例2的方法制备得到生物墨水； 0102 (2)取1ml 1.0107细胞/ml的MSC悬浮液、 0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml 步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌。

42、打印注射器中， 使用3D生物打印平台(购自 说明书 7/14 页 10 CN 111849888 A 10 Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水， 标记为1A3G组， 将密封后的无菌打印注射器放置 在4条件下冷却15分钟后， 将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上， 设置温度 为15， 同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台， 设置温度为4， 使用直径为260 m的打印 喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、 厚度为5mm、 孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水； 0103 (3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2.5氯化钙溶液中交联10分钟， 将交联后 的基质置于37， 。

43、5CO2的无菌培养箱中培养； 在打印后的前三天内， 使用含有DMEM培养基 培养； 三天后更换为汗腺专用培养基， 每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨 水用培养基培养7天； 0104 以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入10(v/v)的胎牛血清FBS， 1(v/ v)双抗溶液(青霉素链霉素混合液)， 充分混匀后密封置于4保存。 0105 以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例 混合， 充分混匀后加入2ng/mL三碘甲状腺原氨、 5(v/v)胎牛血清FBS、 10ng/mL EGF、 0.4 g/mL半琥珀酰氢化考的松、 1(。

44、v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、 1mL/100mL ITS， 充 分混匀后密封置于4保存； 0106 其中， MSC和小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。 0107 本发明用到的试剂的购买厂家见表1： 0108 表1.各试剂的购买厂家. 说明书 8/14 页 11 CN 111849888 A 11 0109 说明书 9/14 页 12 CN 111849888 A 12 0110 0111 试验例1杨氏模量和孔隙率的检测 0112 1.杨氏模量的检测： 使用压缩模量检测平台检测实施例1-3和对照例1-2的生物墨 水的杨氏模量。 将20ml实施例1-3和对照例1-2的生。

45、物墨水分别装入20mL注射器中， 密封并 置于4以冷凝成凝胶状后， 将注射器头部切断， 小心轻柔地将注射器内固态凝胶推出并立 即浸没在装有2.5氯化钙溶液的容器内， 放置在4中24小时以充分交联， 将交联完成的 圆柱体水凝胶制成高度(h)为20mm， 直径(d)为20mm的待测样品。 将样品放置在压缩模量检 测平台(型号为INSTRON,Model 5567(英斯特朗， 5567)上， 选择100N的负载传感器， 以3mm/ min的下降速度开始压缩， 直至将样品压缩至70为止。 每组重复3次以取平均值。 选择压缩 曲线的前10， 并以应变( )为横坐标和应力( )为纵坐标绘制相关曲线。 公式。

46、(1)用于计算 杨氏模量； 实施例1-3和对照例1-2的杨氏模量柱状图见图1； 0113 杨氏模量 / (1) 0114 由图1可知， 实施例1-3组的生物墨水的杨氏模量显著高于对照例1-2组， 即实施例 1-3组的生物墨水的硬度显著高于对照例1-2组， 而皮肤真皮组织硬度为6-220kPa， 由图1可 知， 本发明3.5-9-110组和4A10G组的杨氏模量符合要求， 更加具有转化价值。 0115 2.孔隙率测量： 实施例1-3和对照例1-2的生物墨水的孔隙率采用无水乙醇置换法 进行测量， 分别取20mL实施例1-3和对照例1-2的生物墨水装入20mL注射器中， 密封并置于4 以冷凝成凝胶状。

47、， 然后挤入装有40mL 2.5氯化钙溶液的50mL离心管中静置10分钟以交 联， 10分钟后弃去2.5氯化钙溶液后， 将样品冷冻干燥48小时。 然后在离心管中加入45mL 的无水乙醇(V1)， 并在4下放置48小时， 计算各组生物墨水的孔隙率， 结果见图1。 公式(2) 说明书 10/14 页 13 CN 111849888 A 13 用于计算孔隙率； 0116 孔隙率(V1V3)/(V2V3)100 (2) 0117 公式(2)中的V1是无水乙醇的体积， V2是添加无水乙醇后的总体积， V3是浸没样品 48小时后剩余的无水乙醇的体积。 每组重复3次以取平均值。 0118 由图1可知， 实施。

48、例1-3提供的生物生物墨水的孔隙率与对照例1-2组相当， 无显著 差异。 0119 试验例2各组生物墨水的微观结构观察 0120 分别将培养7天的实施例4-6和对照例3-4的生物墨水冷冻干燥48小时后浸入液氮 中， 于-196下快速超低温冷冻， 用眼科镊轻轻掰断样品， 小心轻柔地取出未经器械碰触或 切割的横断面， 将其粘在扫面电子显微镜样品台上， 保持干燥并立即喷金后， 扫描电子显微 镜用于观察生物墨水的微观结构， 放大倍数为220倍， 结果见图2。 0121 由图2可知， 打印后7天时， 实施例4-6组的类汗腺细胞团较对照例3-4组更大。 0122 试验例3 RT-qPCR检测不同硬度下MS。

49、C表达汗腺表面标记物蛋白相关基因的差异 0123 (1)提取RNA： 0124 a： 在实施例4-6和对照例3-4打印后1天和7天时， 将各组含MSC的3D打印基质分别 转移至50mL离心管中； 0125 b： 加入裂解液， 置于水平摇床上震荡20分钟至3D打印基质充分裂解， 将8.09g二水 合柠檬酸钠(0.06M)、 2.92g EDT(0.02M)A和4.39g氯化钠(0.15M)加入500mL去离子水中， 混 合均匀后置于室温待用； 用量为45ml。 0126 c： 将各组完全裂解后的溶液在低速台式离心机上以1500rpm速度离心15分钟， 弃 上清， 加入Trizol试剂(购自美国，。

50、 Invitrogen公司)， 每3ml的3D打印基质使用1ml Trizo试 剂， 吹打均匀后移入1.5mL无酶EP管中； 0127 d： 每1mL的Trizol试剂对应加200 l氯仿， 充分剧烈震荡后， 置于室温静置3分钟； 0128 e： 使用低温高速离心机在4、 12000rpm条件下离心15分钟； 0129 f： 离心后EP管中液体分三相， 上层透明、 中层发白、 下层粉红， 小心轻柔的取600 L 上层透明液体至新的无酶1.5mL EP管中， 加入等体积的异丙醇， 轻柔地上下颠倒15次， 混 匀， 室温静置30min； 0130 g： 使用低温高速离心机在4、 12000rpm条。