鸟嘌呤核苷的新用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010839519.4 (22)申请日 2020.08.19 (71)申请人 四川大学华西医院 地址 610000 四川省成都市武侯区国学巷 37号 申请人 成都华西精准医学产业技术研究院 有限公司 (72)发明人 李为民罗雨蕉陈海何杨 吴琼夏贞强黄日东 (74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所(普通合伙) 51222 代理人 李高峡张娟 (51)Int.Cl. A61K 31/708(2006.01) A61P 11/06(2006.01) A61P 11/08。

2、(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 17/06(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 31/18(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 25/24(2006.01) A61P 1/02(2006.01) A61P 25/02(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 31/12(2。

3、006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (54)发明名称 鸟嘌呤核苷的新用途 (57)摘要 本发明属于药物技术领域， 具体涉及鸟嘌呤 核苷的新用途， 具体是在在制备治疗哮喘药物或 MAPK、 NFB、 STAT3抑制剂中的新用途。 本发明 针对现有技术中迫切需要开发更安全， 更有效的 哮喘治疗药物的问题。 本发明发现在体外THP1 源性巨噬细胞炎症模型中， 鸟嘌呤核苷通过抑制 MAPK和NFB的激活抑制促炎因子IL6的生成。 在哮喘小鼠模型中， 鸟嘌呤核苷降低了小鼠血浆 OVAIgE， 降低IL4、 IL。

4、6和IL13的产生， 减轻气 道高反应性， 减轻肺组织细胞浸润、 气道炎症和 胶原沉积。 此外,鸟嘌呤核苷治疗组小鼠肺组织 pp38 MAPK,pp65 NFB,pIB、 pSTAT3 蛋白表达水平明显低于哮喘模型组。 因而， 本发 明提供了鸟嘌呤核苷在制备p38 MAPK抑制剂、 p65 NFB抑制剂、 STAT3抑制剂或哮喘治疗药 物中的用途。 权利要求书2页 说明书10页 附图7页 CN 111840309 A 2020.10.30 CN 111840309 A 1.鸟嘌呤核苷或其药学上可接受的盐、 或其晶型、 或其立体异构体、 或其光学异构体在 制备治疗哮喘的药物中的用途。 2.按照权。

5、利要求1所述的用途， 其特征在于： 所述哮喘为吸入性哮喘、 感染型哮喘、 混合 型哮喘、 职业性哮喘、 慢性哮喘性支气管炎、 运动性哮喘或慢性哮喘。 3.按照权利要求1或2所述的用途， 其特征在于： 所述药物是减轻气道炎症、 减轻气道纤 维化和/或减轻气道高反应性的药物。 4.一种治疗哮喘的药物， 其特征在于： 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上可接 受的辅料或者辅助性成分制备而成。 5.按照权利要求4所述的用途， 其特征在于： 所述药物的制品形式为药丸、 药水、 吸入剂 或喷雾剂。 6.鸟嘌呤核苷或其药学上可接受的盐、 或其晶型、 或其立体异构体、 或其光学异构体在 制备p38 MAP。

6、K抑制剂、 p65 NF- B抑制剂或STAT3抑制剂中的用途。 7.按照权利要求6所述的用途， 其特征在于： 所述p38 MAPK抑制剂用于治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病， 优选的， 所述p38 MAPK 抑制剂用于治疗口腔癌、 口咽癌、 鼻咽癌、 呼吸系统癌、 泌尿生殖系统癌、 胃肠癌、 中枢神经 系统或周围神经系统组织癌、 内分泌或神经内分泌癌或造血系统癌、 胶质瘤、 肉瘤、 肿瘤、 淋 巴瘤、 黑色素瘤、 纤维瘤、 脑膜瘤、 脑癌、 口咽癌、 肾癌、 胆道癌、 嗜铬细胞瘤、 胰岛细胞癌、 Li- Fraumeni肿瘤、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌、 垂体瘤、 肾上腺肿瘤、 成骨肉瘤、 。

7、I型多发性神经内分 泌和II型肿瘤、 乳腺癌、 肺癌、 头颈癌、 前列腺癌、 食道癌、 气管癌、 肝癌、 膀胱癌、 胃癌、 胰腺 癌、 卵巢癌、 子宫癌、 宫颈癌、 睾丸癌、 结肠癌、 直肠癌、 皮肤癌、 关节炎、 炎症性肠疾、 哮喘、 牛 皮癣、 心肌损伤、 中风、 阿尔兹海默症、 艾滋病、 慢性阻塞性肺病、 多发性骨髓瘤、 骨髓增生异 常综合征、 急性呼吸窘迫综合症、 冠心病、 急性冠脉综合征、 重度抑郁症、 牙痛、 动脉粥样硬 化或神经性疼痛中的一种或多种； 所述p65 NF- B抑制剂用于治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病， 优选的， 所述p65 NF- B抑制剂用于治疗白血病、 淋巴。

8、瘤、 多发性骨髓瘤、 非小细胞肺癌、 鼻咽癌、 乳腺癌、 结肠癌、 胃癌、 胰腺癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 卵巢癌、 肝癌、 霍奇金病、 甲状腺癌、 黑色素瘤、 动脉硬化 症、 骨吸收、 心肌肥厚、 心脏衰竭、 缺血/再灌注、 多发性硬化症、 肌营养不良、 慢性阻塞性肺 疾病、 全身炎症反应综合症、 神经病理学疾病、 炎症性肠病疾病、 关节炎、 哮喘、 狼疮、 肿瘤发 生、 病毒感染、 糖尿病、 阿尔茨海默氏病、 艾滋病或抑郁症中的一种或多种； 所述STAT3抑制剂用于治疗恶性肿瘤、 皮肤疾病、 炎症或自身免疫性疾病， 优选的， 所述 STAT3抑制剂用于治疗乳腺癌、 卵巢癌、 头颈部鳞状细胞。

9、癌、 前列腺癌、 恶性黑色素瘤、 多发 性骨髓瘤、 淋巴瘤、 脑瘤、 非小细胞肝癌、 白血病、 银屑病、 扁平苔鲜、 皮肤肿瘤、 基底细胞上 皮瘤、 湿疹样癌、 炎症性肺病、 哮喘、 慢性肾炎、 胃炎、 胰腺炎、 梗阻性肾病、 糖尿病肾小球病、 视网膜炎、 系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、 硬皮病、 甲状腺机能元进、 青少年糖尿病、 多 发性硬化症、 自发性血小板减少性紫癜、 溃疡性结肠炎、 自身免疫性肝炎或原发性胆汁性肝 硬化中的一种或多种。 8.一种p38 MAPK抑制剂， 其特征在于： 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上可接 受的辅料或者辅助性成分制备而成。 9.一种p65 NF。

10、- B抑制剂， 其特征在于： 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上可 权利要求书 1/2 页 2 CN 111840309 A 2 接受的辅料或者辅助性成分制备而成。 10.一种STAT3抑制剂， 其特征在于： 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上可接受 的辅料或者辅助性成分制备而成。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111840309 A 3 鸟嘌呤核苷的新用途 技术领域 0001 本发明属于药物技术领域， 具体涉及鸟嘌呤核苷在制备MAPK、 NF- B、 STAT3抑制剂 或治疗哮喘药物中的新用途。 背景技术 0002 哮喘是最常见的慢性非传染性疾病之一， 成人哮喘患病率为4.3。

11、。 哮喘患病率逐 年上升， 据估计， 从1990年到2015年， 哮喘的患病人数上升至3.582亿， 增长了12.6； 2015 年有40万人死于哮喘。 尽管吸入糖皮质激素(ICS)是大多数患者的一线治疗用药， 但儿童和 成人对ICS的依从性极差， 并且有一小部分患者对糖皮质激素耐药。 因为患者认为， 短效 2 激动剂(SABA)比ICS更熟悉和更易接受、 更便宜、 更安全。 因此， 中国只有5.6的哮喘患者 接受了常规的ICS治疗。 然而， 根据 全球哮喘防治倡议 (GINA)的规定， 仅使用SABA治疗会 增加哮喘恶化和死亡的风险。 因此， 迫切需要开发更安全， 更有效的哮喘治疗药物。 0。

12、003 鸟嘌呤核苷(鸟苷)是一种内源性核苷， 是合成DNA和RNA的原料之一。 在医药工业 上， 其主要的用途是作为合成三氮唑核苷、 无环鸟苷的中间体。 在食品工业上， 其作为呈味 核苷酸鸟苷酸二钠的主要原料， 与肌苷酸二钠混合简称I+G， 添加到味精中即为第二代、 第 三代味精， 具有十分广阔的市场。 0004 鸟嘌呤核苷对哮喘的作用及其分子机制目前还未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术中迫切需要开发更安全， 更有效的哮喘治疗药物的 问题， 提供鸟嘌呤核苷用于制备治疗哮喘的药物的用途。 0006 本发明提供鸟嘌呤核苷或其药学上可接受的盐、 或其晶型、 或其立体异构体、 。

13、或其 光学异构体在制备治疗哮喘的药物中的用途。 0007 优选的， 哮喘为吸入性哮喘、 感染型哮喘、 混合型哮喘、 职业性哮喘、 慢性哮喘性支 气管炎、 运动性哮喘或慢性哮喘。 0008 优选的， 药物是减轻气道炎症、 减轻气道纤维化和/或减轻气道高反应性的药物。 0009 优选的， 药物的制品形式为药丸、 药水、 吸入剂或喷雾剂。 0010 本发明还提供一种治疗哮喘的药物， 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上 可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。 0011 优选的， 药物的制品形式为药丸、 药水、 吸入剂或喷雾剂。 0012 本发明还提供鸟嘌呤核苷或其药学上可接受的盐、 或其晶型、 或。

14、其立体异构体、 或 其光学异构体在制备p38 MAPK抑制剂、 p65 NF- B抑制剂或STAT3抑制剂中的用途。 0013 优选的， 0014 p38 MAPK抑制剂用于治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病， 优选的， 所述p38 MAPK 抑制剂用于治疗口腔癌、 口咽癌、 鼻咽癌、 呼吸系统癌、 泌尿生殖系统癌、 胃肠癌、 中枢神经 系统或周围神经系统组织癌、 内分泌或神经内分泌癌或造血系统癌、 胶质瘤、 肉瘤、 肿瘤、 淋 说明书 1/10 页 4 CN 111840309 A 4 巴瘤、 黑色素瘤、 纤维瘤、 脑膜瘤、 脑癌、 口咽癌、 肾癌、 胆道癌、 嗜铬细胞瘤、 胰岛细胞癌、 L。

15、i- Fraumeni肿瘤、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌、 垂体瘤、 肾上腺肿瘤、 成骨肉瘤、 I型多发性神经内分 泌和II型肿瘤、 乳腺癌、 肺癌、 头颈癌、 前列腺癌、 食道癌、 气管癌、 肝癌、 膀胱癌、 胃癌、 胰腺 癌、 卵巢癌、 子宫癌、 宫颈癌、 睾丸癌、 结肠癌、 直肠癌、 皮肤癌、 关节炎、 炎症性肠疾、 哮喘、 牛 皮癣、 心肌损伤、 中风、 阿尔兹海默症、 艾滋病、 慢性阻塞性肺病、 多发性骨髓瘤、 骨髓增生异 常综合征、 急性呼吸窘迫综合症、 冠心病、 急性冠脉综合征、 重度抑郁症、 牙痛、 动脉粥样硬 化或神经性疼痛中的一种或多种的组合； 0015 p65 NF- B抑制。

16、剂用于治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病， 优选的， 所述p65 NF- B抑制剂用于治疗白血病、 淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 非小细胞肺癌、 鼻咽癌、 乳腺癌、 结肠癌、 胃癌、 胰腺癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 卵巢癌、 肝癌、 霍奇金病、 甲状腺癌、 黑色素瘤、 动脉硬化 症、 骨吸收、 心肌肥厚、 心脏衰竭、 缺血/再灌注、 多发性硬化症、 肌营养不良、 慢性阻塞性肺 疾病、 全身炎症反应综合症、 神经病理学疾病、 炎症性肠病疾病、 关节炎、 哮喘、 狼疮、 肿瘤发 生、 病毒感染、 糖尿病、 阿尔茨海默氏病、 艾滋病或抑郁症中的一种或多种的组合； 0016 STAT3抑制剂用于治疗恶性肿。

17、瘤、 皮肤疾病、 炎症或自身免疫性疾病， 优选的， 所述 STAT3抑制剂用于治疗乳腺癌、 卵巢癌、 头颈部鳞状细胞癌、 前列腺癌、 恶性黑色素瘤、 多发 性骨髓瘤、 淋巴瘤、 脑瘤、 非小细胞肝癌、 白血病、 银屑病、 扁平苔鲜、 皮肤肿瘤、 基底细胞上 皮瘤、 湿疹样癌、 炎症性肺病、 哮喘、 慢性肾炎、 胃炎、 胰腺炎、 梗阻性肾病、 糖尿病肾小球病、 视网膜炎、 系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、 硬皮病、 甲状腺机能元进、 青少年糖尿病、 多 发性硬化症、 自发性血小板减少性紫癜、 溃疡性结肠炎、 自身免疫性肝炎或原发性胆汁性肝 硬化中的一种或多种的组合。 0017 本发明还提供一种。

18、p38 MAPK抑制剂， 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上 可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。 0018 本发明还提供一种p65 NF- B抑制剂， 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上 可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。 0019 本发明还提供一种STAT3抑制剂， 它是以鸟嘌呤核苷为活性成分， 加上药学上可接 受的辅料或者辅助性成分制备而成。 0020 “药学上可接受的” 是指某载体、 运载物、 稀释剂、 辅料， 和/或所形成的盐通常在化 学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容， 并在生理上za与受体相兼容。 0021 “盐” 是将化合物或其立体异构体， 与无机和/或。

19、有机酸和/或碱形成的酸式和/或 碱式盐， 也包括两性离子盐(内盐)， 还包括季铵盐， 例如烷基铵盐。 这些盐可以是在化合物 的最后分离和纯化中直接得到。 也可以是通过将化合物， 或其立体异构体， 与一定数量的酸 或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。 这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收 集， 或在溶剂蒸发后回收而得到， 或在水介质中反应后冷冻干燥制得。 0022 本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、 硫酸盐、 枸橼酸盐、 苯磺酸盐、 氢溴酸盐、 氢氟酸盐、 磷酸盐、 乙酸盐、 丙酸盐、 丁二酸盐、 草酸盐、 苹果酸盐、 琥珀酸盐、 富马酸盐、 马来 酸盐、 酒石酸盐或三氟乙酸盐。 002。

20、3 通过相关实验研究的结果发现： 在体外THP-1源性巨噬细胞炎症模型中， 鸟嘌呤核 苷通过抑制MAPK和NF- B的激活抑制促炎因子IL-6的生成。 在哮喘小鼠模型中， 鸟嘌呤核苷 降低了小鼠血浆OVA-IgE， 降低IL-4、 IL-6和IL-13的产生， 减轻气道高反应性， 减轻肺组织 说明书 2/10 页 5 CN 111840309 A 5 细胞浸润、 气道炎症和胶原沉积。 此外,鸟嘌呤核苷治疗组小鼠肺组织p-p38 MAPK,p-p65 NF- B,p-I B 、 p-STAT3蛋白表达水平明显低于哮喘模型组。 0024 因而， 鸟嘌呤核苷能够作为活性成分用于制备哮喘治疗药物， 其。

21、还可以作为p38 MAPK抑制剂、 p65 NF- B抑制剂、 STAT3抑制剂， 其中， p38 MAPK抑制剂可以用于治疗恶性肿 瘤、 炎症或神经系统疾病， 因此， 本发明还可以作为治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病的 药物； p65 NF- B抑制剂可以用于治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病， 因此， 本发明还可以 作为治疗恶性肿瘤、 炎症或神经系统疾病的药物； STAT3抑制剂可用于治疗恶性肿瘤、 皮肤 疾病、 炎症或自身免疫性疾病， 因此， 本发明还可以作为治疗恶性肿瘤、 皮肤疾病、 炎症或自 身免疫性疾病。 0025 显然， 根据本发明的上述内容， 按照本领域的普通技术知识和惯用手。

22、段， 在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下， 还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。 0026 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明 0027 图1为本发明实施例1中鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷、 地塞米松对OVA所致哮喘小鼠肺 泡灌洗液中总白细胞数目的影响； 0028 图2为本发明实施例1中肺组织的H&E染色； 0029 图3为本发明实施例2中肺组织的MASSON染色； 0030 图4为本发明实施例3中不同浓度氯化乙酰胆碱激发。

23、后各组小鼠的增强呼气间歇 值(Penh)； 0031 图5为本发明实施例4中各组小鼠肺组织IL-4、 IL-6、 IL-13的表达水平； 0032 图6为本发明实施例5中各组小鼠血浆中OVA-IgE水平； 0033 图7为本发明实施例6中各组小鼠肺组织中炎症介质的mRNA水平； 0034 图8为本发明实施例7中免疫组化方法检测小鼠肺组织p-p38 MAPK的表达情况； 0035 图9为本发明实施例7中免疫印迹实验检测小鼠肺组织p38 MAPK的磷酸化、 总蛋白 的表达水平； 0036 图10为本发明实施例8中免疫印迹实验检测小鼠肺组织NF- B的磷酸化、 总蛋白的 表达水平； 0037 图11。

24、为本发明实施例8中免疫印迹实验检测小鼠肺组织p-STAT3、 STAT3； p-I B 、 I B 蛋白表达水平； 0038 图12为本发明实施例9中鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷对THP-1源性巨噬细胞IL-6表达 水平的影响； 0039 图13为本发明实施例10中鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷对THP-1源性巨噬细胞p38 MAPK蛋白表达水平的影响； 0040 图14为本发明实施例11中鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷对THP-1源性巨噬细胞蛋白表 达水平的影响。 说明书 3/10 页 6 CN 111840309 A 6 具体实施方式 0041 下面通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明： 00。

25、42 实施例1： 鸟嘌呤核苷减轻卵清蛋白(OVA)所致哮喘小鼠的气道炎症本实施例实验 过程如下： 0043 (1)哮喘动物模型的建立 0044 新购的4-6周龄的balb/c雌性小鼠饲养于SPF级环境中适应一周后再开展实验。 0045 1)第1、 14天， 阴性对照组腹腔注射100 L 0.9NaCl； 除阴性对照组外， 其余组每 只小鼠腹腔注射100 L含40 g卵清蛋白(OVA)和4mg注射铝佐剂的溶液。 0046 2)第2426天， 小鼠超声雾化吸入质量分数1的OVA溶液(PBS溶解)30分钟， 阴性 对照组吸入雾化PBS缓冲液30分钟。 雾化前1h， 地塞米松组腹腔注射1mg/kg的地。

26、塞米松； 尿 嘧啶核苷组气管内注射6.1mg/kg的尿嘧啶核苷； 鸟嘌呤核苷组腹腔注射6.1mg/kg的鸟嘌呤 核苷； 0047 由此得到阴性对照组(SAL+PBS)、 地塞米松治疗组(OVA+DEX)、 尿嘧啶核苷治疗组 (OVA+U)、 鸟嘌呤核苷治疗组(OVA+G)和哮喘模型组(OVA+PBS)共五组小鼠。 0048 (2)肺泡灌洗液及总白细胞计数 0049 第27天， 进行气道高反应性检测后， 腹腔注射水合氯醛麻醉， 暴露胸腔， 心尖取血 后将左侧肺门结扎， 分离颈部气管， 对右侧肺叶进行灌洗， 缓慢推入0.6mL PBS， 停留5s后缓 缓吸出并重复两次。 将收集的肺泡灌洗液4， 3。

27、500rpm离心15min， 100 L PBS重悬细胞沉 淀， 10 L细胞悬液与10 L台盼蓝混合均匀后用自动细胞计数仪进行细胞计数。 0050 细胞计数实验结果如图1所示： 0051 与阴性对照组相比， 哮喘模型组肺泡灌洗液中白细胞数目明显增加(p0.034)； 与哮喘模型组相比， 鸟嘌呤核苷治疗组(p0.036)、 尿嘧啶核苷治疗组(p0.034)、 地塞米 松治疗组(p0.029)白细胞数目均有所降低， 其中地塞米松治疗组更为明显。 0052 (3)H&E染色 0053 为进一步证实鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷能够减轻OVA所致的哮喘小鼠的气道炎症， 将左侧肺叶进行病理切片， 通过H&E。

28、染色， 检测细支气管、 终末支气管周围细胞浸润情况评 价小鼠气道炎症。 0054 第27天， 进行气道高反应性检测后， 左侧肺叶放入包埋框中， 4多聚甲醛固定， 常 规脱水包埋， 4 m厚度切片， 然后按以下步骤进行HE染色： 0055 1)脱蜡： 二甲苯(I)10min， 二甲苯(II)10min 0056 2)复水： 依次浸泡于100、 95、 80、 60中浸泡5min； 双蒸水洗3次， 每次3分 钟； 0057 3)苏木精染色5min， 双蒸水洗3min， 1盐酸-乙醇浸泡10s、 流水洗1min， 双蒸水洗 1min； 0058 4)0.5伊红染色1min， 双蒸水洗30s； 005。

29、9 5)脱水： 80乙醇(I)30s、 95乙醇(I)1min、 95乙醇(II)1min、 100乙醇(I) 1min、 100乙醇(II)1min； 0060 6)透明： 二甲苯(I)3min， 二甲苯(II)3min； 0061 7)封片： 滴加中性树胶， 盖上盖玻片后自然风干。 说明书 4/10 页 7 CN 111840309 A 7 0062 H&E染色结果如图2(上图： 放大50倍， scale bar200 m； 下图： 放大400倍， scale bar25 m)所示， 阴性对照小鼠肺组织无明显异常改变， 肺泡结构清晰； 哮喘模型组支气管 及血管周围有大量炎症细胞浸润， 部分。

30、上皮细胞发生脱落， 肺泡壁增厚， 部分肺泡塌陷， 周 围肺泡融合扩张； 与对照组相比， 治疗组的炎症反应明显减轻。 0063 实施例2： 鸟嘌呤核苷减轻卵清蛋白(OVA)所致哮喘小鼠的气道纤维化 0064 本实施例采用与实施例1相同的方式建立哮喘动物模型。 0065 然后进行Masson染色： 0066 第27天， 进行气道高反应性检测后， 左侧肺叶放入包埋框中， 4多聚甲醛固定， 常 规脱水包埋， 4 m厚度切片， 然后按以下步骤进行染色： 0067 1)脱蜡： 二甲苯(I)10min， 二甲苯(II)10min 0068 2)复水： 依次浸泡于100、 95、 80、 60中浸泡5min；。

31、 双蒸水洗3次， 每次3分 钟； 0069 3)Weigert苏木精染8min； 0070 4)酸性乙醇分化5s， 蒸馏水洗1min； 0071 5)Masson蓝化液反蓝3min， 蒸馏水洗1min； 0072 6)丽春红酸性品红染色液染6min， 2醋酸洗1min； 0073 7)1磷钼酸溶液1min； 0074 8)苯胺蓝染色液中染2min； 0075 9)脱水： 80乙醇(I)30s、 95乙醇(I)1min、 95乙醇(II)1min、 100乙醇(I) 1min、 100乙醇(II)1min； 0076 10)透明： 二甲苯(I)3min， 二甲苯(II)3min； 0077 11。

32、)封片： 滴加中性树胶， 盖上盖玻片后自然风干。 0078 将各组小鼠的肺组织进行masson染色， 胶原纤维被染成蓝色， 结果如图3(上图： 放 大50倍， scale bar200 m； 下图： 放大400倍， scale bar25 m)所示， 正常小鼠肺组织仅 血管周围有少量胶原纤维， 而哮喘模型小鼠肺组织血管及支气管周围胶原纤维表达含量明 显增加。 而地塞米松治疗组(OVA+DEX)、 尿嘧啶核苷治疗组(OVA+U)和鸟嘌呤核苷治疗组 (OVA+G)中的胶原纤维表达含量明显减少。 0079 实施例3： 鸟嘌呤核苷明显减轻哮喘小鼠的气道高反应性 0080 气道高反应性是哮喘的一大病理特。

33、征， 本实施例用全体积描记系统测定小鼠在不 同浓度氯化乙酰胆碱激发后的增强呼气间歇值(Penh)， 具体过程如下： 0081 本实施例采用与实施例1相同的方式建立哮喘动物模型。 第27天， 将小鼠置于全体 积描记系统的体描箱中冷静10分钟， 然后依次给予0、 12.5、 25、 50、 100mg/mL的氯化乙酰胆 碱溶液雾化2min， 每次雾化后记录6分钟内的Penh值。 0082 结果如图4所示， 哮喘模型组小鼠的Penh值明显高于阴性对照组； 与模型组相比， 鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷、 地塞米松治疗组Penh值明显降低， 地塞米松治疗组最为明显。 0083 实施例4： 鸟嘌呤核苷明显降低。

34、哮喘小鼠的肺部炎症因子表达 0084 本实施例使用ELISA试剂盒， 按照说明书要求对样品进行测定。 本实施例采用与实 施例1相同的方式建立哮喘动物模型。 第27天后， 检测各组小鼠肺组织中IL-4、 IL-6、 IL-13 的表达水平， 结果如图5所示， 哮喘小鼠和正常小鼠肺组织中IL-4、 IL-6、 IL-13的表达均有 说明书 5/10 页 8 CN 111840309 A 8 统计学意义(p0.05)， 鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷、 地塞米松治疗后IL-4、 IL-6、 IL-13水平明 显低于哮喘小鼠， 且均有统计学意义(p0.05)。 0085 实施例5： 鸟嘌呤核苷明显降低哮喘小。

35、鼠的OVA-IgE表达 0086 本实施例使用ELISA试剂盒， 按照说明书要求对样品进行测定。 本实施例采用与实 施例1相同的方式建立哮喘动物模型。 第27天后， 检测各组小鼠血浆中的OVA-IgE的表达水 平， 结果如图6所示， 与正常小鼠相比， 哮喘小鼠血浆中OVA-IgE水平明显升高(p0.05)； 与 哮喘小鼠相比， 尿嘧啶核苷治疗组OVA-IgE水平无明显差别， 但鸟嘌呤核苷及地塞米松治疗 组能明显降低OVA-IgE水平。 0087 实施例6： 鸟嘌呤核苷降低哮喘小鼠多种炎症介质的基因表达 0088 IL-6协同TGF- 通过JAK-STAT通路调节Th17细胞的分化， Th17细。

36、胞分泌的IL-17能 诱导气道上皮细胞分泌趋化因子Cxcl1、 Cxcl3、 Cxcl8， 这些趋化因子能招募中性粒细胞聚 集到炎症部位； IL-13能直接刺激气道上皮细胞黏液基因Muc5ac的表达， 促进粘液分泌， 粘 液高分泌是哮喘的病理特征之一， 也与气道高反应性相关。 因此本实施例通过实时荧光定 量PCR方法检测细胞因子IL-17， 粘液基因Muc5ac， 趋化因子Cxcl1、 Cxcl3的mRNA水平。 实时 定量荧光PCR的具体测试过程如下： 0089 按照实施例1的方法建立哮喘动物模型。 第27天， 取各组小鼠右侧肺组织在液氮中 研磨后， 按以下步骤提取肺组织总RNA。 0090。

37、 1)加1mL TRIzol,吹打混匀； 0091 2)加200 L氯仿， 剧烈摇晃15s， 室温静置3min； 0092 3)将2)中的液体在4， 12000g的离心力条件下离心10分钟， 吸取0.5mL上层含RNA 的水相于干净1.5mL EP管中， 加入1.5倍体积(即0.75mL)的75异丙醇， 涡旋混匀， 4静置 30min； 0093 4)将3)中的液体在4， 12000g条件下离心10分钟， 弃上清后加入1mL 75乙醇洗 涤， 涡旋混匀； 0094 5)将4)中的液体在4， 7500g条件下离心5min， 弃上清， 开盖静置5min(挥干乙 醇)； 0095 6)管中加40 L。

38、 DEPC水， 混匀后即得RNA。 0096 7)测RNA浓度。 0097 按以下步骤将RNA逆转录成cDNA： 0098 1)基因组DNA的去除： 在无酶的1.5mL ep管中加入0.7 g模板RNA、 4 L 4gDNA wiper Mix， 再加RNase-free ddH2O至16 L。 移液枪轻轻吹打混匀后在PCR仪中42加热 2min。 0099 2)逆转录： 在上一步的ep管中加入4 L的5HiScript II qRTSuperMix II， 用移 液枪轻轻吹打混匀， 在该条件下逆转录反应： 温度50下进行15min； 温度85下进行5s。 0100 按以下条件实时荧光定量PC。

39、R： 0101 1)反应体系(10 L)组成为： 0102 cDNA模板(7ng)2 L； 0103 SYBR mixture5 L； 0104 引物F(300nM)0.3 L； 说明书 6/10 页 9 CN 111840309 A 9 0105 引物R(300nM)0.3 L； 0106 DEPC水to10 L。 0107 2)反应程序： 0108 95反应3min； 0109 95反应15s后58.5(根据具体引物的Tm调整)反应1min， 该过程循环进行40次； 0110 58.5(根据具体引物的Tm调整)反应1min。 0111 3)熔解曲线程序： 0112 95进行15s； 011。

40、3 60进行1min； 0114 95进行1s。 0115 根据qPCR得到目的基因的Cq值， 以Rplp2为内参基因获得相应的Cq值， 以2- Cq 分析各组目的基因相对于对照组的相对表达倍数。 0116 结果如图7所示， 与阴性对照组相比， 哮喘模型组小鼠肺组织Cxcl1、 muc5ac、 IL-17 的mRNA水平明显升高(p0.05)； 而鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷、 地塞米松治疗组Cxcl1、 muc5ac、 IL-17的mRNA的表达水平对于哮喘模型组则明显下调(p0.05)。 0117 实施例7： 鸟嘌呤核苷抑制哮喘小鼠p38 MAPK的激活 0118 p38 MAPK在哮喘病理进。

41、程中起重要作用， 调节多种炎症相关的细胞功能， 导致气 道炎症和气道重塑， 因此有研究表明p38 MAPK抑制剂是治疗哮喘、 恢复糖皮质激素敏感性 的策略之一。 本实施例通过免疫组化检测肺组织p-p38 MAPK的表达情况， 用免疫印迹方法 检测肺组织p38 MAPK及p-p38 MAPK的表达情况。 0119 免疫组化测试的具体过程如下： 0120 按照实施例1的方法建立哮喘动物模型。 第27天， 进行气道高反应性检测后， 左侧 肺叶放入包埋框中， 4多聚甲醛固定， 常规脱水包埋， 4 m厚度切片， 然后按以下步骤进行 免疫组化实验： 0121 1)脱蜡及复水： 二甲苯浸泡10min， 更换。

42、新的二甲苯重复一次； 依次在100、 95、 80的乙醇中浸泡5min； 0122 2)抗原修复： 水浴加热0.01M的枸橼酸缓冲液至95左右， 放入切片， 加热15min， 室温冷却约30min； 0123 3)消除内源性过氧化物酶活性： PBS洗三次， 每次3min； 在3的H2O2(ddH2O稀释)溶 液中孵育10min； PBS洗3次， 每次3min； 0124 4)封闭： 5山羊血清(PBS稀释)封闭1h后甩掉多余血清； 0125 5)一抗孵育： 滴加稀释好的一抗(PBS稀释， 稀释比例1： 50)， 4过夜孵育后室温复 温30min， PBS洗三次， 每次3min； 0126 6)。

43、二抗孵育： 滴加二抗， 37下孵育1h， PBS洗三次， 每次3min； 0127 7)显色： 滴加DAB， 镜下观察染色程度， 掌握反应时间(约为5min)； ddH2O中清洗干 净； 0128 8)复染： 切片浸没于苏木素中复染2分钟， ddH2O冲洗干净； 在1HCl、 99乙醇溶 液中浸泡10s， 迅速用ddH2O冲洗干净； 0129 9)脱水： 80乙醇(I)30s、 95乙醇(I)1min、 95乙醇(II)1min、 100乙醇(I) 说明书 7/10 页 10 CN 111840309 A 10 1min、 100乙醇(II)1min 0130 10)透明： 二甲苯(I)3mi。

44、n， 二甲苯(II)3min 0131 11)封片： 滴加中性树胶， 盖上盖玻片后自然风干。 0132 免疫印迹测试的具体过程如下： 0133 按照实施例1的方法建立哮喘动物模型。 第27天， 进行组织蛋白的提取。 0134 (1)蛋白提取及浓度测定 0135 1)组织蛋白提取： 右侧肺组织在液氮中研磨至粉末， 收集于1.5mL离心管中， 加入 适量蛋白裂解液冰上裂解30min， 超声破碎2次， 每次2s， 间隔8s。 在4， 13000rpm条件下离 心10分钟， 收集上清液。 0136 2)蛋白浓度测定： 按50体积的BCA试剂A液加1体积的BCA试剂的B液配制BCA工作 液； 用PBS配。

45、制浓度为0、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4mg/ml的蛋白标准品， 并加到96孔 板中， 每孔20 L； 将样品稀释10倍， 即96孔板中每孔加2 L样品和18 L PBS； 每孔加200 L BCA工作液， 37孵育30分钟， 检测在562nm处的吸光度值。 0137 (2)蛋白印迹试验 0138 1)取上一步骤中离心后收集的上清液， 加入1/4体积的5Loading Buffer， 涡旋 混匀后在100金属浴中加热变性5min。 按后续步骤进行蛋白印迹试验。 0139 2)凝胶电泳： 将凝胶固定于电泳槽中， 加入电泳缓冲液， 缓慢拔出凝胶中的电泳 梳， 凝。

46、胶甬道中加入蛋白marker、 20 g蛋白样品， 浓缩胶80V恒压电泳30min， 分离胶以120V 恒压电泳至蓝色Loading Buffer到达凝胶底部。 0140 3)转膜： 将比凝胶略大的PVDF膜(孔径20 m)置于甲醇中活化2min， 按照海绵垫-滤 纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫的顺序安装转膜夹， 将转膜夹安装于转膜槽内(PVDF膜在正 极面， 胶在负极面)， 外槽放置生物冰盒， 转膜槽内加入足量的转膜液， 在冰水浴中恒流 300mA转膜60min。 0141 4)封闭： 用TBST将10快速封闭液稀释至1封闭液， 将PVDF膜置于封闭液中， 室 温摇床封闭10min。 0。

47、142 5)一抗孵育： 用碧云天一抗稀释液配置一抗工作液， 将封闭后的PVDF膜在TBST中 漂洗2次， 然后置于一抗工作液中， 4过夜孵育。 0143 6)二抗孵育： 用碧云天二抗稀释液配置二抗工作液， 将完成一抗孵育的PVDF膜用 TBST洗涤3次， 每次5min， 然后置于二抗工作液中， 室温摇床孵育1h。 0144 7)显影： 按1体积的ECL A液加1体积的ECL B液配置ECL工作液， 完成二抗孵育后， 将膜用TBST洗3次， 每次15min， 然后滴加ECL工作液后曝光。 0145 免疫组化结果如图8(上图： 放大200倍， scale bar50 m； 下图： 放大400倍， 。

48、scale bar20 m)所示， 与正常对照组相比， 哮喘模型组细支气管周围p-p38 MAPK表达水平明显 升高； 而鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷及地塞米松治疗组p-p38 MAPK表达水平明显比哮喘模型 组低。 这与免疫印迹实验结果一致如图9所示， 表明鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷、 地塞米松可以 抑制哮喘小鼠p-38MAPK的激活。 0146 实施例8： 鸟嘌呤核苷抑制哮喘小鼠NF- B通路及STAT3的激活 0147 NF- B是一种核转录因子， 受到激活后NF- B与I B 解离， 然后入核， 与转录启动子 结合， 调节多种炎症基因(如IL-1、 IL4、 TNF- 、 IL-13等)的表。

49、达， 与炎症细胞招募、 气道重塑 说明书 8/10 页 11 CN 111840309 A 11 等有关。 STAT3是一种转录因子， 能被多种细胞因子激活如IL-6， IL-6通过JAK/STAT3通路促 进IL-4表达及TH17细胞的分化， 从而产生更多的炎症介质， 加重炎症反应及气道高反应性。 本实施例按照实施例7所述的方法， 对NF- B通路关键分子及STAT3表达水平进行测试。 0148 结果如图10和图11所示， 与阴性对照组相比， 哮喘模型组小鼠肺组织p-I B 表达 增加， 进而活化NF- B， p-NF- B表达明显增加； 与哮喘模型组相比， 鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核 苷、 地。

50、塞米松治疗组p-I B 、 p-NF- B表达均明显降低。 哮喘模型组的p-STAT3表达上调， 鸟 嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷、 地塞米松治疗组p-STAT3表达下降， 其中鸟嘌呤核苷治疗组更为明 显。 0149 实施例9： 鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷降低THP-1源性巨噬细胞IL-6的生成 0150 本实施例通过如下方法进行实验： 0151 (1)THP-1细胞培养 0152 将THP-1细胞培养于含10FBS、 1青链霉素双抗、 0.05mM -巯基乙醇的RPMI 1640培养基中， 密切观察细胞状态。 当细胞密度生长至8090104cell/mL时， 将含细胞的 培养液收集于离心管中， 以条。